Glochidion Littorale 잎 추출물은 DAF-16 활성화를 통해 꼬마근선염에서 신경 보호 효과를 나타냅니다.

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추상적인:태국과 동아시아의 민간 요법에 사용되는 많은 식물은 추출물의 높은 생체 활성으로 인해 관심을 끌고 있습니다. 이 연구의 목적은 태국에서 발견된 20가지 식물의 식용 잎 추출물을 선별하고 가장 생리활성이 높은 샘플의 잠재적인 신경 보호 효과를 조사하는 것이었습니다. 총 페놀 및 플라보노이드 함량과 2,{2}}디페닐{3}}피크릴히드라질라디칼 소거 활성이 20가지 모든 잎 추출물에 대해 측정되었습니다. 이러한 분석에 기초하여, 테스트된 모든 매개변수에서 높은 값을 보인 Glochidionlittorale 잎 추출물(GLE)은 다음 실험에서 신경퇴화에 대한 효과를 평가하는 데 사용되었습니다.Caenorhabditis elegans. GLE 처리는 활성 산소 종의 축적을 약화시키고 1-메틸{3}}페닐피리디늄 유도 신경변성으로부터 벌레를 보호함으로써 H2O{1}}유도 산화 스트레스를 개선했습니다. 관찰된 신경 보호 효과는 전사 인자 DAF-16의 활성화와 관련이 있을 수 있습니다. LC-MS로 이 추출물의 특성을 규명한 결과 미리세틴, 쿠메스트린, 클로로겐산, 헤스페리딘을 포함한 여러 페놀 화합물이 확인되었습니다.신경보호. 이 연구는 파킨슨 증후군과 같은 신경 퇴행성 질환에 대한 치료법을 개발하는 데 사용될 수 있는 GLE의 새로운 신경 보호 활성을 보고합니다.

키워드: Caenorhabditis elegans; 잎 추출물;신경보호; 항산화 활성; DAF-16

1. 소개 

알츠하이머병 및 파킨슨병(PD)을 포함한 신경퇴행성 장애는 글로벌 의료 기관에 주요 건강 및 재정적 문제를 제기합니다[1]. 산업화된 국가에서 지난 수십 년 동안 인간의 수명이 증가했지만 노화 관련 질병의 유병률도 증가했습니다. 신경학적 장애와 같은 후기 발병 장애의 발병률은 향후 수십 년 동안 급격히 증가할 것으로 예상됩니다. 따라서 신경퇴행성 질환을 치료, 예방 또는 적어도 발병을 지연시킬 수 있는 가능성이 있는 화합물에 대한 연구를 장려하고 임상 시험을 수행하는 것이 중요합니다[2]. PD의 특징 중 하나는 흑색질에서 도파민성(DA) 뉴런의 점진적 손실입니다[3]. PD 병인에서 활성산소종(ROS)의 증가된 생산은 DA 세포의 손실에 중요한 역할을 합니다[4]. 따라서 산화 스트레스의 감소는 PD 치료에서 유망한 치료 접근법으로 간주됩니다[5]. 미토콘드리아 복합체 I 활성을 억제하는 1-메틸-4-페닐피리디늄(MPP plus)은 인간과 동물 모델에서 PD 유사 증상을 유발할 수 있습니다[6].

의 사용Caenorhabditis elegans생체 내 모델은 PD 연구에서 특정 이점을 제공합니다[7]. 선충은 간단하고 저렴하며 수명 주기가 짧습니다. 대규모 분석과 관련된 연구를 지원합니다. 또한 C. elegans의 신경망이 완전히 매핑되었습니다. 8개의 DA 뉴런과 PD 관련 상동 유전자를 포함합니다[8]. 파킨슨병 증상을 모방하는 신경변성은 MPP 플러스와 같은 신경독으로 치료를 통해 C. elegans에서 유도될 수 있습니다[9].
천연 항산화 화합물은 동물 모델에서 신경 보호 효과가 있고 독성이 낮기 때문에 신경 퇴행성 질환을 치료하기 위한 약물 개발에 매력적인 소스입니다[3]. 폴리페놀은 인간의 식단에서 가장 풍부한 항산화제 중 하나로 알려져 있습니다[10]. 또한 산화 과정이 신경변성, 암, 당뇨병, 심혈관 및 항염증성 질환을 포함한 많은 병리학에 관여한다는 것이 확인되었습니다. 따라서 천연 공급원에서 항산화 특성을 나타내는 폴리페놀을 찾는 것은 이러한 병리를 예방하거나 치료하는 데 기여할 수 있습니다. 이 연구는 태국에서 발견되는 식물의 식용 잎 추출물에 초점을 맞췄습니다. 태국 북부와 남부에서 널리 재배되는 대부분의 품종은 일반적인 부상과 질병에 대한 민간 요법으로 사용되었습니다. 그러나 신경 보호 효과에 관한 보고서는 거의 없습니다.
이 연구에서 우리는 먼저 태국에서 재배된 20개 식물의 식용 잎 추출물을 선별하고 페놀 및 플라보노이드 함량과 2,{2}}디페닐{3}} 피크릴히드라질(DPPH) 라디칼 소거 활성을 평가했습니다. 모든 시험 변수에서 높은 값을 보인 Glochidion littorale leaf extract(GLE)의 효과를 신경변성이 있는 C. elegans에 대해 평가하였다. 또한, GLE의 주요 성분의 확인과 함께 GLE의 신경 보호 효과에 관련된 잠재적인 경로를 조사했습니다.
전사 인자 DAF-16가 산화 스트레스 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있기 때문에[11], GLE가 DAF-16를 표적으로 할 수 있다는 가설이 세워졌습니다. DAF{4}} 기능 상실 돌연변이 균주인 C. elegans 균주 CF1038을 사용하여 GLE를 처리한 벌레와 처리하지 않은 벌레의 생존율을 측정했습니다. H2O2-유도 산화 스트레스에서 GLE 처리는 형질전환 벌레의 생존율을 증가시키지 않았습니다(그림 1C).

2. 결과

2.1. 태국 식물 잎의 스크리닝

태국에서 재배된 식물의 식용 잎의 조 추출물을 초음파 처리하여 준비했습니다. 20개 식물의 잎 추출물을 DPPH 라디칼 소거 분석을 통해 페놀 및 플라보노이드 함량 및 항산화 활성에 대해 스크리닝했습니다. Glochidion sphaerogynum 및 Mentha piperita와 같은 테스트된 샘플 중 일부는 낮은 페놀 및 플라보노이드 함량으로 높은 라디칼 소거 활성을 갖는 것으로 밝혀진 반면, Clinacanthus nutans 및 Ocimum × citriodorum과 같은 특정 샘플은 반대 경향을 나타냈습니다(표 1 ). G. littorale의 잎 추출물은 높은 DPPH 라디칼 소거 활성과 높은 페놀 및 플라보노이드 함량을 나타냈다. 따라서 G. littorale과 관련된 생체 활성을 추가로 조사했습니다.

2.2. C. Elegans에서 DAF-16를 통한 산화 스트레스에 대한 GLE 강화된 내성

산화 스트레스 하에서 N2 벌레의 생존에 대한 GLE의 효과를 조사했습니다. H2O2(5mM) 처리는 대조군에서 75%의 사망을 유도한 반면, 5{11}} µg/mL 및 더 높은 농도의 GLE를 사용한 공동 처리는 높은 생존율과 관련이 있었습니다(그림 1A). 테스트한 GLE 농도 중 100μg/mL 및 200μg/mL가 가장 높은 생존율과 관련이 있었습니다(각각 82.0% 및 88.2%). 따라서 이 두 농도는 후속 실험에 사용되었습니다. 생체 내에서 GLE의 항산화 효과를 평가하기 위해, 세포내 ROS 생성을 검출하기 위한 잘 알려진 형광 프로브인 2',7'-dichlorodihydroflfluorescein diacetate(H2DCF-DA)를 사용하여 야생형 선충에서 세포내 ROS 수준을 측정하였다. GLE 처리군에서 형광 강도의 현저한 감소가 미처리군에 비해 관찰되었으며(그림 1B), GLE의 항산화 특성을 확인시켜줍니다.

2.3. GLE 치료는 MPP의 치사율을 감소시켰으며 C. Elegans에서 DAF를 통해 유도된 DA 신경독성-16 C. elegans에는 8개의 DA 뉴런이 있습니다[8]. 이러한 DA 뉴런의 선택적 퇴화는 MPP 플러스에 노출된 후 평가되었습니다. 0.75mM MPP 플러스로 야생형 N2 벌레를 처리하면 생존율이 현저하게 감소했습니다(그림 2). 그러나 GLE와 함께 치료하면 벌레의 생존이 크게 증가했습니다. daf{12}} 돌연변이 벌레에 대한 GLE 처리의 효과를 조사했습니다. 그림 3과 표 2에 나타난 바와 같이, GLE 처리는 대조군에 비해 MPP 플러스에 노출된 후 이들 벌레의 생존을 증가시키지 않았다. 이러한 결과는 DAF{15}}가 C. elegans에서 GLE의 신경 보호 효과를 매개하는 데 필요할 수 있음을 시사합니다. 다음으로, DAF{16}} 기능 상실 돌연변이 균주인 CB1370을 사용하여 관찰된 신경보호 효과에 DAF{20}}가 관여하는지 여부를 확인했습니다. 그림 4 및 표 3에서 볼 수 있듯이 GLE를 처리한 daf{23}} 돌연변이 벌레에서 중앙값 및 최대 생존율이 유의하게 증가했습니다.

2.4. DAF-16 현지화에 대한 GLE의 영향

DAF{0}} 활성화는 핵 축적에 의해 조절된다는 것이 입증되었습니다[12]. 그 후, 우리는 GLE가 DAF-16::GFP 융합 단백질을 발현하는 형질전환 균주 TJ356에서 DAF{2}}의 핵 축적을 유도할 수 있는지 여부를 조사했습니다. 결과는 100 µg/mL GLE와 함께 48시간 배양 후 핵에서 DAF-16의 녹색 형광 강도가 처리되지 않은 그룹과 비교하여 크게 증가한 것으로 나타났습니다(그림 5).

2.5. GLE의 식물화학적 특성화

LC-MS는 GLE의 파이토케미컬을 프로파일링하기 위해 수행되었으며 그 결과는 그림 1에 나와 있습니다.6. 크로마토그래피 피크는 분자 이온 피크의 m/z 값 검색을 기반으로 MS 데이터를 데이터베이스와 비교하여 식별되었습니다. 포지티브 모드 [M 플러스 H]...을 더한. 결과적으로 myricetin, coumestrin, chlorogenic acid, hesperidin이 주요 화합물로 검출되었다.4).

3. 토론

식물 추출물은 천연 생리 활성 화합물의 풍부한 공급원입니다. 많은 연구에서 태국을 비롯한 동남아 국가에서 사용되는 식물 추출물을 평가했으며 이러한 추출물은 민간 요법의 구성 요소입니다[13,14]. 본 연구에서는 태국산 식용 식물 잎 20개의 추출물을 선별하였으며, 페놀 함량, 플라보노이드 함량 및 라디칼 소거 활성이 높은 G. littorale을 추가 조사 대상으로 선택하였다. 여러 연구에서 Glochidion 속의 다양한 종을 조사했습니다[15-19]. 그러나 G. littorale의 기능적 특성과 구성성분에 관한 연구는 거의 없다. 우리의 데이터는 GLE가 세포 내 ROS 축적을 감소시켜 H2O{7}}유도 산화 스트레스로부터 C. elegans를 보호한다는 것을 보여주었습니다. 이는 강력한 항산화 활성을 갖는 것으로 알려진 플라보노이드와 같은 페놀 화합물의 함량이 높기 때문일 수 있습니다[20]. 이러한 결과는 Duangjan et al. (2019), G. zeylanicum 잎 추출물이 C. elegans를 산화 스트레스로부터 보호할 수 있음을 보여주었습니다[21]. 인슐린/인슐린 유사 신호 전달(IIS) 경로는 C. elegans의 성장, 스트레스 반응성 및 수명을 조절합니다[22,23]. 우리는 GLE로 처리된 daf{14}} null 돌연변이 C. elegans가 산화 스트레스에 취약하다는 것을 발견했습니다. 이 결과는 선충의 산화 스트레스 감소에 있어서 GLE의 항산화 효과가 라디칼 소거 활성뿐만 아니라 DAF 전사 인자의 조절에도 관여할 가능성이 있음을 시사합니다.

C. elegans에서 MPP+유도 독성에 대한 GLE의 보호 효과를 조사하였다. 선충의 DA 뉴런은 주로 포유동물에서 유사하게 관찰되는 고친화성 DA 수송체를 통해 MPP 플러스를 흡수합니다. 뉴런 내부의 MPP 플러스 축적은 호흡 사슬의 미토콘드리아 복합체 I을 비활성화하고 세포 사멸을 유도합니다[24-27]. GLE 처리는 야생형 벌레에서 MPP + 처리와 관련된 치사율을 유의하게 감소시키는 것으로 밝혀졌습니다. IIS 경로는 C. elegans의 DAF{6}} 수용체를 통해 인슐린 유사 펩타이드에 의해 조절됩니다[28]. 정상적인 조건에서 IIS 경로는 DAF-16의 인산화를 억제하고 핵 전위를 방지합니다. daf-2 null 돌연변이에서 GLE 처리군은 대조군보다 더 오래 생존했습니다. 대조적으로, 대조군과 daf{12}} null 돌연변이 벌레를 포함하는 GLE 처리군 사이에는 생존의 차이가 관찰되지 않았습니다. 하향조절된 DAF{13}} 신호전달은 DAF{14}}가 핵으로 진입하는 것을 촉진하여 표적 유전자의 발현을 상향 조절하고 스트레스 저항성과 수명을 조절할 수 있는 것으로 알려져 있습니다[29]. 이것은 GLE로 처리된 daf{16}} 돌연변이 벌레가 상대적으로 높은 생존율을 보인 이유를 설명할 수 있습니다. 또한 GLE로 처리한 벌레에서 DAF{17}}의 핵 축적 증가가 형질전환 TJ356 DAF{19}}::GFPC를 사용하여 관찰되었습니다. 엘레강스. 누적적으로 이러한 결과는 GLE가 DAF의 활성화를 통해 신경 보호 효과를 나타낼 수 있음을 나타냅니다{20}}.

4.3. 총 페놀 함량 Folin-Ciocalteu 방법을 사용하여 총 페놀 함량을 결정했습니다. 간단히 말해서, 11.4 μL의 추출물(1 mg/mL)을 227.3 μL의 2%(w/v) Na2CO3 용액과 혼합한 다음 혼합물을 실온에서 2분 동안 방치하였다. 11.4μL의 10%(v/v) Folin-Ciocalteu 시약을 첨가한 후. 암실에서 인큐베이션은 30분 동안 수행하였다. 이어서, 마이크로플레이트 리더(미국 매사추세츠주 월섬 퍼킨엘머, 니보 3F 멀티모드 플레이트 리더)를 사용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 갈산은 검량선의 표준으로 사용되었습니다. 총 페놀 함량은 갈산 당량으로 표시되었습니다(mg 갈산 당량/식물 추출물 g).

4.4. 총 플라보노이드 함량 염화알루미늄 비색법을 사용하여 총 플라보노이드 함량을 측정했습니다. 간단히 말해서, 25μL의 추출물(2mg/mL)을 7.5μL의 5%(w/v) NaNO2용액 및 152.5μL의 증류수와 혼합했습니다. 6분 후, 15μL의 10%(w/v) AlCl3 용액을 첨가하고 5분 동안 방치했습니다. 그런 다음, 50 μL의 1M NaOH 용액을 혼합물에 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 암실에서 15분 동안 인큐베이션하고 마이크로플레이트 리더를 사용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 퀘르세틴을 표준물질로 하여 검량선을 생성하여 총 플라보노이드 함량을 계산하고 그 결과를 퀘르세틴 당량(mg 퀘르세틴 당량/식물 추출물 g)으로 표시하였다.4.5. 자유 라디칼 소거 활성 DPPH 분석을 사용하여 자유 라디칼 소거 능력을 평가했습니다[32]. 간단히 말해서, 100 μL의 추출물(1 mg/mL)을 100 μL의 DPPH 용액과 혼합했습니다. 30분 후, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 DPPH 라디칼의 억제 백분율로 표시되었습니다.

4.10. DAF-16의 핵 국소화 DAF-16-GFP 융합 단백질을 발현하는 형질전환 C. elegans TJ356을 사용하여 DAF-16의 세포내 분포를 조사했습니다. L1기 선충은 2{{30}} ◦C에서 48시간 동안 GLE로 처리하였다. 그런 다음 벌레를 유리 슬라이드의 2% 아가로스 패드로 옮기고 아가로스 패드에 25 µM 아지드화나트륨 한 방울(약 2{34}} µL)을 추가하여 마취했습니다. GFP의 발현은 형광현미경(EVOSflfl; Advanced Microscopy Group, Bothell, WA, USA)을 통해 조사되었다. 핵에서 DAF{12}}의 평균 형광 강도는 Image J 소프트웨어(National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 분석되었습니다. 4.11. LC-MS를 사용한 식물화학적 프로파일링 잎 추출물은 LCMS{16}}(Shimadzu)를 사용하여 분석되었습니다. Q3 스캔 모드를 사용하여 m/z 50–1000 범위에서 질량 스펙트럼을 획득했습니다. 용액을 (A) 0.1% 포름산 및 (B) 구배를 사용하여 40℃의 컬럼 온도에서 Inertsil ODS{20}}(250 × 2.1 mm, 5 µm, GL Sciences, Tokyo Japan)에 주입했습니다. ) 0.1% 포름산을 함유하는 아세토니트릴/물(80/20). 유속이 0.2mL/min인 다음 기울기가 사용되었습니다: 0-100% B(0-45분), 100% B(45-50분) 및 0% B(50-60분). 화합물은 인간 대사체 데이터베이스 및 METLIN 데이터베이스를 포함한 데이터베이스에서 이론적으로 계산된 m/z 값 라이브러리에 실험 m/z 값을 일치시켜 추정적으로 식별되었습니다. 4.12. 통계 분석 데이터는 각 그룹에 대한 평균 ± 표준 편차로 표현되었습니다. 두 그룹 간의 유의한 차이는 t-검정을 사용하여 평가한 반면 3개 이상의 그룹 간의 차이는 일원 분산 분석을 사용하여 평가한 다음 Tukey의 사후 비교 테스트를 사용하여 평가했습니다. 통계적 유의성은 p < 0.001="" 및="" p="">< 0.0001로="" 설정되었습니다.="" 수명="" 분석의="" 경우="" 카플란-마이어="" 생존="" 곡선을="" 사용하여="" c.="" elegans="" 생존을="" 플롯하고="" graphpad="" prism="" 소프트웨어(버전="" 9.01;="" graphpad="" software,="" san="" diego,="" 캘리포니아,="">

Abdel Fawaz Bagoudou 1, Yifeng Zheng 2, Masahiro Nakabayashi 2, Saroat Rawdkuen 3, 박현영 4, Dhiraj A. Vattem 4,5, Kenji Sato 6, Soichiro Nakamura 1 및 Shigeru Katayama 1,2,*

1 신슈대학교 의과대학 과학기술대학원, 8304 Minamiminowa, Kamiina, Nagano 399-4598, Japan;

2신슈 대학 의생명 과학 연구소, 8304 Minamiminowa, Kamiina, Nagano 399-4598, Japan;

3 School of Agro-Industry, Mae Fah Luang University, 333 Moo 1, Thasud, Muang, Chiang Rai 57100, Thailand;{5}}

4 Edison Biotechnology Institute, Konneker Research Laboratories, Ohio University, Athens, OH 45701, USA;

5 건강 과학 및 전문 대학, Ohio University, Athens, OH 45701, USA

6 교토 대학 농업 대학원, 교토 606-8502, 일본;

저자 기여:

저자 기여: 개념화, SR, DAV 및 SK; 조사, AFB, YZ, MN, SR, H.-YP, DAV 및 KS; 쓰기 - 원본 초안 준비, AFB; 쓰기 - 검토 및 편집, SK; 감독, SN 모든 저자는 원고의 출판된 버전을 읽고 동의했습니다.
자금: 이 연구는 외부 자금 지원을 받지 않았습니다.
기관 검토 위원회 성명서: 해당 없음.
사전 동의서: 해당 사항 없음.
데이터 가용성 진술: 데이터는 합당한 요청에 따라 교신 작성자가 사용할 수 있습니다.
이해 상충: 저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
샘플 가용성: 화합물의 샘플은 저자로부터 사용할 수 없습니다.

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