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Fisetin은 대식세포에서 지질다당류로 인한 염증 반응을 약화시킵니다

Mar 21, 2022

자세한 내용은 다음으로 문의하십시오.tina.xiang@wecistanche.com

여러 연구에서 인체 건강에 대한 폴리페놀의 효능과 안전성이 보고되었습니다. 그러나 그 효능에 대한 검증은 여전히 ​​불충분하다. 이 연구의 목적은 과일과 채소에 널리 존재하는 플라보노이드 중 하나인 fisetin이 LPS-유도된 지질다당류를 억제할 수 있는지 여부를 조사하는 것이었습니다.염증성대식세포의 반응. LPS는 전염증성 mRNA 풍부도(MCP 1, IL{1}}ß 및 iNOS)를 증가시켰지만 fisetin에 의해 억제되었습니다. 산화 스트레스 요인인 LPS에 의한 산화질소 증가는 fisetin에 의해 약화되었습니다. 또한, mitogen-activated protein kinase(ERK 및 JNK)의 LPS 강화 인산화가 감소되었습니다. 마지막으로 fisetin은 대식세포 모집 또는 침윤의 관련 인자로 알려진 uPA, uPA AR, MMP-2 및 MMP{5}}의 발현 또는 활성을 약화시켰습니다. 결론적으로,피세틴패혈증 및 죽상 동맥 경화증과 같은 대 식세포 관련 염증 질환에 대한 유망한 치료제입니다.

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1. 소개

천연 성분의 치료적 사용은 지난 20년 동안 더 많은 관심을 받았습니다. FDA 승인 치료제의 40%는 뛰어난 효능과 낮은 독성으로 인해 천연 유래 성분 또는 그 유도체이다[1]. 다른 약물과 관련된 독성은 다른 천연 제품에 의해 성공적으로 예방되었습니다[2]. 따라서 식물 유래 천연 화합물을 더 많이 탐구하는 것이 매우 중요하고 중요합니다.

폴리페놀식물 2차 대사 산물이며 식물 기원의 식품 및 음료, 과일, 야채, 향신료, 차 및 와인에 널리 존재합니다. 필수 미량 영양소로 간주되지는 않지만 여러 종류의 문헌에서 인간 건강, 특히 과일과 채소의 과다 섭취와 관련된 식단에서 유익한 효과를 나타냅니다[{0}}]. 폴리페놀의 약리학적 효과에 대한 조사가 수십 년에 걸쳐 수행되어 건강에 대한 이점을 시사하는 수많은 연구가 수행되었습니다. 일부 폴리페놀이 가지고 있다는 증거가 늘어나고 있습니다.항염증속성

[6-8]. 또한 최근 연구에서는 여러 종류의 폴리페놀이 염증과 관련된 조절 효소 또는 전사 인자를 억제할 수 있음을 보여주었습니다[9].

식이는 염증의 여러 단계에 영향을 미치며 여러 염증성 질환에 중요한 영향을 미칩니다[10,11]. 염증은 당뇨병, 천식, 심혈관 질환 및 암과 같은 질병의 발병에 중요한 역할을 합니다[12]. 따라서 염증을 조절하면 이러한 질병을 예방할 수 있습니다. 대식세포는 염증의 주요 매개체이기 때문에 조직 항상성과 염증에 다양한 기능을 합니다. 따라서 대식세포의 비정상적인 활성화가 해로운 면역 반응을 유발할 수 있기 때문에 기능을 효과적으로 조절하는 약제는 임상적으로 매우 중요합니다. 현재의 연구 경향은 천연물이 신약의 가장 중요한 원천 중 하나임을 분명히 나타냅니다[13].

폴리페놀 중 하나인 이세틴(3,3',4',7-테트라히드록시플라본)은 딸기, 사과, 토마토, 양파, 오렌지, 복숭아, 포도, 키위, 감, 차, 와인에 풍부하게 함유되어 있습니다. [14] . 지금까지 fisetin은 강력한 항염증제[15-17]를 보고했습니다.

세포 배양과 인간 질병과 관련된 동물 모델 모두에서 항산화제[18], 항종양형성[19,20], 항혈관신생[21], 항당뇨병[22], 신경보호[23] 및 심장보호 효과[24]가 있습니다. 피세틴은 많은 생리학적 효과가 있지만 대식세포에 미치는 영향은 많이 보고되지 않았습니다.

현재의 연구에서 우리는 피세틴이지질다당류(LPS).

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2. 재료 및 방법

2.1. 상주 복막 대식세포의 분리.

BALB/c 마우스는 도쿄 대학 의학 연구소에서 입수했으며 오카야마 대학 동물 자원 센터에서 관리하고 있습니다. 모든 동물 실험은 NIH 지침(실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 지침)을 준수하도록 수행되었습니다. 실험 프로토콜은 오카야마 대학 의과, 치의학 및 약학 대학원의 동물 실험을 위한 윤리 검토 위원회(OKU-2018449)의 승인을 받았습니다. 모든 마우스는 차단 시설에서 유지되었고 정상적인 실험실 식단을 먹였습니다. 16±4주령의 수컷 및 암컷 BALB/c 마우스를 이소플루란으로 마취하고 경추 탈구를 통해 안락사시켰다. 식염수(5mL)를 사용하여 복막 세척을 통해 대식세포를 수확했습니다. 복막 세척액을 1500rpm에서 5분간 원심분리하였다. 침전물을 약간의 DMEM(SIGMA, Cat. No.D6046)에 현탁시켰다. 적혈구는 염화암모늄 용액을 사용하여 용해되었습니다. 대식세포의 수를 혈구계산기를 사용하여 계산한 다음 열불활성화 FBS(10% vv), 페니실린(10U/mL) 및 스트렙토마이신(10mg/mL)이 포함된 DMEM에 재현탁하고 {{11}well 플레이트(Corning Incorporated, 카탈로그 번호 3516) [25,26].

2.2. 세포 배양 조건.

밤새 혈청 기아 후 대식세포를 선택된 농도의 피세틴(10, 30 및 100μM; 시그마, 고양이. F4043) 또는 비히클을 3시간 동안 첨가하고 LPS(10ng/mL; SIGMA, Cat. No.L4391)의 존재 또는 부재하에 적절한 시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 배지와 세포를 수집했습니다. 배지는 산화질소(NO) 분석 및 젤라틴 자이모그래피에 사용되었습니다. 세포 용해물을 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 및 웨스턴 블롯팅에 사용했습니다.

2.3. 실시간 중합효소 연쇄 반응.

RNeasy Mini Kits(QIAGEN, Cat. No.74104)를 이용하여 대식세포에서 mRNA를 추출하였다. iScript cDNA Synthesis Kit(Bio-Rad, Cat. No. 1708891)를 사용하여 역전사를 수행했습니다. qPCR은 Fast SYBR Green Real-time PCRmixture(Applied Biosystems, Cat. No.4385612)를 사용하는 ABI Step One Real-Time PCR System(Applied Biosystems, QuantStudio 3)으로 수행되었습니다[27). 단핵구 주화성 단백질 1(MCP{9}})용 프라이머(Takara Bio Inc, Cat. No. MA066003), 인터루킨 1 베타(IL{12}})(Takara Bio Inc., Cat. No. MA025939), 유도성 산화질소 합성효소(iNOS)(Takara Bio Inc., 카탈로그 번호 MA083369), 매트릭스 메탈로프로테이나제-(MMP-)2(Takara Bio Inc., 카탈로그 번호 MA127110), MMP{19}}(Takara Bio Inc. ., Cat. No.MA031311) 및 18S 리보솜 RNA(18S)(Takara Bio Inc., Cat. No. MA050364)는 상업적으로 이용 가능했습니다. 각 샘플은 18S mRNA 발현에 대한 값으로 정규화되었습니다(AACT 방법)[27].

2.4. 산화질소 분석.

개별 세포 배양 상층액을 수집하고 4도에서 14,{2}}rpm에서 10분 동안 원심분리했습니다. 그런 다음 상층액을 산화질소(NO) 분석에 사용했습니다. NO 분석은 상업적으로 이용 가능한 키트(BioAssay Systems, Cat. No. D2NO-100)에 설명된 대로 수행되었습니다. BioAssay Systems의 QuantiChrom Nitric Oxide Assay Kit는 개선된 Griess 방법을 사용하여 질산염을 아질산염으로 환원시킨 후 NO 생성을 측정하기 위한 비색 분석법입니다.

2.5. 웨스턴 블로팅.

lysis buffer(Cell Signaling, Cat. No.9803)를 이용하여 대식세포로부터 전체 세포 단백질을 추출하였다. 각 샘플을 10% SDS-PAGE에 적용하고 1차 항체(세포외 신호 조절 키나아제(p-ERK)의 인산화; Cell Signaling, Cat. No.9101, 인산화 c-Jun N-terminal kinase(p-JINK), Cell Signaling, Cat. No.9251, the urokinase plasminogen activator(uPA), Abcam, Cat. No.

ab20789, 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 및 수용체(uPAR); R&D, Cat.No.AF534 및 -액틴; 시그마 고양이. A5441)[28]. 그런 다음 멤브레인을 적절한 이차 항체와 함께 배양하고 면역 복합체를 화학 발광(Merck Millipore, 카탈로그 번호 WBLUF0100, 카탈로그 번호 WBLUC0100)에서 시각화하고 General Electric Imager(GE Healthcare, LAS4000 mini)를 사용하여 정량화했습니다[29].

2.6. 젤라틴 지모그래피.

MMP{ {4}}. 젤을 Triton X-100(2.5% vol/vo)로 60분 동안, 증류수로 15분 동안 두 번 세척했습니다. 그런 다음 겔을 염화칼슘(5mM)pH8.0을 함유하는 37℃ Cin 50mM Tris 완충액에서 밤새 배양했습니다. 배양 후, 겔을 Coomassie Brilliant Blue R{16}}(Bio-Rad, Cat. No.{ {18}}) 실온에서 30분 동안, 그 다음 맑은 밴드가 나타날 때까지 Coomassie Brilliant Blue R{20}} Destaining Solution(Bio-Rad, Cat. No.{22}})으로 탈색합니다. 겔 이미지는 General Electric Imager(GE Healthcare, LAS 4000 mini)를 사용하여 정량화했습니다. 염색되지 않은 반투명 소화된 영역은 MMP 활동 영역을 나타냅니다[30].

2.7. 통계.

모든 통계 분석은 Sigma Plot v14.{1}}(Systat Software Inc, California, USA)를 사용하여 수행되었습니다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차로 표시됩니다. 여러 그룹 간의 통계적 유의성은 일원 또는 양방향 분산 분석에 이어 Holm-Sidak 사후 테스트 또는 Student-Newman-Keuls 사후 테스트로 평가되었습니다. p값<0.05 was="" considered="" statistically="">

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3. 결과

3.1. LPS로 자극된 대식세포의 Fisetin 약화된 염증 매개체.

활성화된 대식세포는 NO와 같은 염증성 사이토카인과 염증 매개체를 생성하기 때문에 우리는 LPS로 자극된 대식세포에서 염증 매개체에 대한 fisetin의 효과를 조사했습니다. 먼저 fisetin이 전사 수준에서 항염증 효과를 발휘하는지 여부를 연구하기 위해 MCP-1, IL{3}} 및 iNOS와 같은 염증 유전자의 mRNA A 발현 수준을 결정했습니다(그림 1(a) ). 예상대로 이러한 염증성 유전자의 발현은 피세틴에 의해 용량 의존적으로 억제되었다. 다음으로 fisetin이 대식세포에서 염증반응을 억제하는지 확인하기 위해 LPS 처리 대식세포에서 NO 생성을 억제하는 능력을 평가하였다(Figure 1(b)). 예상대로 fisetin은 용량 의존적으로 NO 생성을 감소시켰습니다.

Effects of fisetin on the expression of inflammatory mediators in macrophages stimulated with LPS. (a) mRNA expression of MCP- 1, IL-1β, and iNOS in LPS- (10 ng/mL) stimulated macrophages in the presence or absence of fisetin (10-100 μM) by qPCR (n = 6 in each group). Each bar presents the mean + SE of six experiments. ∗p < 0:05 vs. control group; #p < 0:05 vs. LPS-stimulated group. (b) NO concentration in each cell culture supernatants by colorimetric assay (n = 3 in each group). Each bar presents the mean + SE of three experiments. ∗p < 0:05 vs. control; #p < 0:05 vs. LPS

3.2. Fisetin은 LPS로 자극된 대식세포에서 미토겐 활성화 단백질 키나아제를 감소시켰습니다.

fisetin은 다양한 세포 유형에서 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 경로를 억제하는 것으로 보고되었기 때문에 [31, 32], 우리는 대식세포에서 MAPK에 대한 fisetin의 효과를 조사했습니다. 첫째, 대식세포에서 LPS에 의해 유도된 MAPK의 활성화가 관찰되었다(그림 2(a)). LPS에 의한 p-ERK의 증가는 자극 후 15분에 최고조에 달한 반면, LPS에 의한 p-JNK의 증가는 30분에 최고조에 달했습니다. 따라서 후속 실험에서 대식세포를 LPS로 30분 동안 자극하였다. fisetin과의 병용 치료는 LPS에 의해 유도된 p-ERK 및 p-JNK의 증강을 유의하게 감소시켰습니다(그림 2(b) 및 2(c)).

Effects of fisetin on the protein expression of MAPKs in macrophages stimulated with LPS. (a) Protein expression of MAPK in LPS- (10 ng/mL) stimulated macrophages for 0-60-minute incubation (n = 3 in each group). (b) Protein expression of MAPK in LPS- (10 ng/mL) stimulated macrophages in the presence or absence of fisetin (100 μM) by western blotting (n = 3 in each group). (c) The relative expression of each protein was quantified by densitometry and normalized to the band under the control condition. Each bar presents the mean + SE of three experiments. ∗p < 0:05

3.3. Fisetin은 LPS로 자극된 대식세포에서 uPA 및 uPAR을 감소시켰습니다.

대식세포 활성화는 세포의 침습성과 밀접한 관련이 있습니다. 또한 대식세포의 uPA와 uPAR은 세포의 침투에 기여합니다. 따라서, uPA 및 uPAR의 발현에 대한 fisetin의 효과를 조사하였다. LPS는 uPA(그림 3(a)) 및 uPAR(그림 3(b))의 단백질 풍부함을 유도했습니다. fisetin의 동시치료는 LPS에 의한 uPA(Figure 3(a))와 uPAR의 증가를 감소시켰다(Figure 3(b)).

Effects of fisetin on the protein expression of uPA and uPAR in macrophages stimulated with LPS. (a) Protein expression of uPA in LPS- (10 ng/mL) stimulated macrophages in the presence or absence of fisetin (100 μM) by western blotting. The relative expression of each protein was quantified by densitometry and normalized to the band under the control condition (n = 3 in each group). Each bar presents the mean + SE of three experiments. ∗p < 0:05. (b) Protein expression of uPAR in LPS- (10 ng/mL) stimulated macrophages in the presence or absence of fisetin (100 μM) by western blotting. The relative expression of each protein was quantified by densitometry and normalized to the band under the control condition (n = 3 in each group). Each bar presents the mean + SE of three experiments. ∗p < 0:05

3.4. Fisetin은 LPS로 자극된 대식세포에서 MMP-2 및 MMP-9를 감소시켰습니다.

또한, fise-tin이 MMP에 미치는 영향을 설명하기 위해 uPA/uPAR의 다운스트림 매개체인 MMP-2 및 MMP{2}} 표현식을 조사했습니다. mRNA 수준과 관련하여 LPS는 비히클 처리에 비해 MMP-2 및 MMP{4}} mRNA 발현을 유의하게 증가시켰다(그림 4(a)). Fisetin은 LPS에 의해 유도된 MMP-2 또는 MMP9의 이러한 유전자 발현의 향상을 용량 의존적으로 감소시켰다(그림 4(a)). 또한 MMP의 단백질 활성은{10}} 자이모그래피로 평가되었습니다(그림 4(b)). MMP{12}}(92kDa)의 단백질 활성은 LPS 자극에 의해 증가되었지만 fisetin에 의해 감소되었습니다(그림 4(b)).


Effects of fisetin on MMP-2 and MMP-9 in macrophages stimulated with LPS. (a) mRNA expression of MMP-2 and MMP-9 in LPS- (10 ng/mL) stimulated macrophages in the presence or absence of fisetin (10-100 μM) by qPCR (n = 6 in each group). Each bar presents the mean + SE of six experiments. ∗p < 0:05 vs. control group; #p < 0:05 vs. LPS-stimulated group. (b) The activation of MMP-9 in LPS- (10 ng/mL) stimulated macrophages in the presence or absence of fisetin (10-100 μM) by gelatin zymography. The relative expression of MMP-9 activity was quantified by densitometry and normalized to the band under the control condition (n = 3 in each group). Each bar presents the mean + SE of three experiments. ∗p < 0:05.

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4. 토론

우리는 대식세포의 염증에 대한 피세틴의 중요한 효과를 발견했습니다. 본 연구에서는 fisetin이 대식세포에서 LPS에 의해 유도되는 MCP{0}}, IL{1}}, iNOS 및 NO와 같은 염증 성분의 유도를 약화시키는 것으로 나타났습니다. 또한, fisetin은 MAPK의 활성화를 억제하고 LPS에 의한 uPA 및 uPAR 발현의 증가를 약화시켰다. 또한, fisetin은 MMP-2 및 MMP{4}}의 mRNA 풍부도의 증가와 MMP-9의 활성을 약화시켰다.

그람 음성 감염에 의한 패혈증에서 LPS는 일반적으로 패혈증의 원인 인자로 인식됩니다. 많은 연구에서 LPS는 패혈증과 염증의 모델로 사용되었습니다. 또한, 만성 염증은 염증 세포의 활성화와 iNOS와 같은 전염증 매개체 및 핵 전사 인자 카파 B(NF-xB)와 같은 전사 인자의 부적절한 생성에 의해 조기 암을 유발합니다[33]. 또한 산화 스트레스는 iNOS의 발현을 약화시켜 감소시킨다는 보고도 있다[34]. 우리의 연구는 fisetin이 pro-inflammatory 유전자의 mRNA 풍부와 NO 생성에 대한 억제 효과로 인해 패혈증 및 패혈성 쇼크의 예방 및 치료에 효과적일 수 있음을 보여주었습니다. 이 연구에서 fisetin은 염증유발 유전자(iNOS)의 mRNA 발현을 감소시켜 NO 생성을 억제하였다. 따라서 fisetin이 산화 스트레스를 약화시켰을 가능성이 있습니다. 결과적으로, 이러한 결과는 fisetin의 항염증, 항종양 및 항산화 효과를 뒷받침합니다.

여러 연구에서 LPS가 ERK 및 JNK를 포함한 MAPK의 인산화를 유도했다고 보고했습니다[35]. 또한, fisetin은 MAPK를 억제하여 uPA 발현을 하향 조절함으로써 인간 자궁 경부 세포의 이동 및 침입을 억제한다고 보고되었습니다[36]. -파지, uPA 및 uPAR의 발현 및 활성에 대한 fisetin의 효과에 관한 보고서는 거의 없습니다. 우리의 연구는 이전에 암세포에서 보고된 바와 같이 피세틴이 대식세포에서 MAPK 신호 전달을 억제함으로써 LPS에 의해 유도된 uPA 및 uPAR의 발현을 억제한다는 것을 처음으로 입증했습니다.

MMP는 발현이 발달, 생리학 및 병리학과 같은 특정 과정과 관련된 프로테아제 계열입니다. 일반적으로 MMP{0}}는 죽상경화증, 관절염, 전신성 홍반성 루푸스와 같은 다양한 염증성 질환의 표지자로 인식되어 왔습니다[37]. 또한 MMP-9는 세포 이동과 밀접한 관련이 있습니다[38,39]. 여러 연구에서 특히 MMP-2와 MMP{6}}가 죽상동맥경화증에 관여하고 죽상경화반 40-42]의 안정화에 중요한 역할을 한다고 보고했습니다. 이 점에서 우리의 결과는 억제제가 of MMP-9는 취약한 플라크의 안정화를 위한 치료적 접근으로 가능성을 제공할 수 있습니다. 더욱이 최근 조사에 따르면 피부의 상처 치유가 MMP-9의 과도한 활성화에 의해 손상되는 것으로 나타났습니다[43]. 따라서 피세틴은 피부 치유를 위한 치료적 접근으로도 가능성이 있음을 시사했습니다. 분자 메커니즘에 대한 세부 사항을 밝히기 위해서는 향후 연구가 필요할 것입니다.

최근 제약업계의 트렌드는 천연식물 자체를 신약으로 개발하는 전략을 모색하고 있다. 실제로 최근 2건의 동물 연구에서 피세틴 치료에 의해 LPS 유발 급성 폐 염증 및 콜라겐 유발 관절염이 개선되었음을 입증했습니다 |32,44. 또 다른 생체 외 연구에서도 피세틴이 만성 폐쇄성 폐질환 또는 제2형 당뇨병 환자의 백혈구에서 LPS로 유도된 사이토카인 방출을 약화시킬 수 있음이 입증되었습니다[45]. 염증 및 자가면역 질환[46-50]을 약화시키기 위해 많은 면역억제제가 개발되었습니다. 그럼에도 불구하고 대부분의 화합물은 상당한 부작용을 나타냅니다. 폴리페놀은 일반적으로 식이 과일과 채소에 존재하기 때문에 아마도 더 안전한 면역억제제일 수 있습니다[51, 52]. 과일과 채소에는 세스퀴테르펜 락톤, 테르페노이드, 다당류 및 페놀 화합물을 비롯한 다양한 식물 화학 물질이 포함되어 있습니다. 피세틴의 항염, 항종양, 항산화 효과를 보여주는 우리의 결과는 그것이 새로운 약물로 개발될 수 있음을 강력하게 시사합니다. 피세틴은 면역 요법의 유망한 후보이지만 특정 질병에 대한 치료제로 피세틴을 함유한 천연물의 가능성은 임상 환경에서 추가로 검증될 필요가 있습니다.

5. 결론

본 연구는 fisetin이염증성유전자(MCP-1, IL{1}}b 및 iNOS), NO 생성, 대식세포에서 LPS에 의해 유도된 MAPK, uPA, uPAR 및 MMP의 인산화. 이러한 결과는 fisetin이 여러 대식세포 관련 질병에 대한 치료제일 수 있음을 시사했습니다.


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