파트 1: NF-κB 및 AP-1 경로의 활성화를 통한 인간 각질세포 및 흑색종 세포에서 케르세틴 3-O- -D-글루쿠로나이드의 항염, 항산화, 보습 및 항멜라닌 생성 효과
Mar 21, 2022
자세한 내용은 다음으로 문의하십시오.tina.xiang@wecistanche.com
추상적인: 케르세틴3-O- -D-glucuronide(Q-3-G), 케르세틴의 글루쿠로나이드 접합체는항염증지질다당류로 자극된 대식세포의 특성뿐만 아니라 항암 및 항산화 특성. 피부 보호 효과를 포함하여 광범위한 약리 활성을 갖는 것으로 광범위하게 기술된 퀘르세틴과 달리, 피부에서 Q{1}}G의 약리학적 이점 및 기전은 아직 밝혀지지 않았습니다. 이 연구는 Q-3-UVB 유도 또는 H2O{6}} 유도 산화 스트레스에 대한 항염 및 항산화 특성을 포함한 피부 보호 특성, 수분 효과 및항멜라닌 생성인간 각질세포(HaCaT) 및 흑색종(B16F10) 세포를 사용한 활성. Q-3-G는 H2O 또는 UVB-에서 cyclooxygenase-2(COX-2) 및 종양 괴사 인자(TNF)와 같은 전염증성 유전자 및 사이토카인의 발현을 하향 조절합니다. 조사된 HaCaT 세포. 우리는 또한 O-3-Gexhibits가 자유 라디칼 소거 분석, 유세포 분석 및 핵 인자 적혈구계 2- 관련 인자 2(Nrf2)의 증가된 발현을 사용하여 항산화 효과가 있음을 보여주었습니다. Q{13}}G는 -멜라닌 세포 자극 호르몬(-MSH) 유도 B16F10 세포에서 멜라닌 생성을 감소시켰습니다. 트랜스글루타미나제-1(TGM{23}}), 필라그린(FLG), 히알루론산 합성효소와 같은 보습 인자 관련 유전자를 평가하여 Q{20}}G의 수화 효과 및 기전을 조사했습니다. (HAS)-1. 또한 Q{25}}G는 MAPK/AP에 관여하는 c-Jun, Jun N-terminal kinase(JNK), Mitogen-activated protein kinase(MAPK) kinase 4(MKK4) 및 TAK1의 인산화를 증가시켰습니다. -1 경로 및 NF-kB 경로에 관여하는 IkB , IkB kinase(IKK)- , Akt 및 Src의 인산화. 종합하면, 우리는 Q{35}}G가 NF-kB 및 AP{38}} 경로를 통해 인간 각질세포와 흑색종 세포에서 항염증, 항산화, 보습 및 항멜라닌 생성 특성을 발휘함을 입증했습니다.
키워드: 케르세틴 3-O- -D-글루쿠로나이드;자외선 차단; 보습; 항멜라닌 생성; AP-1; NF-kB
1. 소개
신체의 가장 큰 기관인 피부는 자외선, 감염성 미생물, 유해화학물질 등의 유해인자와 외부 환경으로부터 신체를 보호하는 중요한 역할을 하는 장벽 역할을 합니다. 이 장벽은 또한 신체의 전해질 균형과 온도를 조절하고 수분 손실을 방지합니다[1,2]. 인간의 피부는 표피, 부속기가 있는 진피, 피하 조직의 세 층으로 구성됩니다[3]. 표피층은 체온 유지에 중요한 역할을 합니다.
피부 표피에 풍부한 구성요소인 케라티노사이트는 효과적인 물리화학적 장벽을 허용하는 데스모솜(desmosomes)과 밀착 접합(tight junction)을 통해 서로 밀접하게 상호작용합니다[4]. 피부가 보호막 역할을 하지만 자외선(UV)은 피부의 외층인 각질형성세포를 비롯한 대부분의 세포에 상당한 영향을 미칩니다. 자외선은 피부노화, 피부손상, 주름, 과색소침착 등을 유발할 수 있으며, 이는 가장 검열적인 위험인자 중 하나로 간주되고 있습니다[5]. 자외선은 UVA(320-400 nm), UVB의 세 가지 파장 범위로 구성됩니다. (280-320 nm) 및 UVC (200-280 nm). 산화 스트레스에 기여하는 것으로 알려진 과산화수소(H2O2) 외에도 UVB는 ROS 생성 효소의 활성화를 통해 활성 산소 종(ROS)의 생성을 유발할 수 있습니다[6]. 케라티노사이트를 포함하는 세포에서 ROS의 통제되지 않은 축적은 지질, 단백질, 핵산 및 기타 세포내 분자에 대한 산화적 변형을 유발하여 결과적으로 다양한 유형의 피부 손상 및 세포 사멸, 산화 스트레스, 및 염증 [7,8]. 또한 산화 스트레스 반응은 다양한 세포 구성 요소의 손상에 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다[9]. 손상된 피부 세포는 또한 염증 반응을 일으켜 만성적으로 손상된 피부를 유발할 수 있습니다[10]. 생물학적 과정을 통해 UVB 또는 H2O{16}}매개된 피부 손상의 한 유형은 사이클로옥시게나제{17}}(COX{18}}) 및 전염증성 사이토카인과 같은 염증 유전자의 발현입니다[11]. 따라서 UVB 또는 H2O2 매개 피부 손상과 관련된 질병을 예방하고 차단하기 위해서는 보다 안전하고 강력하며 효율적인 피부 보호 효과의 개발이 필수적입니다.
피부 수분은 또한 정상적인 기능을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. 특히 각질층(SC)은 수분 손실에 대한 보호 효과가 있습니다[12]. 각질층의 수분 함량은 피부 박리 및 적절한 성숙에 관여하는 반면, SC의 수분 부족은 각질세포의 축적 및 기능 장애를 촉진합니다[12,13]. 각질세포 분화의 마지막 단계에서 원형질막과 세포 소기관이 사라지고 칼슘 유입이 다른 단백질과의 가교를 위한 트랜스글루타미나제(TGM)를 유도합니다. TGM-1의 결핍 또는 손실은 세포 외피의 결함 가교로 이어집니다. Lamella ichthyosis는 TGM의 손실로 인한 질병의 한 예입니다-1. 또한, 형성된 케라틴 기질인 필라그린(FLG)은 g-글루타밀 라이신 가교 반응, ATGM 및 멤브레인을 촉매하여 각질화된 봉투 단백질과 지질[14]에 결합하는 스캐폴드 역할을 하기 때문에 SC 형성에 역할을 합니다. - SC에 무결성을 부여하는 관련 효소 [15]. 또한 히알루론산(HA)은 피부의 수분 보유에 관여하는 천연 수분 인자(NMF)의 일종으로 고유한 피부 노화에 뚜렷한 프로파일을 나타내며 약물 전달제이며 세포외 기질의 중요한 구성 요소입니다. [16,17]. HA는 히알루론산 합성효소(HAS) 유전자를 조절하여 피부 수분을 증가시키는 역할을 합니다. 또한 레티노산(비타민 A)은 표피의 HA를 효과적으로 조절할 수 있습니다[17]. TGM{14}}, FLG 및 HAS{15}},3는 NMF 생산과 관련된 유전자입니다[18]. 또한 활성 단백질{18}}(AP{19}}) 및 핵 인자(NF)-kB와 같은 전사 인자의 활성화는 피부 장벽과 피부 수분을 최적화하는 염증 유발 물질 생성에 관여합니다. AP{22}} 및 NF-kB 경로[19]를 통해. AP{25}} 경로의 상류 신호전달 효소에는 c-Jun N-말단 키나제(JNK), 세포외 신호 조절 키나제(ERK) 및 p38과 같은 미토겐 활성화 단백질 키나제(MAPK)가 포함되며, Src, Akt, IkB-키나제(IKKo/) 및 KBO(IkBa)는 NF-KB 경로에 속합니다[20. 피부는 또한 표피층, 특히 피부색과 멜라닌 생성의 결정에 기여하는 멜라닌의 주요 공급원인 멜라닌 세포에서 멜라닌을 생성합니다[21]. UVB 조사 및 α-멜라닌 세포 자극 호르몬(o-MSH)은 멜라닌 분비를 자극하여 멜라닌 생성을 유발할 수 있습니다[22. 멜라닌 생성 동안 -MSH는 단백질 키나아제 A(PKA), 단백질 소안구증 관련 전사 인자(MITF) 및 cAMP 반응 요소 결합(CREB)을 활성화합니다[23]. 멜라닌의 기능 중 하나는 햇빛을 포함한 자외선에 의한 피부 손상을 방지하는 것으로 간주됩니다. 그러나 노화, 멜라닌 세포 자극 호르몬, 자외선 노출로 인한 멜라닌의 과잉 생성 또는 멜라닌 함량의 결핍은 주근깨, 기미, 노인성 흑점 및 기타 과다/저색소침착 장애를 촉진하여 외모와 피부에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 건강 [24]. 따라서, 멜라닌 생성을 조절하는 것은 또한 인체의 건강 및 미용적 외관을 모두 유지하기 위해 요망된다.
케르세틴야채, 과일, 음료 및 약용 식물에 존재하는 우세하게 할당된 플라보놀 유형 플라보노이드입니다[25]. 결과적으로 케르세틴은 항염, 항동맥경화,항산화제, 항암 및 피부 보호 특성이 있으며 멜라닌 생성과 관련이 있습니다[24,{1}}]. 그러나 민감하고 신뢰할 수 있는 방법을 사용하는 여러 연구에서 케르세틴이 혈장[30-33]에서 검출되지 않았으며 뇌에서는 거의 발견되지 않음이 입증되었습니다[34,35]. 일반적으로 배당체 형태로 존재하는 케르세틴은 잘 흡수되고 대부분 가수분해되어 소장, 결장, 간 및 신장에서 결합 대사물로 대사됩니다[30,36-38]. 순환 혈액에서는 케르세틴 아글리콘 또는 배당체가 아닌 글루쿠로나이드 또는 황산염(각각 메틸화 또는 비메틸화)과 같은 결합 대사산물만 검출됩니다. 3/-methyl-quercetin{10}glucuronide, quercetin{11}glucuronide 및 quercetin{12}'-sulfate는 튀긴 양파 섭취 후 1.5시간 후에 주요 혈장 대사 산물로 확인되었습니다[30, 32]. 이러한 케르세틴 대사 산물은 II상 대사의 결과로 UDP-glucuronyltransferases를 포함한 생체 변형 효소에 의해 소장과 간에서 형성됩니다[29,39,40]. 또한 퀘르세틴의 결합 대사산물은 1주 동안 식사와 함께 양파를 주기적으로 섭취한 후 10-'~10-도 M의 농도 범위에서 인간 혈장에 축적되는 것으로 보고되었습니다[41]. 케르세틴 대사 산물의 반감기는 약 11-28시간으로 상당히 높습니다[29]. 이러한 화합물이 공액 케르세틴 대사물의 주요 형태로 관찰되었기 때문에 이러한 공액 케르세틴 대사 산물을 이용한 플라보놀의 생물학적 활성에 초점을 맞춘 연구가 필수적이며, 이에 따라 우리는 공액 케르세틴 대사 산물 중 하나의 생물학적 활성을 연구하게 되었습니다. 간, 신장, 뇌를 포함한 조직과 혈장에서 주로 발견되는 가장 풍부한 글루쿠로나이드 대사 산물 중 하나는 케르세틴 3-O{31}}D-글루쿠로나이드(Q{33}}G)(그림 1) [31,35,40,42,43], 다른 모델의 모 화합물과 비교하여 유사하거나 더 강하거나 더 약한 활성을 생성할 수 있습니다. Q{40}}G는 생물학적 활성을 발휘하기 위해 혈장을 통해 표적 조직으로 운반됩니다[39]. O{42}}G는 또한 케르세틴의 경구 투여 후 쥐의 혈장에서 효과적인 대사 산물인 것으로 나타났습니다[43]. 다른 연구에서 Q{44}}G를 함유한 대사산물은 케르세틴이 풍부한 식품을 투여한 후 대동맥에 축적되는 것으로 밝혀졌으며 인간의 혈액에서 0에서 0까지의 범위에서 검출되는 활성 성분으로 확인되었습니다.{48} } μM[44]. 또한 Q{50}}G는 와인[45]과 Hypericum hirsutum, Nelumbo nucifera, Oenothera biennis 및 녹두와 같은 약용 식물[46-49]에서 찾을 수 있습니다.Q{53}}G LPS 자극 조건에서 항염증 성분으로 설명되었으며 혈장에서 항산화 특성을 나타냈습니다[{56}}]. 그러나 퀘르세틴의 오랜 적용 역사와 폭넓은 연구에 비해 Q{57}}G에 대한 연구는 여전히 탐구되어야 합니다. 따라서 Q{58}}G는 케르세틴의 생체 내 활성 플레이어로서 케르세틴 대사 산물의 대표자로 선택되었습니다. 또한 피부 보호 효과에 대한 Q{59}}G의 역할도 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다. 이 연구에서는 다양한 시험관 내 평가를 사용하여 HaCaT(인간 케라티노사이트 세포주)에서 UVBor H2O 유도 산화 스트레스 및 염증, 피부 수분에 대한 Q{60}}G의 피부 보호 효과를 조사했습니다. 세포, 및 B16F10(쥐 흑색종 세포주) 세포에서의 항멜라닌 생성 활성.
2. 결과
2.1.UVB 또는 H2O2-자극된 HaCaT 세포에 대한 Q-3-G의 항염 및 항산화 효과
피부 조직은 자외선에 의해 손상될 수 있습니다. 자외선은 산화 스트레스, 세포 사멸, 염증 및 피부 노화를 비롯한 여러 유해 요인을 활성화합니다. Q{0}}G의 자외선 차단 활성을 확인하기 위해 먼저 Q{1}}G가 인간 각질형성세포의 세포 생존율에 영향을 미치는지 여부를 평가했습니다. 3-(4-5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐-243 테트라졸륨 브로마이드(MTT) 분석을 사용하여 세포독성 효과를 조사했습니다. HaCa 세포에서 O-3-G의 그림 2a에서 볼 수 있듯이 2.{11}} uM 농도에서는 Q{12}}G 농도에서 세포 생존에 큰 간섭이 없었으며, 이는 O{13}}G가 20μM로 피부 세포의 표층인 각질형성세포에 해를 끼치지 않았습니다. 다음으로 UVB에 노출된 HaCaT 세포에서 Q{16}}G의 피부 보호 효과를 평가했습니다. 30mJ/cm²의 UVB 조사 후 Q{18}}G는 농도 의존적 방식으로 UVB로 인한 세포 사멸로부터 HaCaT 세포를 크게 보호했습니다(그림 2b). MTT 분석에 따라 HaCaT 세포의 형태를 포착하기 위해 현미경에 연결된 카메라를 사용하여 Q{22}}G는 최대 10μM 농도까지 UVB 조사된 HaCaT 세포로 인한 세포 사멸로부터 보호했습니다(그림 2c). . 각 조건에서 HaCaT 세포의 수는 미처리군 482개, UVB 30mJ/cm-군 91개, UVB 30mJ/cm²plus 5μM O{33}}G군 276개, UVB 30 320개였다. mJ/cm² + 10μM Q{37}}G 그룹(그림 2d). 이러한 결과는 Q-3-G가 UVB에 의한 HaCaT 손상을 억제하고 UVB 조사로부터 피부 보호 효과를 회복시키는 것을 확인시켜 주었다.
![i-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 μM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 μM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 μM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted. (e,f) Anti-inflammatory effect of Q-3-G in HaCaT cells. The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s or incubated with H2O2 (500 μM) with or without Q-3-G (5–10 μM) and further incubated for 12 h. The mRNA expression levels of COX-2 (e) and TNF-α (f) were determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (g–j) Antioxidant effect of Q-3-G in HaCaT cells. Q-3-G (0–40 μM) was reacted with 2,2-diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) in the dark at 37°C for 30 min. The absorbance at 517 nm was measured spectrophotometrically (g). Q-3-G was reacted with 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) at different concentrations in the dark at 37°C for 30 min. The absorbance at 730 nm was measured spectrophotometrically (h). Ascorbic acid was used as a control substance. (i) The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s with or without Q-3-G (5– 10 μM) and after incubating for 12 h, the mRNA level of Nrf2 was determined by quantitative realtime PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3) and Q-3-G (0-10 μM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2, DPPH, or ABTS). 2.2. Antimelanogenesis Effect in B16F10 and Moisturizing Effect in HaCaT Cells of Q-3-G To examine the effects of Q-3-G on melanogenesis, the melanoma cells were treated with α-MSH for 48 h to secrete melanin in B16F10 cells. By employing MTT assays, we first confirmed that Q-3-G had no cytotoxicity in B16F10 cells at concentrations up to 20 μM for 48 h (Figure 3a). This result showed, for the next assessments that the effects of Q- 3-G in B16F10 were not due to cell death. Next, we evaluated B16F10 with Q-3-G and α- MSH for 48 h to determine the effects of Q-3-G on melanogenesis. As shown in Figure 3b, Q-3-G significantly inhibited melanin secretion. The positive control arbutin also significantly decreased melanin secretion. The skin moisture-related molecule is hyaluronic acid (HA). As previously mentioned, HA, distributed throughout the epidermis and dermis, is an NMF that enhances skin hydration [55]. We used a reverse transcription PCR (RT-PCR) assay to examine the transcription level of HAS-1 after 12 h with a concentration of Q-3-G of up to 30 μM. HAS promotes the accumulation of intermediate-sized HA within keratinocytes [12]. As shown in Figure 3c, the expression of HAS-1 was increased by treatment with Q-3-G up to 10 μM. In addition to the moisturizing factor, we also examined the expression of FLG and TGM- 1. We used retinol as a positive control group. The transcription levels of FLG and TGM-1 increased notably after treatment with Q-3-G at concentrations up to 10 μM (Figure 3d). Figure 2. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 µM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 µM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 µM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted.](/Content/uploads/2022842169/2022032111072748381b7599e14e8e8a252699414e284f.png "i-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 μM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 μM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 μM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted. (e,f) Anti-inflammatory effect of Q-3-G in HaCaT cells. The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s or incubated with H2O2 (500 μM) with or without Q-3-G (5–10 μM) and further incubated for 12 h. The mRNA expression levels of COX-2 (e) and TNF-α (f) were determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (g–j) Antioxidant effect of Q-3-G in HaCaT cells. Q-3-G (0–40 μM) was reacted with 2,2-diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) in the dark at 37°C for 30 min. The absorbance at 517 nm was measured spectrophotometrically (g). Q-3-G was reacted with 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) at different concentrations in the dark at 37°C for 30 min. The absorbance at 730 nm was measured spectrophotometrically (h). Ascorbic acid was used as a control substance. (i) The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s with or without Q-3-G (5– 10 μM) and after incubating for 12 h, the mRNA level of Nrf2 was determined by quantitative realtime PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3) and Q-3-G (0-10 μM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2, DPPH, or ABTS). 2.2. Antimelanogenesis Effect in B16F10 and Moisturizing Effect in HaCaT Cells of Q-3-G To examine the effects of Q-3-G on melanogenesis, the melanoma cells were treated with α-MSH for 48 h to secrete melanin in B16F10 cells. By employing MTT assays, we first confirmed that Q-3-G had no cytotoxicity in B16F10 cells at concentrations up to 20 μM for 48 h (Figure 3a). This result showed, for the next assessments that the effects of Q- 3-G in B16F10 were not due to cell death. Next, we evaluated B16F10 with Q-3-G and α- MSH for 48 h to determine the effects of Q-3-G on melanogenesis. As shown in Figure 3b, Q-3-G significantly inhibited melanin secretion. The positive control arbutin also significantly decreased melanin secretion. The skin moisture-related molecule is hyaluronic acid (HA). As previously mentioned, HA, distributed throughout the epidermis and dermis, is an NMF that enhances skin hydration [55]. We used a reverse transcription PCR (RT-PCR) assay to examine the transcription level of HAS-1 after 12 h with a concentration of Q-3-G of up to 30 μM. HAS promotes the accumulation of intermediate-sized HA within keratinocytes [12]. As shown in Figure 3c, the expression of HAS-1 was increased by treatment with Q-3-G up to 10 μM. In addition to the moisturizing factor, we also examined the expression of FLG and TGM- 1. We used retinol as a positive control group. The transcription levels of FLG and TGM-1 increased notably after treatment with Q-3-G at concentrations up to 10 μM (Figure 3d). Figure 2. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 µM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 µM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 µM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted.")
체내 염증의 발생 및 악화는 때때로 대식세포를 활성화시키고 일부 사이토카인을 방출합니다. 염증은 산화 스트레스의 특징입니다. UVB 또는 HO{2}}유도 염증에 대한 Q{1}}G의 항염증 효과를 조사했습니다. UVB가 피부 세포의 DNA 손상과 염증을 촉진할 수 있다는 것은 잘 알려져 있습니다[10]. HaCaT 세포에 UVB 30mJ/cm²를 조사하고 HaCaT 세포를 H2O2(500 uM)로 배양했습니다. 염증성 효소 COX{9}} 및 전염증성 사이토카인 TNF-의 mRNA 발현을 확인하기 위해 실시간 PCR 분석을 사용했습니다. 그림 2e,f의 결과에서 볼 수 있듯이 10μM 농도의 O{14}}G는 COX{15}} 및 TNF-의 mRNA 발현을 유의하게 억제했습니다. 결과적으로 Q{17}}G는 UVB 조사 또는 H2O2에 노출된 후 HaCaT 세포에서 유도된 염증 반응을 억제했습니다.
우리는 2,2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS)와 2,{7}}diphenyl-lpicrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거 분석(널리 사용되는 모델 시스템)을 사용했습니다. 다양한 농도에서 Q{10}G의 항산화 특성을 평가하기 위해 시험관 내에서 천연 화합물의 소거 활성을 조사합니다. HaCaT 세포는 DPPH가 있는 상태에서 2.{14}} μM부터 농도 의존적으로 Q{11}}G를 처리했으며, 그 결과 2.5uM 이상에서 상당한 소거 활성을 나타냈습니다(그림 2g). . ABTS 분석은 또한 1.75μM의 IC50 값으로 농도 의존 방식으로 자유 라디칼 소거에 대한 Q{18}}G의 영향을 유의하게 보여주었습니다(그림 2h). Ascorbic acid(AA)는 양성 대조군으로 DPPH와 ABTS 분석 모두에서 가장 큰 항산화 효과를 보였습니다. 항산화 반응 요소(ARE) 의존 유전자 중 하나인 핵 인자 적혈구계 2-관련 인자 2(Nrf2)는 보호 산화환원효소와 그 친핵성 기질을 조절하여 항산화 효소를 촉진하여 손상을 제거하고 복구하는 것으로 보고되었습니다. 시스템 [53]. 다음으로 UVB 조사된 HaCaT 세포에서 Nrf2의 발현 수준을 조사했습니다. 위의 결과를 강화하여 O-3-G는 농도 의존적으로 대조군과 비교하여 UVB 조사 시 Nrf2의 발현 수준을 최대 10 uM까지 크게 향상시켰으며(그림 2i), 이는 Q{36}} G는 자유 라디칼 소거 특성으로 화학적 및 생물학적으로 항산화 효과를 나타내며 각각 Nrf{37}}의존적 ARE 신호 전달의 보호 효과를 증가시킵니다. 또한 UV 조건에서 DCFDA(dichlorodihydrofluorescein diacetate)를 사용하여 ROS 유세포 분석을 수행했습니다. 항산화제는 ROS 생성을 억제하여 세포 스트레스 요인을 억제하는 것으로 널리 알려져 있습니다[54]. 결과는 5 및 10 μM 농도의 Q{39}}G 처리가 UVB 유도 ROS의 수준을 감소시키는 것으로 나타났습니다(그림 2j). 종합하면, 이러한 데이터는 Q{44}}H2O에 대한 항염증 및 항산화 효과 또는 HaCaT 세포의 UVB 유도 산화 스트레스 및 염증과 같은 피부 보호 특성을 Q{44}}제시한다는 것을 의미합니다.
![A level of Nrf2 was determined by quantitative realtime PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3) and Q-3-G (0-10 μM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2, DPPH, or ABTS). 2.2. Antimelanogenesis Effect in B16F10 and Moisturizing Effect in HaCaT Cells of Q-3-G To examine the effects of Q-3-G on melanogenesis, the melanoma cells were treated with α-MSH for 48 h to secrete melanin in B16F10 cells. By employing MTT assays, we first confirmed that Q-3-G had no cytotoxicity in B16F10 cells at concentrations up to 20 μM for 48 h (Figure 3a). This result showed, for the next assessments that the effects of Q- 3-G in B16F10 were not due to cell death. Next, we evaluated B16F10 with Q-3-G and α- MSH for 48 h to determine the effects of Q-3-G on melanogenesis. As shown in Figure 3b, Q-3-G significantly inhibited melanin secretion. The positive control arbutin also significantly decreased melanin secretion. The skin moisture-related molecule is hyaluronic acid (HA). As previously mentioned, HA, distributed throughout the epidermis and dermis, is an NMF that enhances skin hydration [55]. We used a reverse transcription PCR (RT-PCR) assay to examine the transcription level of HAS-1 after 12 h with a concentration of Q-3-G of up to 30 μM. HAS promotes the accumulation of intermediate-sized HA within keratinocytes [12]. As shown in Figure 3c, the expression of HAS-1 was increased by treatment with Q-3-G up to 10 μM. In addition to the moisturizing factor, we also examined the expression of FLG and TGM- 1. We used retinol as a positive control group. The transcription levels of FLG and TGM-1 increased notably after treatment with Q-3-G at concentrations up to 10 μM (Figure 3d). Figure 2. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 µM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 µM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 µM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted. (e,f) Anti-inflammatory effect of Q-3-G in HaCaT cells. The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s or incubated with H2O2 (500 µM) with or without Q-3-G (5–10 µM) and further incubated for 12 h. The mRNA expression levels of COX-2 (e) and TNF-α (f) were determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (g–j) Antioxidant effect of Q-3-G in HaCaT cells. Q-3-G (0–40 µM) was reacted with 2,2- diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) in the dark at 37 ◦C for 30 min. The absorbance at 517 nm was measured spectrophotometrically (g). Q-3-G was reacted with 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonic acid (ABTS) at different concentrations in the dark at 37 ◦C for 30 min. The absorbance at 730 nm was measured spectrophotometrically (h). Ascorbic acid was used as a control substance. (i) The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s with or without Q-3-G (5–10 µM) and after incubating for 12 h, the mRNA level of Nrf2 was determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) and Q-3-G (0-10 µM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2 , DPPH, or ABTS)](/Content/uploads/2022842169/202203211108455bff4d0223ef483dbe3172e2d3349d71.png "A level of Nrf2 was determined by quantitative realtime PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3) and Q-3-G (0-10 μM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2, DPPH, or ABTS). 2.2. Antimelanogenesis Effect in B16F10 and Moisturizing Effect in HaCaT Cells of Q-3-G To examine the effects of Q-3-G on melanogenesis, the melanoma cells were treated with α-MSH for 48 h to secrete melanin in B16F10 cells. By employing MTT assays, we first confirmed that Q-3-G had no cytotoxicity in B16F10 cells at concentrations up to 20 μM for 48 h (Figure 3a). This result showed, for the next assessments that the effects of Q- 3-G in B16F10 were not due to cell death. Next, we evaluated B16F10 with Q-3-G and α- MSH for 48 h to determine the effects of Q-3-G on melanogenesis. As shown in Figure 3b, Q-3-G significantly inhibited melanin secretion. The positive control arbutin also significantly decreased melanin secretion. The skin moisture-related molecule is hyaluronic acid (HA). As previously mentioned, HA, distributed throughout the epidermis and dermis, is an NMF that enhances skin hydration [55]. We used a reverse transcription PCR (RT-PCR) assay to examine the transcription level of HAS-1 after 12 h with a concentration of Q-3-G of up to 30 μM. HAS promotes the accumulation of intermediate-sized HA within keratinocytes [12]. As shown in Figure 3c, the expression of HAS-1 was increased by treatment with Q-3-G up to 10 μM. In addition to the moisturizing factor, we also examined the expression of FLG and TGM- 1. We used retinol as a positive control group. The transcription levels of FLG and TGM-1 increased notably after treatment with Q-3-G at concentrations up to 10 μM (Figure 3d). Figure 2. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 µM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 µM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 µM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted. (e,f) Anti-inflammatory effect of Q-3-G in HaCaT cells. The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s or incubated with H2O2 (500 µM) with or without Q-3-G (5–10 µM) and further incubated for 12 h. The mRNA expression levels of COX-2 (e) and TNF-α (f) were determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (g–j) Antioxidant effect of Q-3-G in HaCaT cells. Q-3-G (0–40 µM) was reacted with 2,2- diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) in the dark at 37 ◦C for 30 min. The absorbance at 517 nm was measured spectrophotometrically (g). Q-3-G was reacted with 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonic acid (ABTS) at different concentrations in the dark at 37 ◦C for 30 min. The absorbance at 730 nm was measured spectrophotometrically (h). Ascorbic acid was used as a control substance. (i) The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s with or without Q-3-G (5–10 µM) and after incubating for 12 h, the mRNA level of Nrf2 was determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) and Q-3-G (0-10 µM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2 , DPPH, or ABTS)")
2.2. B16F10의 항멜라닌 생성 효과 및 Q-3-G의 HaCaT 세포의 보습 효과
O-3-G가 멜라닌 생성에 미치는 영향을 조사하기 위해 흑색종 세포에 -MSH를 48시간 동안 처리하여 B16F10 세포에서 멜라닌을 분비했습니다. MTT 분석을 사용하여 우리는 먼저 Q{5}}G가 48시간 동안 최대 20μM의 농도에서 B16F10 세포에서 세포독성이 없음을 확인했습니다(그림 3a). 이 결과는 다음 평가에서 B16F10에서 OG의 효과가 세포 사멸로 인한 것이 아님을 보여주었습니다. 다음으로 B16F10을 48시간 동안 Q{16}Gand -MSH로 평가하여 Q{19}G가 멜라닌 생성에 미치는 영향을 확인했습니다. 그림 3b에서 볼 수 있듯이 Q{21}}G는 멜라닌 분비를 유의하게 억제했습니다. 양성 대조군인 알부틴은 또한 멜라닌 분비를 유의하게 감소시켰습니다.
피부 수분 관련 분자는 히알루론산(HA)이다. 앞서 언급한 바와 같이 표피와 진피 전체에 분포하는 HA는 피부 수분을 증가시키는 NMF이다[55]. 우리는 역전사 PCR(RT-PCR) 분석을 사용하여 최대 30uM의 Q-3-G 농도로 12시간 후 HAS-1의 전사 수준을 조사했습니다. HAS는 각질세포 내 중간 크기의 HA 축적을 촉진합니다[12]. 그림 3c와 같이 HAS{10}}의 발현은 Q{11}}G를 10μM까지 처리하여 증가했습니다. 보습 인자 외에도 FLG와 TGM{{ 13}}. 우리는 레티놀을 양성 대조군으로 사용했습니다. FLG 및 TGM{14}}의 전사 수준은 최대 10μM 농도에서 Q{15}}G로 처리한 후 현저하게 증가했습니다(그림 3d). 이러한 발견은 Q{18}}G가 HaCaT 세포에서 피부 보습 활성을 가지고 있음을 시사합니다. 또한 SB203580(p38 억제제), SP600125(JNK 억제제), UO126(ERK 억제제) 및 Bay{23}}(NF-kB 억제제)를 사용하여 보습에 MAPK 및 NF-kB 신호 전달 경로의 관련성을 조사했습니다. Q{26}}G 처리 HaCaT 세포의 인자. O{28}}G 유도 유전자 발현에 기초하여 JNK 억제제인 SP600125 처리에 의해 TGM{30}}과 FLG의 수준이 모두 감소했으며(그림 3e), 이는 JNK가 발현을 증가시키는 데 필요함을 시사합니다. O-3-G의 피부 보습 효과 측면에서 TGM-1 및 FLG의 또한 IKK 및 IkB의 억제제인 Bay{35}}에 의해 FLG 발현도 감소하여 Q{36}}G의 약학적 기전도 NF-kB 신호 전달 경로에 속할 수 있음을 시사합니다.
2.3.AP-1 및 NF-kB의 활성화를 통한 Q-3-G의 보습 관련 신호 경로
이전 mRNA 결과를 기반으로 Q-3-G의 수화 효과에 대한 AP{0}} 및 NF-kB 신호전달의 관련이 단백질 수준에서도 발생할 수 있다고 가정했습니다. Western blot assay를 사용하여 AP-1와 NF-kB 상류 분자의 인산화를 조사했습니다. 먼저 AP-1 경로에서 HaCaT 세포와 Q{7}}G를 24시간 동안 배양한 후 c-Jun의 인산화가 증가했습니다(그림 4a). p-INK의 수준은 2.5,5 및 10μM 농도의 Q{11}G 처리 후에도 증가했습니다. JNK의 전체 형태는 변경되지 않았습니다(그림 4b). JNK의 상위 조절자인 MKK4 및 TAK{18}}의 인산화를 추가로 조사했습니다. 그림 3c에서 볼 수 있듯이 HaCaT 세포에 O{20}}G를 처리한 후 p-MKK4와 p-TAK1의 단백질 수준도 상향 조절되었습니다.
NF-kB 신호 전달 외에도 Q{1}}G는 NF-kB의 소단위인 p50과 p65의 인산화를 증가시켰습니다(그림 4c). 또한 IKK 및 IkBa의 활성화를 평가했으며, 이 역시 대조군과 비교하여 Q-3-G에 의해 최대 10uM까지 증가했습니다(그림 4d). 결국, 우리는 NF-kB 신호 전달 경로에 관여하는 상류 분자의 활성화를 결정했습니다. Src와 Akt(Ser473)의 인산화는 O{11}}G 처리에 의해 강화되었습니다(그림 4e). 전반적으로 이러한 데이터는 Q{13}}G의 피부 보호 효과가 단백질 수준을 증가시켜 TAK1 및 Src 활성화를 표적으로 하여 AP{15}} 및 NF-kB의 활성을 각각 상향 조절함을 나타냅니다.
2.4.AP-1 및 NF-kB의 전사 활성화에 대한 Q-3-G의 영향
우리는 MTT 분석을 통해 인간 배아 신장 세포주 HEK293T 세포에서 Q{0}}G의 세포 독성을 조사했습니다(그림 4f). HEK293T 세포의 생존력은 처리되지 않은 세포와 비교하여 Q-3-G(2.{6}} μM) 처리 후 크게 영향을 받지 않았습니다.
우리는 Q{0}}G가 NF-kB 및 AP{2}} 프로모터 분석을 조절할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 루시퍼라제 분석을 사용했습니다. O-3-G가 AP-1-매개 루시퍼라제 활성(그림 4g)과 NF-kB 매개 루시퍼라제 활성(그림 4h)을 농도 의존적으로 증가시키는 것을 확인했습니다. 이러한 결과는 AP 활성화 및 NF-KB 활성화가 Q{12}G의 중요한 약리학적 표적임을 입증합니다.
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