GRP78 과발현은 PINK1-IP3R 매개 신경 보호 미토파지 1부를 유발합니다
Aug 01, 2024
추상적인:
척수 뿌리 박리(RA)의 실험 모델은 신경 표적 분리 후 역행성 신경 퇴행을 유도하는 인과 분자 프로그램을 연구하는 데 유용합니다.
척수근탈출은 환자의 일상생활과 인지능력에 중대한 영향을 미칠 수 있는 치명적인 중추신경계 손상이다. 그러나 다행스럽게도 기억력이 반드시 영향을 받는 것은 아니며 대부분의 환자는 몇 가지 효과적인 인지 재활 방법을 통해 기억력을 향상시킬 수 있습니다.
여러 연구에 따르면 척수 뿌리 절단은 사람의 기억력에 직접적인 영향을 미치지 않지만 주로 주의력, 인지 및 학습을 포함한 환자의 뇌인지 능력에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 이는 척추근탈출의 영향을 받더라도 많은 사람들이 여전히 좋은 기억력을 갖고 있음을 의미합니다.
따라서 척수근탈출증 환자의 경우 인지능력을 향상시키는 것이 기억력 향상의 열쇠입니다. 인지 재활은 환자의 뇌 인지 능력을 재건하여 기억력을 향상시키는 데 도움이 되는 효과적인 방법입니다. 이러한 방법에는 클로즈, 수학 연산 등이 포함되며 환자의 집중력, 민감도 및 반응 속도를 향상시키는 데 도움이 될 수 있습니다.
또한 긍정적인 태도도 기억력 향상에 중요한 요소이다. 척추근탈출 환자는 어려움과 어려움에 직면했을 때 낙관적인 태도를 유지하고 삶의 다양한 도전에 용감하게 맞서서 재활 과정에서 최상의 결과를 얻으려고 노력해야 합니다.
요약하면, 척수 뿌리 절단 손상은 사람의 기억에 직접적인 영향을 미치지 않습니다. 대부분의 사람들은 인지 재활과 같은 효과적인 방법을 통해 기억력을 향상시킬 수 있습니다. 동시에, 낙관적인 태도도 기억력 향상의 열쇠입니다. 재활 과정에서 우리는 어려움을 극복하고 건강한 미래를 향해 한 단계씩 나아갈 수 있다는 것을 굳게 믿어야 합니다. 기억력을 향상시켜야 함을 알 수 있습니다. 시스탄체는 기억력을 향상시키는 것 등 많은 독특한 효과를 지닌 중국의 전통 약재이기 때문에 기억력을 크게 향상시킬 수 있습니다. 시스탄체의 효능은 탄닌산, 다당류, 플라보노이드 배당체 등을 포함한 다양한 활성 성분에서 비롯됩니다. 이러한 성분은 다양한 방식으로 뇌 건강을 증진할 수 있습니다.
이 신경퇴행성 과정은 소포체(ER) 스트레스의 존재 및 자가포식 흐름 차단과 같은 신경 질환 관련 과정과 공통된 특징을 공유합니다.
우리는 이전에 GRP78의 과발현이 RA 후 운동 신경 신경 보호를 촉진한다는 것을 발견했습니다. 그 후, 비교 편견 없는 단백질 분석과 약리학적, 유전적 개입을 수행하여 근본적인 메커니즘을 밝히는 것을 목표로 했습니다.
예기치 않게, GRP78이 과발현될 때 미토콘드리아 인자가 가장 많이 변경되는 것으로 밝혀졌으며, 미토파지의 특징인 삼켜진 미토콘드리아의 풍부함도 GRP78 과발현 후 RA 손상 운동 뉴런에서 전자 현미경으로 관찰되었습니다.
또한, GRP78 과발현은 LC3-미토콘드리아 태깅을 증가시키고, PINK1 전좌 및 미토파지 유도를 촉진하고, ER 스트레스를 받은 세포에서 미토콘드리아 기능을 회복시켰습니다.
마지막으로, 우리는 운동 신경 세포 사망에 대한 시험관 내 모델에서 GRP{0}}촉진된 생존 촉진 미토파지가 PINK1 및 IP3R에 의해 매개됨을 발견했습니다. 이 데이터는 GRP78 샤페론과 미토파지 사이의 새로운 관계를 나타내며, 신경 보호를 달성하기 위한 약물 설계를 위한 새로운 치료 옵션을 제시합니다.
키워드: GRP78/BiP; 미토파지; 운동뉴런; 신경변성; 신경 보호.
1. 소개
기능적 신경 연결의 중단은 신경퇴행성 과정의 일반적인 초기 특징입니다[1]. 축삭 변성은 역행 및 진행성 기능 장애 과정을 통해 굴복하는 뉴런을 분리합니다.
손상이 발생하면 뉴런은 반응하여 펼쳐진 단백질 반응(UPR), 열충격 반응, 자가포식 경로, 유비퀴틴-프로테아좀 시스템, 샤프론 발현, 소포체(ER) 관련 분해 기계와 같은 신경 보호의 내인성 메커니즘을 활성화합니다. (ERAD) 및 항산화 방어.
정확한 활성화가 세포를 회복하는 데 효과적이지만, 과도한 손상과 노화로 인해 해당 프로그램 중 하나 이상이 제대로 기능하지 못할 수 있습니다.
우리는 자연을 모방하고 이러한 내인성 메커니즘을 강화하는 것이 신경 보호를 위한 효율적인 전략이 될 수 있다고 추론했습니다[2,3]. BiP 또는 열 충격 단백질 5a(HSP5a)라고도 알려진 GRP78은 신경 보호의 내인성 메커니즘에서 중요한 기능을 가진 다기능 단백질입니다[4 ]. GRP78은 ER 스트레스 후에 활성화되고 ATPase 활성을 가지며 Ca{7}}결합 단백질인 UPR을 조율합니다[5,6].
또한 새로 합성되거나 잘못 접힌 단백질의 적절한 접힘을 촉진하고 ERAD 기계에 의한 분해를 위해 분해된 단백질을 표적으로 삼는 역할을 합니다([7]에서 검토).
또한 증거에 따르면 GRP78은 접히지 않은 단백질과 기능 장애가 있는 세포소기관의 수용성 형태와 응집 형태를 모두 제거하는 거대자가포식을 유발하는 데 참여한다는 사실이 제시됩니다[8-15].
GRP78의 과발현은 신경퇴행의 여러 모델에서 신경보호 효과가 있는 것으로 입증되었으며[16-23], GRP78 수준의 감소는 노화 동안 및 퇴행성 질환의 진행 전반에 걸쳐 관찰되었습니다[24].
이들 연구 중 일부는 신경보호가 세포사멸의 억제에 의해 매개된다고 보고했습니다. 그러나 세포사멸이 신경변성 과정 중 신경 세포 사멸의 주요 원인이 되는 경우는 거의 없습니다 [20,25-27].
따라서 우리의 주요 목표는 신경퇴행의 비형질전환 모델을 사용하여 GRP78 과발현이 신경보호를 유도하는 메커니즘을 확립하는 것입니다.
특히, 척추 운동뉴런(MN) 축삭절단술의 여러 모델의 해부학적, 기술적 장점을 활용하여 우리는 이전에 신경근 박리(RA)가 운동 신경퇴행(부상 후 한 달 동안 MN 손실의 80%)의 역행 과정을 시작한다고 보고했습니다. ER 스트레스, 자가포식 플럭스 차단, 소포 및 단백질 수송 정지의 존재, 세포사멸/항아자멸사/아노이키신 개시의 동시 발생 그러나 효과적인 세포사멸 실행의 부재[20,25,28].
우리는 손상된 MN 내에서 RA 후 약 5일 후에 GRP78의 발현이 소실되고 강제 과발현으로 인해 축삭 절개 후 생존이 가능하다는 사실을 발견했습니다. 이전에 올바른 자가포식 분해가 RA 이후 뉴런 생존을 증가시킨다고 설명한 것처럼[26], 선택적 자가포식이 보호 효과를 가질 수 있는지 해독하는 것이 가능한지 궁금합니다.
따라서 우리는 RA 모델을 사용하여 편향되지 않은 단백질체학 분석을 사용하여 GRP78 신경 보호를 중재하는 메커니즘을 명확히 하고 RA 모델의 두 가지 주요 특징인 ER 스트레스와 단백질 밀매 정지를 모두 유발하는 튜니카마이신 처리를 사용한 시험관 내 깊이 분석을 통해 결과 가설을 추가로 검증했습니다. [26].
2. 재료 및 방법
2.1. 수술 절차
12주령의 Sprague-Dawley 암컷 쥐를 빛과 온도의 표준 조건하에 두었고 음식과 물을 자유롭게 제공했습니다. 우리는 기본적으로 이전에 보고된 대로 케타민/자일라진(0.1mL/100g 중량)의 칵테일을 복강 내로 사용하여 마취 하에 수술 절차를 수행했습니다[26,27].
L4-L5 신경근의 추가 척추 신경근 제거를 수행하기 위해 정중선 피부를 절개하여 좌골 신경의 각 측면을 식별하고 추간공에서 떨어진 선택된 뿌리에 적당한 견인을 적용하여 운동 및 감각 뿌리를 포함하는 혼합 척수 신경을 얻었습니다. 등뿌리 신경절.
상처를 대패로 봉합하고 포비돈요오드로 소독한 후 따뜻한 환경에서 동물을 회복시켰습니다. 가짜 수술을 받은 동물을 대조군으로 사용했습니다.
동물과 관련된 모든 절차는 스페인(Real Decreto 53/2013) 및 유럽(2010/63/UE)에 의해 수행되었으며 카탈로니아 정부의 Departament d'Agricultura, Ramaderia, Pesca, Alimentació i MediNatural(Generalitat de)의 승인을 받았습니다. 카탈루냐) 법안.
2.2. 바이러스 벡터를 이용한 구축, 정제 및 감염
GRP78을 암호화하는 cDNA(ATCC, LGC Promochem, Teddington, UK)를 pAC.CMV 셔틀 벡터에 클로닝했습니다. HEK293 세포에서 상동성 재조합에 의해 재조합 아데노바이러스를 구축하였다.
박테리아 갈락토시다제(Ad{0}}gal)를 발현하는 대조군 아데노바이러스는 CB Newgard(Duke University, Durham, NC, USA)의 기증품이었습니다. 제조업체(Sartorius, Göttingen, Germany)의 지침에 따라 Vivapure AdenoPackTM 20 키트를 사용하여 바이러스를 정제했습니다.
아데노 관련 벡터 구성을 위해 GRP78 cDNA는 CMV 프로모터와 우드척간염 바이러스 반응 요소의 조절 하에 AAV2의 ITR 도메인 사이의 NheI 및 HindIII 사이트에 클로닝되었습니다[29].
AAVrh10 벡터는 HEK293-AAV 세포(Stratagene, Bellingham, WA, USA)를 분지형 폴리에틸렌이민(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)과 다음을 함유하는 플라스미드를 사용하여 삼중 형질감염시켜 이전에 설명한 대로 생성되었습니다[30]. AAV2의 ITR, Rep2 및 Capfor rh10을 포함하는 AAV 헬퍼 플라스미드(미국 펜실베니아주 필라델피아 소재 펜실베이니아 대학 JM Wilson에서 제공) 및 헬퍼 아데노바이러스 유전자를 포함하는 pXX6 플라스미드. 벤조나제 처리(50 U/mL, Novagen, Madison, WI, USA) 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG 8000, Sigma-Aldrich) 침전 후에 재조합 벡터가 명확해졌습니다.
벡터는 표준 운영 절차에 따라 CBATEG-UAB의 벡터 생산 장치에 의해 요오딕사놀 구배로 정제되었습니다. ml당 바이러스 게놈(VG/mL)은 PicoGreen(Invitrogen, Waltham, MA, USA)을 사용하여 정량화되었습니다.
RA 직후, 33-게이지 바늘과 해밀턴 주사기를 사용하여 14μL의 Ad-GRP78 또는 Ad -gal 바이러스(108 pfu/mL)를 요추 부위의 경골강에 주사했습니다.
대안으로, GFP 또는 GRP78을 과발현하기 위해 AAVrh10 아데노 관련 바이러스의 4 x 10-10 바이러스 게놈 10μL를 척수강 내 투여하여 RA 3주 전에 이소플루란으로 마취된 동물의 척추 L3과 L4 사이의 CSF에 천천히 주입했습니다.
AAVrh10은 척수운동뉴런의 30%를 감염시키기 때문에 사용했습니다[32]. 동물꼬리를 튕겨 척수강내 공간에 대한 적절한 접근을 확인했습니다. 바늘을 주사 부위에 1분간 고정시킨 후 근육과 피부를 봉합하였다.
2.3. 샘플 준비 및 단백질체 분석
우리는 쥐(n= 4-5)를 7dpi로 마취하고 L4-L5 척수 세그먼트(길이 5-mm 길이) 샘플을 얻었으며 액체 질소에서 급속 냉동했습니다. 우리는 얼음 위의 Potter 균질화기를 사용하여 용해 완충액(20mM HEPES, pH 7.7, 250mM 수크로스, 1mM EDTA, 1mM EGTA 및 프로테아제와 포스파타제 억제제의 칵테일)에서 조직을 균질화했습니다.
4°C에서 20분간 800×g로 원심분리한 후, 핵 후 분획의 상청액을 수집하고 BCA 분석(Pierce Chemical Co., Dallas, TX, USA)을 통해 단백질을 정량화했습니다.
단백질체학 분석을 위해 각 샘플 75μg을 4% SDS, 8M 요소, 0.1M HEPES, pH 7.7, 0.1M DTT, 0 첨가에 용해시켰습니다. 05 M iodoacetamide를 첨가하고 FASP(Filter Aided Sample Preparation) 방법을 사용하여 트립신(효소:기질 비율 1:10)으로 분해했습니다.
모든 샘플은 병렬로 처리되었습니다. ProxeonEasyLC(Thermo Fisher Scientific)와 연결된 LTQ-OrbitrapVelos 질량 분석기(Thermo FisherScientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 샘플을 분석했습니다. 펩타이드 혼합물을 분석 컬럼(2 µL)에 직접 로드했습니다. ·min-1) 및 5-μm C18 입자(NikkyoTechnos Co., Tokyo, Japan)로 충전된 내경 100μm의 15-cm 컬럼을 사용하여 역상 크로마토그래피로 펩타이드를 분리했습니다.
크로마토그래피 구배는 97% 버퍼 A(물 중 0.1% 포름산(FA)) 및 3% 버퍼 B(아세토니트릴, 0.1% FA)에서 시작되었으며 유속은 500nl입니다. ·min−1, 4분에 걸쳐 85% 버퍼 A + 15% 버퍼 B로 증가하고 120분에 걸쳐 55% 버퍼 A + 45% 버퍼 B로 증가했습니다.
Orbitrap에서 분해능 60000, 질량 범위 m/z 350~2000, 가장 강한 이온 20개의 MS-MS 스펙트럼으로 한 번의 전체 MS 스캔을 사용하여 TOP20 데이터 종속 수집 모드에서 기기를 작동했습니다. . 우리는 충돌 유발 해리 방법으로 이온 트랩을 활용하여 조각 이온 스펙트럼을 생성하고 35%에서 정규화된 충돌 에너지를 사용했습니다. Xcalibur 소프트웨어 v2.1을 사용하여 모든 데이터를 수집했습니다.
우리는 펩타이드 식별 및 정량을 위해 Proteome Discoverer 소프트웨어 제품군(v1.3.0.339, Thermo Fisher Scientific)과 Mascot 검색 엔진(v2.3.01,Matrix Science50)을 사용했습니다.
우리는 가장 일반적인 오염 물질(599개 항목)을 포함하는 SwissProt Rat 데이터베이스에 대해 데이터를 분석했습니다. 우리는 MS1 수준에서 7ppm의 전구체 이온 질량 내성을 사용했으며 트립신에 대해 최대 3번의 잘못된 절단을 허용했습니다.
조각 이온 질량 허용 오차는 0.5 Da로 설정되었습니다. 메티오닌의 산화와 N-말단 단백질 아세틸화는 가변 변형으로 설정되었고, 시스테인 카바미도메틸화는 고정 변형으로 설정되었습니다.
잘못된 발견률(FDR > 5%는 고려되지 않음)을 기준으로 펩타이드를 필터링했습니다. 펩타이드 정량화를 위해 ProteomeDiscoverer를 사용하여 계산된 펩타이드의 크로마토그래피 피크를 고려하고 R 3을 사용하여 log2 변환을 통해 면적을 정규화했습니다.0.2. R 패키지 MSstats(v. 2.0.1)를 사용하여 데이터를 정량화했습니다.
각 비율에 대해 조정된 p-값을 계산했습니다(유의성에 대한 p < 0.05). 마지막으로 DAVID Annotation 웹 도구(https://david.ncifcrf.gov/, 2021년 5월 28일 액세스) 및 KEGG(https://www.genome.jp/kegg/pathway)를 사용하여 규제 단백질에 대한 유전자 존재론 및 경로 분석을 수행했습니다. html, 2021년 5월 28일에 액세스) 이전에 수행한 대로(자세한 내용은 [25] 참조)
2.4. 면역조직화학 및 이미지 분석
펜토바르비탈로 깊은 마취를 한 후, 우리는 10 U/mL 헤파린을 함유한 식염수 용액으로 동물을 경심으로 관류시켰고, 이어서 7 dpi에서 조직 고정을 위해 0.1 M 인산 완충액, pH 7.2에 4% 파라포름알데히드를 주입했습니다(n {{7 }}), 척수의 L4 및 L5 세그먼트(5-mm 총 길이)를 제거하고 동일한 고정액에 4시간 동안 후 고정하고 30% 자당에 밤새 냉동보관했습니다.
일련의 횡단면(두께 {{0}}μm)을 극저온(Leica, Wetzlar, Germany)을 사용하여 젤라틴화된 슬라이드에서 얻었고 분석할 때까지 -20 ◦C에 보관했습니다. 면역조직화학을 위해 슬라이드를 0.03% TritonX-100 및 10% 소 혈청이 포함된 Tris 완충 식염수(TBS)의 차단 용액으로 1시간 동안 처리한 후 다른 1차 항체인 토끼 항-LC3B(ab51520; Abcam)와 함께 배양했습니다. ; 1:200) 또는 마우스 항-COXIV(A21355; LifeTechnologies;1:500).
TBS, 0.05% Tween-20으로 여러 번 세척한 후 절편을 Cy-2 또는 Cy-3 접합 당나귀 항토끼 항체와 함께 2시간 동안 배양했습니다(JacksonImmunoresearch, 미국 펜실베니아주 웨스트그로브).
우리는 DAPI(Sigma, St Louis, MO, USA) 또는 NeuroTrace Fluorescent Nissl Stain(Molecular Probes, Leiden, TheNetherlands)을 사용하여 섹션을 대조염색하고 Fluoromount-G 장착 매체(SouthernBiotech, Birmingham, AL, USA)로 슬라이스를 장착했습니다. 핸드메이드 모위올.
비교할 섹션은 같은 슬라이드에서 같은 날 함께 처리되었습니다.
다양한 처리 및 대조군의 척수 샘플 이미지는 공초점 현미경(Zeiss LSM 700)을 사용하여 분석된 각 마커에 대해 동일한 노출 시간, 감도 및 해상도에서 촬영되었습니다. ImageJ 소프트웨어(National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/에서 사용 가능, 2021년 5월 28일 액세스)를 사용하여 신호 강도를 분석했습니다.
For more information:1950477648nn@gmail.com
