새로운 Netrin-1-유래 펩타이드는 신경 세포 사멸에 대한 보호를 강화하고 생쥐의 뇌내 출혈을 완화합니다 3부
Aug 19, 2024
식염수, TAT 또는 TE1(식염수에 용해됨) 처리 그룹을 마우스에게 ICH 2시간 후에 매일 5일 동안 동물당 총 부피 0.1mL를 복강내 주사로 투여했습니다. 펩티드는 12mg/kg의 용량으로 맹검 방식으로 제공되었습니다.
생리식염수는 일반적으로 사용되는 생리학적 완충제로 의학 및 생물학적 실험에 널리 사용됩니다. 하지만 알고 계셨나요? 생리식염수는 기억력도 향상시킬 수 있습니다!
우선, 생리식염수는 세포의 정상적인 기능에 중요한 역할을 합니다. 이는 정상적인 세포 삼투압을 유지하고 세포의 정상적인 형태와 기능을 유지할 수 있습니다. 뇌에서는 다수의 신경세포가 생리식염수를 기본 물질로 필요로 하며, 생리식염수를 보충하면 뇌세포의 정상적인 작동을 촉진하고, 뇌에 충분한 산소와 영양분을 공급하여 뇌를 더욱 건강하게 만들 수 있습니다.
둘째, 생리식염수는 뇌 뉴런 사이의 신호 전달을 촉진하고 뇌의 학습 능력을 향상시킬 수 있습니다. 연구에 따르면 과제 학습 과정에서 생리식염수를 주입하면 학습자의 학습 효과가 크게 향상되고, 학습자의 감정 상태가 개선되며, 학습 불안과 스트레스가 감소하는 것으로 나타났습니다. 동시에 생리식염수는 해마의 뉴런 수와 뉴런의 복잡성을 증가시켜 기억의 형성과 유지에 도움이 됩니다.
또한 생리식염수는 뇌의 대사 환경을 개선하고 손상, 병변, 허혈, 저산소증 등 뇌에 미치는 다양한 유해 영향을 줄일 수 있습니다. 이는 뇌에 상처를 줄 수 있는 요인들인데, 생리식염수를 주입하면 뇌의 대처능력을 강화하고 손상을 줄여 뇌의 기억력과 사고력을 향상시킬 수 있다.
일반적으로 식염수는 기억력 향상에 이상적인 물질입니다. 이는 뉴런의 수와 복잡성 증가, 대사 환경 강화, 뉴런 간 신호 전달 촉진 등 뇌에 여러 가지 긍정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 기억력을 향상해야 할 때 뇌를 더 잘 보호하고 지원하기 위해 식염수 주사를 고려하는 것이 좋습니다. 우리가 기억력을 향상시켜야 함을 알 수 있는데, 시스탄체는 기억력과 학습에 매우 중요한 아세틸콜린과 성장인자의 수치를 높이는 등 신경전달물질의 균형도 조절할 수 있기 때문에 기억력을 크게 향상시킬 수 있습니다. 또한 Cistanche는 혈류를 개선하고 산소 전달을 촉진하여 뇌가 충분한 영양과 에너지를 얻을 수 있도록 하여 뇌 활력과 지구력을 향상시킬 수 있습니다.
4.13. ICH의 콜라게나제 유도 마우스 모델
ICH를 유도하기 위해 콜라게나제 주입이 일반적으로 사용됩니다[60]. 수컷 C57BL/6 마우스(8~12주령)를 이소플루란(2~5%)으로 마취하고 정위 프레임에 배치했습니다.
절차가 진행되는 동안 각 동물의 체온은 항온 담요를 사용하여 37°C로 유지되었습니다. 정위 장비(Ruiwode Life ScienceCo., Ltd., Shenzhen, China)와 주사기(Hamilton Company, Reno, NV, USA)를 사용하여 0.3 µLof 콜라게나제(0.{{12 }}45 IU; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)를 권선조체(AP: +0.2 mm; ML: -2.3 mm; DV: -3.5 mm)에 다음의 유속으로 주입했습니다. 0.1μL/분
총 0.3 μL의 식염수를 대조 동물에 주입했습니다. 모든 수술 절차는 무균 조건에서 수행되었습니다. 본 연구에서는 66마리 이상의 수컷 생쥐가 사용되었으며, 각 실험 전에 동물을 무작위로 그룹에 할당했습니다[57].
4.14. 행동 분석
뇌혈종 형성 후 마우스의 신경학적 행동 분석은 접착 테이프 제거 테스트[61] 및 실린더 테스트[60]에 의해 검출되었습니다. 점착 테이프 제거 시험은 마우스의 각 앞발(오른쪽 및 왼쪽)의 화분 부위에 점착 테이프를 부착하여 수행되었습니다.
각 마우스를 새로운 케이지에 넣었습니다.
테이프를 붙인 시점부터 마우스가 테이프를 성공적으로 제거한 시점까지의 시간을 각 발에 대해 기록했습니다. 각 발에 최대 300초가 허용되었습니다. 실험 사이에 동물들은 병원균이 없는 시설의 우리에 갇혔습니다.
실린더 테스트는 2개의 거울과 카메라 앞의 투명한 아크릴 유리 실린더(직경: 8cm, 높이: 25cm)에 마우스를 5분간 배치하여 수행되었습니다. 카메라는 최적의 영상을 얻기 위해 2개의 거울과 원통 앞 중앙에 배치되었습니다.
독립적인 앞다리 사용을 평가하기 위해 (1) 완전 사육 동안 마우스가 한쪽 앞다리로 실린더 벽에 접촉하는 능력과 (2) 완전 사육 후 바닥에 한쪽 앞다리만으로 착지할 수 있는 마우스의 능력을 평가했습니다. 슬로우 모션을 사용하여 각 앞다리에 대해 최소 20개의 접촉점을 계산했습니다.
수술 전 기본 분석을 위해 실험 사이에 1시간의 휴식 시간을 두고 마우스당 두 번 테스트를 수행했습니다. 앞다리는 오른쪽과 왼쪽의 독립적 앞다리 사용 비율로 표현됩니다.
4.15. 혈종량 분석
치료가 혈종량을 감소시켰는지 확인하기 위해 ICH 5일 후 마우스를 희생시켰습니다. 뇌를 제거하고 10월에 급속 동결시켰습니다. 관상 단면을 30μm 두께로 썰어 유리 슬라이드 위에 직접 올려 놓았습니다. 혈종의 부피를 정량화하기 위해 섹션을 표준화된 관상 수준에서 디지털화했습니다.
눈이 먼 사용자가 각 섹션의 왼쪽 및 오른쪽 반구의 윤곽과 혈종을 측정했습니다. 혈종 부피와 부종은 ImageJ(NIH)를 사용하여 측정하고 계산했습니다.
그룹당 최소 5개의 뇌를 대상으로 혈종 측정을 실시하였고, 뇌 전체에서 혈종량을 측정하였다.
4.16. Fluoro-Jade C 염색
콜라게나제 유발 ICH 후 생쥐의 신경변성은 제조업체의 프로토콜에 따라 Fluoro-jade C Ready-to-Dilute 염색 키트(TR-100-FJT, Biosensis, Thebarton, Australia)를 사용하여 염색하여 평가했습니다[62].
간략하게, 대조군 마우스 및 ICH 마우스(±ip 펩티드)를 모델링 5일 후 희생시키고, 면역세포화학 실험에 사용된 프로토콜에 따라 뇌를 처리하였다.
부유 뇌절편을 1% 수산화나트륨 용액에 5분 동안 담그고, 70% 에탄올로 2분 동안 헹구고, 증류수로 2분 동안 헹구었습니다. 다음으로, 부유편을 0.06% 과망간산칼륨 용액(증류수 내 KMnO4)에 10분간 담갔다.
절편을 ddH2O로 세척한 후 0.0001% Fluoro-jade 염색 용액(Fluoro-jade C in 증류수)에 어두운 곳에서 가볍게 흔들면서 20분간 담갔습니다.
절편을 ddH2O로 세척하고 코팅된 슬라이드에 올려 놓고 암실에서 밤새 실온에서 건조시켰습니다. 혈액 주위 부위 내의 Fluoro-Jade C 염색은 Zeiss LSM 880 공초점 현미경을 사용하여 검사되었습니다. Fluoro-jade Cstaining의 정량은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다.
4.17. 조직 면역형광
일련의 30-μm 두께 섹션을 사용하여 조직 면역형광 염색을 수행했습니다. 섹션을 다음과 같은 일차 항체와 함께 배양했습니다: 마우스 항NeuN(1:500, Millipore, MAB377, Billerica, MA, USA) 또는 마우스 항-GFAP(1:200, SigmaAldrich, G3893, St Louis, MO, USA) 항체 ◦C 밤새. PBS로 세척한 후 절편을 Alexa Fluor 488-접합 당나귀 항마우스(1:1000; Invitrogen, A21202, Carlsbad, CA, USA) 항체와 함께 배양했습니다.
4.18. TUNEL 분석
말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소 매개 데옥시우리딘 삼인산(dUTP) 닉 엔드 라벨링(TUNEL) 분석을 사용하여 뇌 주변혈액 영역에서 핵 DNA 단편화가 있는 세포사멸 세포를 확인했습니다.
염색은 상용 1단계 TUNEL 세포사멸 분석 키트(Beyotime, C1090, Nanjing, China)를 사용하여 수행되었으며 제조업체의 지침에 따라 수행되었습니다. 조직 면역형광에 이어 TUNEL반응이 수행되었습니다.
뇌 절편을 TUNEL 반응 혼합물과 함께 배양한 후(37℃에서 1시간), 절편을 PBS로 세척하고 DAPI로 대비염색했습니다. NeuN-TUNEL 염색의 공동 위치화는 Zeiss LSM 880 공초점 현미경을 사용하여 검사되었습니다.
선조체 내부의 혈주위 영역에 있는 TUNEL 양성 뉴런(NeuN 양성)은 20X 대물렌즈에서 촬영한 마우스당 3개의 서로 다른 사진에서 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량화되었습니다. GFAP-TUNEL 염색의 공동 국소화는 NeuN-TUNEL 염색의 그것과 유사했습니다.
4.19. 생체 내 혈액-뇌 장벽 투과성 분석
생체 내에서 혈액뇌장벽 투과성 분석은 이전에 설명한 대로 수행되었습니다[63-65]. 간단히 말하면, 대조 마우스와 ICH 마우스(±ip 펩타이드)에 FITC 표지된 4 kDa 덱스트란(PBS 중 2mM 스톡 100μL, Sigma Aldrich,46944-100 MG-F, St Louis, MO, USA)을 복강내 주사했습니다. 5일 동안 모델링을 한 후 5분 후에 마취를 합니다.
추적자에 대한 순환 시간 10분 후, 경심관류를 위해 동물을 준비하고 심방천자 직후 흉강에서 약 300μl의 혈액을 수집한 후 PBS로 3분간 관류했습니다. 반뇌(후각엽, 소뇌 및 후뇌가 없음)와 단일 신장을 수집하여 즉시 액체 질소로 냉동하고 -80oC에 보관했습니다.
형광 측정을 위해 샘플을 해동하고 무게를 측정한 후 PBS(반뇌의 경우 400μL, 신장의 경우 600μL)에서 균질화한 후 4°C에서 20분간 15000×g로 원심분리했습니다.
상층액(100 µL)과 동량의 혈청(PBS에서 1/5 희석)을 96-웰 블랙플레이트에 넣고 해당 여기(490 nm)/방출(520 nm)에서 형광을 측정했습니다. )를 플레이트 리더기(Tecan, Männedorf, Switzerland)에 넣습니다. 자가형광 값을 빼기 위해 가짜 동물(추적 주사 없음)을 사용했습니다. 투과성 지수(mL/g)는 조직 RFU/g 조직 중량 대 혈청 RFU/mL 혈청의 비율로 계산되었습니다.
4.20. 형광 렉틴 염색
뇌 미세혈관을 시각화하기 위해 우리는 플루오레세인 결합 Lycopersicon esculentum 렉틴(1:200, Vector Laboratories, FL-1171, Burlingame, CA, USA)을 사용하여 1시간 동안 부유 섹션을 담갔습니다.
절편은 20× 대물렌즈 하에서 Zeiss LSM 880 공초점 현미경으로 이미지화되었으며, 이미지는 1.3 감마 설정으로 처리되었습니다. 동물 주변의 관상 뇌의 혈액 주위 영역에 있는 3개의 미리 지정된 영역에서 3개의 이미지를 촬영했습니다. 맹검 조사자가 각 뇌의 혈관 분기점을 정량화했습니다. 분기점은 뚜렷하고 별도의 혈관 트랙으로 눈에 띄게 분리되는 단일 플루오레세인 라벨 용기로 정의됩니다[66].
4.21. 통계분석
모든 실험 절차는 이전에 설명한 대로 맹검으로 수행되었으며 독립적으로 3회 수행되었습니다[67]. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. 통계 분석은 적절하게 GraphPad Prism v7(GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)을 사용하여 일원 분산 분석, 양방향 분산 분석 및 학생 테스트로 수행되었습니다. ) 및 SPSS 소프트웨어 버전 20.0(SPSS, Inc., Chicago, IL, USA).
통계 매개변수는 관련 그림 범례에서 찾을 수 있습니다. 통계적 유의성은 *p < {{0}}에서 설정되었습니다.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; **** p < 0.0001.]
5. 결론
Netrin-1의 EGF3 도메인은 Netrin-1과 DCC의 상호작용에 중요하며 다양한 신호 경로를 활성화할 수 있습니다. Netrin-1(잔기 407-422)의 절단된 펩타이드 E1은 DCC와 상호작용하여 헤민 유발 독성으로부터 뉴런을 보호합니다.
펩타이드 E1의 적용은 ICH의 실험 모델에서 기능 회복을 향상시킵니다. 또한, 펩타이드 E1은 ICH 후 퇴행 및 세포사멸로부터 뉴런을 보호할 수 있습니다.
저자 기여: 개념화, LL, Z.-XH 및 X.-JZ; 방법론, LL, K.-JL 및 J.-BC; 검증 H.-LY 및 X.-XH; 조사, X.-JZ; 데이터 큐레이션, JY; 자원 LL 및 Z.-XH; LL, Z.-XH 및 X.-JZ 작성; 감독, Z.-XH, X.-JZ; 자금 조달, Z.-XHand X.-JZ 모든 저자는 출판된 원고 버전을 읽고 동의했습니다.
자금: 이 연구는 중국 국립자연과학재단(31671065 및 32071018), 길림성 과학기술발전계획(202520YY01017404)의 자금 지원을 받았습니다.
기관 검토 위원회 성명서: 모든 절차는 북동사범대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회(NENU/IACUC, AP2016200299)의 승인을 받았습니다. 동물 복지의 윤리적 검토를 위한 실험 동물 지침인 중화인민공화국 국가 표준(GB/T 35892-2018)은 당사의 동물 관리 및 프로토콜에 대한 지침이었습니다.
사전 동의서: 해당 사항 없음.
감사의 글: 이 연구는 중국국가자연과학재단(31671065 및 32071018)과 길림성 과학기술발전계획(202520YY01017404)의 지원을 받았습니다.
이해 상충: 저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다. 자금 제공자는 연구 설계에 아무런 역할을 하지 않았습니다. 데이터 수집, 분석 또는 해석에서 원고를 작성하거나 결과를 출판하기로 결정하는 경우.
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