Farnesyltransferase 억제제 LNK-754는 축색 이영양증을 약화시키고 생쥐의 아밀로이드 병리를 감소시킵니다 1부
Sep 26, 2023
추상적인
배경:
아밀로이드 플라크 침착 및 축삭 변성은 AD 병인의 초기 사건입니다. A는 시냅스전 이영양성 신경돌기의 미세소관을 파괴하여 손상된 내분비소체 및 자가포식 소기관 운반 부위 아밀로이드 전구체 단백질 절단 효소(BACE1)가 축적됩니다. 결과적으로 영양이영양성 신경돌기는 A42를 생성하고 플라크 침착에 크게 기여합니다.
축삭 변성은 뉴런의 축삭에 손상을 주어 신경 전도에 영향을 미치는 신경 장애입니다. 면역력은 인체가 외부 세균과 바이러스의 침입에 저항하기 위한 중요한 방어선입니다. 그렇다면 축삭 변성과 면역 사이에는 관계가 있습니까?
첫째, 축삭변성은 면역 체계에 의해 발생하는 질병이 아니므로 면역력에 부정적인 영향을 미칠까 걱정할 필요가 없습니다. 축삭 변성의 구체적인 원인은 알려져 있지 않지만 일부 연구에서는 축삭 변성이 면역 체계의 염증 반응과 관련이 있을 수 있다고 제안합니다. 염증 반응은 외부 병원체의 침입에 대한 면역 체계의 보호 메커니즘입니다. 그러나 과도하게 활성화되면 뉴런에 염증성 손상을 일으키고 축삭 변성을 촉진합니다.
둘째, 강력한 면역 체계는 신체의 저항력을 향상시키고 감염 및 질병의 위험을 줄일 수 있으며 이는 축삭 변성 환자에게 특히 중요합니다. 축삭 변성 환자의 신경계가 손상되었기 때문에 신체의 자가 회복 능력이 상대적으로 약합니다. 다른 질병을 앓고 있다면 상태가 더욱 악화되어 삶의 질에 더욱 영향을 미치게 됩니다. 그러므로 건강한 식습관과 생활습관을 유지하고 면역력을 높이면 다른 질병의 위험을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다. 동시에 신체의 면역 반응을 개선하고 축삭 복구와 신경 전도 회복을 촉진할 수 있습니다.
요약하면, 축삭 변성과 면역 사이에 필수적인 연관성은 없지만, 건강한 면역 체계는 축삭 변성이 있는 환자에게 필요한 보호와 지원을 제공할 수 있습니다. 그러므로 우리는 식습관, 생활습관 등의 측면에서 면역체계를 유지하는 것의 중요성에 주목하고, 적극적으로 신체의 면역력을 향상시켜 건강과 장수의 기초를 다져야 합니다. 기억력 향상이 필요함을 알 수 있는데, 시스탄체 데저티콜라는 기억력 향상이라는 독특한 효능이 많은 중국 전통 약재이기 때문에 기억력을 크게 향상시킬 수 있습니다. 다진 고기의 효능은 산, 다당류, 플라보노이드 등 포함된 다양한 활성 성분에서 비롯됩니다. 이러한 성분은 다양한 방식으로 뇌 건강을 증진할 수 있습니다.
파네실트랜스퍼라제 억제제(FTI)는 신경퇴행성 장애 치료 방향으로 재배치하고 리소좀 기능 및 미세소관 안정성에 관여하는 단백질을 조절하는 번역 후 변형인 파네실화를 촉매하는 파네실트랜스퍼라제(FTase)의 작용을 차단하는 것으로 최근 연구되었습니다. 사후 AD 뇌에서는 FTase와 그 하류 신호 전달이 상향 조절됩니다. 그러나 FTI가 아밀로이드 병리 및 영양 장애 신경돌기에 미치는 영향은 알려져 있지 않습니다.
행동 양식:
우리는 아밀로이드 병리학의 5XFAD 마우스 모델에서 FTIR LNK-754 및 lonafarnib의 효과를 테스트했습니다.
결과:
3개월 동안 만성적으로 치료한 2-개월령 5XFAD 쥐에서 LNK-754는 아밀로이드 플라크 부담과 타우 과인산화를 감소시키고 영양 장애 신경돌기에서 BACE1과 LAMP1의 축적을 약화시켰습니다. 5-개월 된 5XFAD 생쥐에서 3주 동안 급성 치료를 받은 경우 LNK-754는 A 침착물에 영향을 주지 않으면서 이영양성 신경돌기 크기와 LysoTracker-Green 축적을 감소시켰습니다. LNK-754를 사용한 급성 치료는 hAPP/PS1 아밀로이드 마우스의 기억력 및 학습 결핍을 개선했습니다.
LNK-754와 대조적으로, lonafarnib 치료는 플라크, 타우 과인산화 및 영양이영양성 신경돌기를 감소시키는 데 덜 효과적이었습니다. 이는 LNK-754에 비해 FTase에 대한 효능이 감소했기 때문일 수 있습니다. 우리는 endolysosomal 세포 소기관의 축삭 수송에 대한 FTI의 영향을 조사한 결과 lonafarnib과 LNK-754가 1차 뉴런에서 역행 축삭 수송을 향상시키는 것을 발견했습니다. 이는 FTI가 축삭 후기 엔도솜을 리소좀으로 성숙시키는 것을 지원할 수 있음을 나타냅니다. 더욱이, FTI 처리는 마우스의 일차 뉴런과 5XFAD 마우스의 뇌에서 LAMP1의 수준을 증가시켰는데, 이는 FTI가 엔도리소좀 세포 소기관의 생합성을 자극한다는 것을 입증했습니다.
결론:
우리는 LNK-754가 축삭 이영양증 감소, BACE1 축적 감소 및 5XFAD 마우스에서 아밀로이드 침착 억제를 가정하는 축삭 이동 및 엔도리소좀 구획의 기능을 촉진한다는 것을 시사하는 새로운 데이터를 보여줍니다. 우리의 결과는 FTase가 단백질병증 치료를 위한 치료 표적으로 확인된 이전 연구와 일치하며 AD 치료에 중요한 치료적 영향을 미칠 수 있습니다.
키워드:
알츠하이머병, 영양이영양성 신경돌기, 파네실트랜스퍼라제 억제제.
배경
알츠하이머병(AD)은 노인 인구에서 치매의 가장 흔한 원인이며 학습 및 기억의 심각한 장애를 특징으로 하는 진행성 신경퇴행성 질환입니다. 분자 수준에서 AD 뇌의 특징적인 특징은 아밀로이드-(A) 플라크의 축적과 과인산화된 타우 함유물의 존재입니다.
AD의 초기 무증상 단계에서 A는 기억 장애가 시작되기 전 20년 이상 동안 뇌에 축적됩니다[1-3]. 결과적으로, 뇌 A 수준을 감소시키는 것이 AD 치료 전략의 중심 초점이었습니다[4]. 현재 FDA가 조건부로 승인한 유일한 질병 수정 치료법은 뇌에서 A의 응집된 형태를 제거하는 항-A 항체입니다[5]. 이는 뇌에서 A를 표적으로 삼는 것이 AD 치료에 대한 유망한 접근법임을 확인시켜 줍니다.
그러나 A에 초점을 맞춘 대부분의 임상시험은 안전성이나 효능 문제로 인해 실패했으며, 이제는 타우 전파, 염증, 칼슘 항상성 장애 및 신경혈관 요인을 포함하여 AD의 다양한 가설을 기반으로 한 목표에 중점을 두었습니다 [4, 6, 7 ]. 또한, 신경퇴행성 질환 전반에 걸쳐 공통적으로 나타나는 특징인 병원성 단백질을 감소시키는 방법으로서 리소좀 분해 경로를 활성화하는 치료 가능성에 대한 관심이 커지고 있습니다[8-12].
endolysosomal 및 autophagic 경로의 광범위한 기능 장애는 AD 병인의 초기 사건으로 잘 문서화되어 있습니다. 많은 AD 감수성 유전자좌는 세포하 엔도리소좀 수송 및 리소좀 기능과 연결되어 있으며[13], 확대된 기능 장애성 엔도리소좀 및 자가포식 소기관은 영양 장애 신경돌기 내의 AD 뇌에 축적됩니다[14, 15].
영양 장애 신경돌기는 신경 손상 시 시작되는 것으로 보이며, AD에서는 이것이 A에 의한 미세소관의 불안정화로 제안됩니다[16]. 이로 인해 BACE1을 포함하여 A 생산에 관여하는 주요 단백질의 정상적인 이동 및 분해 경로를 방해하는 국소 축삭 부기가 발생합니다[16, 17]. 결과적으로 이영양증은 A42를 생성하고 세포외 플라크 침착 및 축삭 이영양증에 크게 기여하여[18] 피드포워드 경로를 시작하여 시냅스 손실, 신경변성 및 인지 장애를 초래합니다[16].
엔도리소좀 및 자가포식 소기관의 수송 및 활동을 개선하는 치료 전략은 신경염 영양 장애를 예방하고 병원성 단백질의 분해를 지속할 수 있으며 AD에서 BACE1 및 A 수준을 감소시키는 중요한 메커니즘이 될 수 있습니다.
효과적인 AD 치료법에 대한 연구가 계속됨에 따라, 임상적으로 평가된 약물의 안전성과 유효성 문제가 알려져 약물 개발 과정이 가속화됨에 따라 AD에 대한 임상 시험에서 용도 변경된 약물의 수가 크게 늘어났습니다[7, 19]. 최근 몇 년간 연구에서는 FTI가 신경퇴행성 질환 치료를 위해 용도 변경될 가능성이 있는 약물 계열로 확인되었습니다.
FTI는 CAAX 모티프를 포함하는 단백질의 시스테인 잔기로 파르네실 피로포스페이트가 공유결합으로 변형되는 단백질을 조절하는 번역 후 변형인 파르네실화를 억제합니다[20]. FTI는 처음에 프레닐화를 억제하여 발암성 Ras 활성을 차단하도록 설계되었지만 대체 Ras 프레닐화 경로가 발견된 후 암 치료에 대한 임상 시험에서 중단되었습니다[21, 22].
그러나 많은 FTase 기질이 존재하여[23-25] 심혈관 질환, D형 간염 및 조로증을 비롯한 광범위한 장애에 대한 FTI를 평가합니다[20, 26]. 또한, FTI는 단백질 응집체의 축적을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환에 대한 가능성을 보여주었습니다. 단백질병증의 설치류 및 세포 배양 모델에서 FTI는 리소좀 활성과 질병 특이적 독성 단백질의 단백질 분해를 유도합니다[8, 9, 27, 28].
이전에 우리는 암 실험에서 테스트된 FTI인 LNK-754가 파킨슨병(PD) 환자 유래 뉴런과 PD 마우스 모델에서 리소좀 가수분해효소 수송을 강화하고 알파-시누클레인(-synuclein) 응집체를 감소시키는 것을 보여주었습니다[8 ].
다른 연구에서는 단백질 응집체 감소에 대한 FTI의 유사한 결과를 보고했습니다. FTI-277 감소된 -시누클레인[28] 및 조로증 치료를 위한 FDA 승인 FTI인 lonafarnib을 사용하여 PD의 세포 배양 모델을 치료[29], 타우병증 마우스 모델에서 리소좀 활성 증가 및 타우 포함 감소 [ 9]. 더욱이, 최근 연구에서는 AD의 APP/PS1 마우스 모델에서 뉴런 FTase의 유전적 녹아웃이 A 세대를 예방하는 것으로 나타났습니다[30]. 단백질병증에 대한 FTI를 평가하는 과거 연구의 초점은 리소좀 활성 및 자가포식에서 FTase 기질의 역할이었습니다.
그러나 FTI는 또한 미세소관(MT) 안정성을 촉진하고 MT 안정화 약물과 시너지 효과를 발휘하여 Ras 독립적인 경로를 통해 튜불린 아세틸화를 향상시키는 것으로 알려져 있습니다[31-33]. MT 안정화는 APP/PS1 마우스에서 AD 병리를 억제하며[34], 현재 여러 MT 안정화제가 AD 치료를 위해 임상적으로 조사되고 있습니다[35]. 따라서 FTI가 AD와 같은 단백질 항상성 메커니즘의 기능 장애를 특징으로 하는 질병에 도움이 될 수 있다는 실질적인 증거가 있습니다. 그러나 신경퇴행성 질환에서 단백질 파네실화와 단백질 응집체 감소를 연결하는 표적과 경로는 완전히 이해되지 않았습니다.
본 연구에서 우리는 FTI를 이용한 약리학적 치료가 A-관련 AD 병리를 개선할 수 있는지 여부를 평가했습니다. 우리는 아밀로이드 병리학의 5XFAD 마우스 모델에서 신경퇴행성 질환의 단백질 응집체를 감소시키는 것으로 알려진 두 가지 FTI인 LNK-754 및 lonafarnib가 플라크 부담 및 영양 장애 신경돌기에 미치는 영향을 평가했습니다. 우리의 결과는 FTase 억제에 의해 영향을 받는 경로에 대한 통찰력을 제공하고 FTI를 AD 및 단백질 응집 축적을 특징으로 하는 기타 신경퇴행성 질환의 치료제로 용도 변경하는 것에 대한 추가 조사를 강력하게 뒷받침합니다.
재료 및 방법
동물 및 약물 치료
모든 동물 연구는 노스웨스턴 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC) 승인에 의해 수행되었습니다. 마우스에게 표준 설치류 사료와 물을 자유롭게 먹이고 표준 12-시간 명암 주기에 따라 사육했습니다. C57BL6 배경의 5XFAD 마우스(Jackson Laboratories)는 이식유전자 양성 반접합 수컷 C57BL6 마우스와 이식유전자 음성 암컷 C57BL6 마우스(Jackson Laboratories)를 교배하여 유지되었습니다.
우리의 만성 치료 프로토콜에서 약물 치료는 플라크 침착이 시작되는 2개월령에 시작되었습니다[36, 37]. 급성 치료 프로토콜에서는 약물 치료를 생후 5개월에 시작했으며 그 이후에는 플라크 침착과 축삭 변성이 널리 퍼졌습니다 [38, 39].
LNK{{0}}는 Link Medicine(미국 매사추세츠)에서 합성되었으며 lonafarnib은 Cayman Chemical Company(Ann Harbor, MI)에서 구입했습니다. 동물 처리를 위해, LNK-745 및 lonafarnib를 비히클로서 0.5% 카르복시메틸셀룰로오스(Sigma-Aldrich)의 가열된 용액에서 용해될 때까지 0.10mg/mL의 농도로 제조하고 용액을 분명한.
주사용 분취량은 -20도에서 냉동한 후 매주 치료 동안 해동하여 4도에서 보관했습니다. 리소좀 활성을 향상시키는 것으로 알려진 확립된 프로토콜에 따라 마우스를 치료했습니다[8]. 만성 치료 프로토콜에서, 2-개월령 5XFAD 마우스에게 마우스가 5세가 될 때까지 12주 동안 매일 29-게이지 인슐린 주사기를 사용하여 운반체, LNK754 또는 lonafarnib을 복강내(ip) 주사로 주입했습니다. 개월. 급성 치료 요법에서는 5-개월 된 5XFAD 마우스를 3주 동안 매일 주사했습니다.
치료가 완료되면 마우스를 마취하고 관류하고 추가 분석을 위해 뇌를 수집했습니다(아래 섹션 참조). 세포 배양 실험을 위해 LNK-754 및 lonafarnib를 DMSO에 용해시키고 48시간 동안 10nM 농도로 마우스 1차 뉴런 배양물에 첨가했습니다. 비히클 처리는 동등한 양의 DMSO였습니다. 아래에 설명된 대로 세포를 수집하고 분석했습니다.
항체
면역형광 실험에 사용된 항체는 쥐 항-LAMP1(#1D4B, DSHB), 토끼 항-A 42(#700254, Invitrogen), 토끼 항-BACE1(#ab108394, Abcam), 토끼 항-III 튜불린(#ab18207, 앱캠). 면역블로팅에 사용된 항체는 토끼 항액틴(#926–42,210, LI-COR), 토끼 항p44/42 MAPK(pErk1/2)(#CS9101, Cell Signaling Technology), 토끼 항-44/42 (Erk1/2)(#CS137F5, Cell Signaling Technology), 토끼 항-LAMP1(#CS3234, Cell Signaling Technology), 마우스 항-BACE(3D5; Zhao et al., 2007), 마우스 항-APP(6E10)( #803001, BioLegend), 토끼 항-p-tau(ser404)(#CS20194, Cell Signaling Technology), 마우스 항-Tau1(#MAB3420, Millipore Sigma), prelamin-A,(#MABPT858, Millipore Sigma) 및 마우스 항 -HDJ-2 (#sc-59,554, 산타 크루즈). Vector Laboratories의 항토끼 또는 마우스 2차 항체를 면역블롯에 사용했습니다.
행동 테스트
동물 및 약물 치료
행동 분석은 인간 프레세닐린 1의 임상 돌연변이와 함께 인간 아밀로이드 전구체 단백질의 임상 돌연변이의 뉴런 특이적 발현을 갖는 hAPP/PS1 마우스 모델을 사용하여 reMYND, Inc.에 의해 수행되었습니다[4{15}}]. 이 이중 형질전환 마우스는 뇌에 A가 자발적이고 점진적으로 축적되어 결국 6개월령에 해마하층, 해마 및 피질 내에 아밀로이드 플라크가 생성됩니다. FVB x C57Bl/6J 배경의 6개월령 암컷 hAPP/PS1 마우스 48마리를 FVB x C57Bl/6J 배경의 연령 일치 암컷 야생형 대조군 12마리와 함께 이 연구에 사용했습니다. LNK-754 0.9mg/kg/일을 경구 위관 영양법으로 12일 동안 1일 1회 투여했습니다. 동물의 희생은 최종 투여 2시간 후에 수행되었습니다.
모든 생쥐는 3주령에 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 유전자형을 분석했고, 일단 PCR 결과가 알려지면 고유한 식별 번호를 받았습니다. 연구가 시작되기 전에 모든 쥐를 두 번째 PCR로 다시 확인했습니다. 모든 생쥐는 무작위로 무작위 배정되었으며 연령이 일치했습니다. 마우스에게 컴퓨터를 통해 무작위 번호를 부여하고 무작위로 치료에 할당했습니다. 동물들이 새로운 케이지 환경에 익숙해질 수 있도록 연구 시작 15일 전에 치료 그룹에 의해 동물을 다시 케이지에 가두었습니다. 마우스는 사전 여과되고 멸균된 물과 표준 마우스 먹이(Snif® Ms-H, Snif Spezialdiäten GmbH, Soest, Germany)를 자유롭게 이용할 수 있었습니다. 식품은 통풍이 잘 되는 보관실에서 건조하고 시원한 상태로 보관되었습니다. 물과 음식의 양은 매일 확인하여 필요할 때 공급하고 일주일에 한 번 기준을 새로 고쳤습니다. 마우스를 처음에는 표준 금속 케이지 유형 RVS T2(면적 540 cm2)에서 오후 7시부터 역전된 낮-밤 리듬(14시간 빛/10시간 어둠)으로 사육했습니다.
케이지에는 단단한 바닥과 깔개 깔짚이 깔려 있습니다. 케이지 당 생쥐의 수는 동물 복지에 관한 현지 법률에 의해 제한되었습니다. 치료 시작 15일 전, 마우스를 개별 환기형 마크로론 T2 케이지에 다시 가두어 치료 준비를 위해 실험실 환경에 적응시키기 위해 실험실로 운반했습니다. 연구실에서는 오후 7시부터 낮과 밤의 리듬을 12시간 밝음/12시간 어두움으로 변경했습니다.
모리스 물 미로
Morris Water Maze는 치료 8~12일에 수행되었으며, 프로브 테스트 직후 동물을 희생시켰습니다. 수영장(직경 1m의 흰색 원형 용기)에는 탈출 플랫폼(수위 아래 1cm)을 숨기기 위해 무취, 무독성 첨가제인 이산화티타늄과 함께 20도의 물이 들어 있었습니다. 각 마우스의 수영을 비디오 녹화하고 분석했습니다(Ethovision, Noldus Information Technology, Wageningen, 네덜란드). 훈련 전에 각 마우스를 플랫폼 위에 15초 동안 올려 놓았습니다. 장소 탐색 테스트를 위해 생쥐는 연속 4일에 걸쳐 3회 시도의 7개 블록에서 숨겨진 플랫폼을 찾도록 훈련되었습니다.
각 시험은 최대 120초의 강제 수영 테스트와 10분의 휴식으로 구성됩니다. 각 마우스가 플랫폼을 찾는 데 필요한 시간을 측정했습니다. 7개의 연속 블록으로 인해 학습 곡선이 생성됩니다. 마지막 훈련 24시간 후, 각 동물은 플랫폼을 제거한 상태에서 탐침 시험을 실시했습니다. 마우스가 60초 동안 검색하도록 허용하고 사분면 검색 시간과 원래 플랫폼 위치의 교차를 측정했습니다. 최종 프로브 테스트 동안 쥐는 플랫폼을 제거한 후 60초 동안 플랫폼의 이전 위치를 검색할 수 있었습니다.
일차 뉴런 배양
E15.5의 임신한 야생형 C57BL6 마우스(Jackson)의 Hanks' Balanced Salt 용액(HBSS)(Thermo Fisher #14185-052)에서 전뇌를 해부하여 1차 뉴런을 얻었습니다. 해부된 전뇌를 2.5% 트립신에서 37도에서 20분 동안 소화시켰습니다. HBSS의 뉴런을 분리하기 위해 불로 연마된 파스퇴르 피펫을 사용했습니다. 그런 다음 뉴런을 2% B-27, 500μM 글루타민, 10% 말 혈청 및 2.5μM이 보충된 신경기초 배지에 웰당 2×106개의 뉴런으로 폴리-L-라이신 코팅된 6웰 플레이트에 플레이팅했습니다. 글루타메이트(모두 Thermo Fisher 제품).
2시간 후에 배지를 2% B-27, 500μM 글루타민 및 2.5μM 글루타메이트가 포함된 Neurobasal로 교체했습니다. 24시간 후, 배지를 Neurobasal + 2% B-27 및 500μM 글루타민으로 변경했습니다. 미디어의 절반은 2~3일마다 변경되었습니다. 1차 뉴런을 7일 동안 배양하고 비히클(DMSO) 또는 10nM 농도의 LNK-754 또는 lonafarnib로 48시간 동안 처리했습니다. 그런 다음 뉴런을 아래 설명된 대로 고정하거나 실시간 영상으로 촬영했습니다.
고정을 위해 뉴런을 4% 파라포름알데히드, 1XPBS의 0.12M 수크로스에서 20분 동안 배양하고, 0.5% Triton X-100에서 투과화한 다음 1차 항체와 밤새 배양한 후 다음과 같이 배양했습니다. 당나귀 항-마우스 Alexafuor-결합 2차 항체(Molecular Probes, 1:1000) 및 300nM DAPI로 공동 염색되었습니다. Prolong Gold(Molecular Probes)를 사용하여 Coverslip을 장착하고 60X 대물렌즈(NA 1.4) 및 NIS Elements 소프트웨어를 갖춘 Nikon A1 공초점 현미경으로 이미지를 획득했습니다.
뉴런의 라이브 이미징
실시간 영상 실험을 위해 뉴런을 위와 같이 준비하고 35mm 유리 바닥 접시(MatTek # P35G-1.5-14C)에 7일 동안 배양했습니다. 그런 다음 10nM LNK-754 또는 lonafarnib를 조절 배지에 첨가하고 대조 배양물을 DMSO를 매개체로 처리했습니다. 처리 48시간 후, 배지를 처리되지 않은 평행 뉴런 플레이트의 조정 배지로 교체했습니다. 25nM의 LysoTracker-Green DND{11}}(#L7526, Invitrogen)를 조정된 배지에 첨가하고 뉴런을 37도에서 30분간 배양했습니다.
Ti2 광시야 현미경을 사용하여 뉴런의 저속 촬영 이미징을 수행했습니다. 이미징은 30분에 즉시 시작되어 30분 이상 지속되지 않았습니다. 1-의 노출은 1분마다 이루어졌으며 접시당 20~30개의 개별 영역이 30분 이내에 이미지화되었습니다. LysoTracker 입자의 거리 및 속도 정량화 및 kymograph 분석은 NIS Elements 소프트웨어를 사용하여 수행되었으며 아래에 자세히 설명되어 있습니다. 별도의 실험에서는 1μM Lysosensor-Green DND-189(#L7535, Invitrogen)를 조정된 배지에 추가하고 60X 대물렌즈가 장착된 Nikon A1 공초점 현미경을 사용하여 살아있는 뉴런의 캡처 이미지를 15분 이내에 촬영했습니다. (NA 1.4) 및 NIS Elements 소프트웨어.
For more information:1950477648nn@gmail.com
