Gao-Zi-Yao는 늙은 자발성 고혈압 쥐의 학습 및 기억 기능을 향상시킵니다. 2부
Feb 19, 2024
실험동물
12개월령과 8주령 수컷 자발성 고혈압 쥐(SHR)를 난징 동물 모델 센터에서 구입했습니다.
8-주령 수컷과 기억력 사이에는 강한 관계가 있습니다. 이 기간 동안 수컷 생물의 뇌는 빠르게 발달하고 뉴런 사이의 연결이 점차 증가하여 기억력 발달에 영향을 미칩니다.
연구에 따르면 수컷 생물의 기억력은 나이가 들수록 계속해서 좋아집니다. 이는 생존과 번식에 큰 영향을 미칠 뿐만 아니라 환경에 더 잘 적응하고 새로운 도전에 대처하는 데에도 도움이 됩니다.
그러므로 우리는 젊은 남성들이 퍼즐 풀기, 새로운 기술 배우기, 새로운 영역 탐구 등 다양하고 유익한 활동에 참여하도록 적극적으로 격려해야 합니다. 이러한 활동은 두뇌를 자극하여 더 빠르게 발달하고 기억력을 향상시킵니다.
동시에 우리는 젊은 남성 생명체들에게 적합한 환경과 분위기도 제공해야 합니다. 아이들이 안전하고 친근하다는 느낌을 갖게 하면 두뇌 발달이 촉진되고 기억력이 향상될 수 있습니다.
간단히 말해서, 우리는 젊은 남성이 기억력을 향상시켜 더 똑똑하고 자신감 있고 유능한 생물이 되도록 돕기 위해 최선을 다해야 합니다. 이는 개인의 발전뿐만 아니라 종 전체의 번영과 생존에도 도움이 됩니다. 기억력 향상이 필요하다는 것을 알 수 있는데, 시스탄체 데저티콜라에는 항산화, 항염증, 항노화 효과가 있어 뇌의 산화 및 염증 반응을 감소시켜 뇌를 보호할 수 있기 때문에 기억력을 크게 향상시킬 수 있습니다. 신경계의 건강. 또한 Cistanche Deserticola는 신경 세포의 성장과 복구를 촉진하여 신경 네트워크의 연결성과 기능을 향상시킬 수 있습니다. 이러한 효과는 기억력, 학습 및 사고 속도를 향상시키는 데 도움이 될 수 있으며 인지 기능 장애 및 신경퇴행성 질환의 발병을 예방할 수도 있습니다.
이 모델에서 고혈압은 생후 4개월에 발병하기 시작하며, 뇌 미세혈관의 고혈압 관련 변화는 생후 6개월에 나타납니다[37].
쥐는 표준 위생을 갖춘 최적의 조건에서 사육되지 않았고, 12/12 명암 주기로 25도 온도로 유지되었으며, 표준 쥐 먹이와 물을 자유롭게 먹였습니다.
모든 절차는 이전 보고서[35]와 일치하는 SoochowUniversity에서 확립한 동물 관리 및 사용에 대한 지침에 따라 승인되고 수행되었습니다.
실험은 국립보건원(National Institutes of Health)의 실험실 동물 사용 지침(NIH, 간행물 번호 85-23, 1996년 개정)에 따라 수행되었습니다. 현재 연구는 ARRIVE 지침에 의해 보고됩니다.
노화 조절을 위해 8주령 SHR을 적용하였다(SHR-Young, n=10). 12개월 된 쥐에게 Gao-Zi-Yao를 첨가하거나 첨가하지 않고 증류수(Old SHR-C, n=10), 저용량(Old SHR-L, n=10), 중용량으로 처리했습니다. (Old SHR-M, n=10), 위 영양에 의한 고용량(Old SHR-H, n=10).
저, 중, 고 Gao-Zi-Yao의 복용량은 1/2-, 1-에 해당하며 임상 환자 적용을 위한 3배 복용량은 신체 표면적에 따라 계산됩니다. Gao-Zi-Yao를 도포 전 증류수 5mL에 녹인 후 4주 동안 1회 유제품을 투여했습니다.
혈압과 심박수는 tail-cuff 방법으로 매주 모니터링하였고, 체중도 이전 관찰에 따라 매주 모니터링하였다[35].
4주 후 모리스 수중 미로 실험을 실시하고 펜토바르비탈나트륨(50 mg/kg ip)으로 마취하여 쥐를 희생시킨 후 해마 조직을 채취하여 추가 분석을 실시하였다. 모든 실험 프로토콜은 Soochow University 윤리 라이센스 위원회의 승인을 받았습니다.
모리스 수중 미로 실험
Morris 수중 미로 실험(BW-MWM101, Shanghai Bio-will Co., Ltd., Shanghai, China)은 이전에 설명한 대로 일부 수정을 거쳐 수행되었습니다[38]. 테스트는 6일 동안 계획되었으며, 1~5일은 훈련 기간, 6일은 테스트 결과입니다.
쥐는 2분 동안 유제품 훈련을 받았고 플랫폼 탑승 시간을 대기 시간으로 기록했습니다. 6일째에 플랫폼이 제거되었습니다. 쥐를 가장 먼 사분면에 배치하고 수영 궤적을 2분 동안 기록했습니다.
학습 및 기억 기능에 대한 매개변수는 소프트웨어에 의해 계산되었습니다.
ELISA를 통한 NO 및 염증 인자의 혈청 수준 측정
NO(카탈로그 번호: S0023), IL-1(카탈로그 번호: A301BH80153), IL-2(카탈로그 번호: A31038348), IL-6(카탈로그 번호: A30681042)의 혈청 수준 및 TNF-(카탈로그 번호: A38280855)는 시판되는 ELISA 키트(Biotechnology Co., Ltd. Shanghai Enzyme Research, Shanghai, China)를 사용하여 측정되었습니다. 모든 단계는 제조업체의 지침에 따라 수행되었습니다.
니슬 염색
쥐의 해마 조직을 분리하고, 고정하고, 파라핀 포매한 다음, 1% 톨루이딘 블루 염색 용액에 실온에서 5~10분 동안 배양했습니다. 10개의 절편을 증류수로 헹구고 95% 에탄올에 5~30분 동안 담근 후 100% 에탄올에 탈수시켰다.
탈수 후, 슬라이스를 자일렌에 넣고 수지 매체를 사용하여 덮었습니다. ImageJ 분석 프로그램을 이용하여 해마 CA1, CA2 및 치상회(DG) 영역의 뉴런 수를 관찰하고 분석하였다.
학습 및 기억 관련 단백질에 대한 웨스턴 블롯
학습 및 기억 관련 단백질에 대한 웨스턴 블롯은 일부 수정을 거쳐 이전 보고서에 설명된 대로 수행되었습니다[39].
해마 조직을 페닐멘탄술포닐 플루오라이드(R&D Systems Inc., Minneapolis, US)를 함유한 RIPA 완충액(50 mmTris, 150 mM NaCl, 1% Triton-X-100, pH 7.0)으로 균질화했습니다. 균질액을 12000 × g에서 10분 동안 4도에서 원심분리했습니다.
세포 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고 PVDF 막(Hybond TM-ECL; AmershamPharmacia Biotech, Inc.)으로 옮겼습니다. 막을 PBS 중 5% 무지방 우유 및 실온에서 0.1% Tween-20으로 차단했습니다.
그런 다음 블롯을 1차 항체와 함께 배양했습니다: 항-글루타메이트 수용체 1(1:1000, Abcam, Inc., 카탈로그 번호: ab183797), AntiNMDAR2B 항체(1:1000, Abcam, Inc., 카탈로그 번호: ab28373), 항-포스포 - CaMKII 항체(1:1000, Abcam, Inc., 카탈로그 번호: ab171095), Antiphospho-CREB 항체(1:1000, Abcam, Inc., 카탈로그 번호: 32096) 또는 항-GAPDH(Santa Cruz Biotech,Inc., 카탈로그 번호: sc-47724).
다음으로, 막을 2차 항체(HRPconjugated anti-rabbit Ig-G, 1:2000, Abcam, Inc. Catalog No: ab205718)와 함께 1시간 동안 배양했습니다. 그런 다음 TBS-T를 사용하여 막을 15분간 3회 세척하여 과잉 항체를 제거한 후 화학발광 시약(ECL, R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)과 함께 1분간 배양했습니다.
또한, 전기영동 겔 분석 시스템(GL2200 Pro, Crestream Inc. USA)을 통해 면역반응 밴드를 검출하였다. 밴드의 강도는 Image J 소프트웨어로 분석되었습니다. 표적 단백질의 양은 GAPDH 발현으로 표준화되었습니다 [39].
통계 분석
통계 분석에는 SPSS 18.0 소프트웨어가 사용되었습니다. 데이터는 평균±SEM으로 표시됩니다. 그룹화된 데이터는 일원 분산 분석에 이어 Student-Newman-Keuls 테스트를 사용하여 분석되었습니다. Pvalue < 0.05는 이전 보고서 [35]에서 통계적으로 유의미한 것으로 간주되었습니다.
결과
젊은 SHR과 노인 SHR 사이의 수축기 혈압(SBP), 심박수 및 체중
Yong SHR은 처음 2주 동안 이전 SHR에 비해 낮은 SBP를 보였으며 이후 3주 동안 두 그룹 사이에 차이가 없을 정도로 증가했습니다(그림 2A).
반면, 처음 2주 동안은 두 그룹 간 심박수에 차이가 없었으며, 이후 3주 후에는 젊은 SHR이 노인 SHR에 비해 현저히 증가했습니다(그림 2B). Young SHR은 전체 관찰 기간 동안 Old SHR에 비해 체중이 더 낮은 것으로 나타났습니다(그림 2C).
Young SHR과 Old SHR 사이의 Morris 수중 미로 매개변수
해마 의존적 학습과 기억을 확인하기 위해 Morris 수중 미로 실험을 수행했습니다. Old SHR은 Young SHR에 비해 처음 4일 동안 탈출 대기 시간이 더 길었습니다(그림 3A).
목표 사분면을 통과하는 시간은 젊은 SHR보다 oldSHR에서 더 적었습니다(그림 3B).
대상 플랫폼 사분면의 시간 비율은 젊은 SHR에 비해 오래된 SHR이 더 짧았습니다(그림 3C). 사분면의 경로 길이 비율도 기존 SHR에 비해 기존 SHR에서 더 짧았습니다(그림 3D). 이러한 결과는 오래된 SHR이 인지 기능에 장애가 있음을 시사합니다.
젊은 SHR과 오래된 SHR 사이의 해마 뉴런 수
해마의 다양한 영역에 있는 뉴런의 수는 Nissl 염색으로 계산되었습니다. 결과는 젊은 SHR에 비해 오래된 SHR의 CA1, CA2 및 DGregions에 더 적은 수의 뉴런이 있음을 보여주었습니다(그림 4).
젊은 SHR과 노인 SHR 사이의 해마에서 학습 및 기억 관련 단백질 발현
Western blot 결과는 오래된 SHR 해마에서 학습 및 기억 관련 단백질(GluR1, NMDAR 2B, 인산화된 CaMK II 및 인산화된 CREB)의 발현이 젊은 SHR 해마에서보다 낮음을 보여주었습니다(그림 5).
Gao‑Zi‑Yao가 오래된 SHR의 SBP, 심박수 및 체중에 미치는 영향
Gao-Zi-Yao가 SBP에 미치는 영향을 분석했습니다. 저용량 Gao-Zi-Yao 치료는 대조군과 비교하여 2주부터 4주차까지 Old SHR의 SBP를 현저하게 감소시켰으며, Gao-Zi-Yao의 중간 및 고용량은 첫 주부터 4주차까지 Old SHR의 SBP를 현저하게 감소시켰습니다. 4주차는 대조군의 기존 SHR과 비교되었습니다(그림 6A). 이러한 결과는 Gao-Zi-Yao가 SHR에서 항고혈압 효과를 발휘한다는 것을 나타냅니다.
또한 Gao-Zi-Yaoon 심박수와 체중의 효과에 대한 데이터를 비교했습니다. 우리의 데이터는 전체 관찰 기간 동안 모든 그룹에서 심박수와 체중에 큰 차이가 없음을 보여주었습니다(그림 6B, C).
오래된 SHR에서 Gao-Zi-Yao가 NO, IL-1, IL-2 및 TNF-의 혈청 수준에 미치는 영향
중간 및 고용량 GAO-ZIYAO 처리는 SHR 대조군의 수준과 비교하여 혈청 NO 수준을 증가시켰습니다(그림 7A). 테스트된 모든 용량의 GAO-ZI-YAO 처리는 SHR 대조군의 수준과 비교하여 IL-1, IL-2의 혈청 수준을 감소시켰습니다(그림 7B, C). 그러나 GAO-ZI-YAO의 높은 투여량만이 TNF-의 혈청 수준을 억제했습니다(그림 7D).
이러한 결과는 GAO-ZI-YAO가 산화 스트레스와 염증을 조절할 수 있음을 보여줍니다.
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