초음파 추출을 이용한 땅콩 껍질에서 분리한 생리활성 화합물의 미백 및 주름 개선 효과

연락처:ali.ma@wecistanche.com

감다혜 1, 홍지우 1, 김준희 1, 김진우 1,2,3,*

추상적인:반응 표면 방법론은 땅콩 껍질 추출물의 DPPHradical scavenging activity(RSA), tyrosinase activity inhibitor(TAI) 및 collagenase activity inhibitor(CAI)를 포함한 종속 변수의 동시 최적화를 위해 초음파 보조 추출(UAE) 조건을 최적화하는 데 사용되었습니다. 추출 시간(5.0~55.0 min, X1), 추출 온도(26.0~94.0) 등 주요 변수의 영향 ◦C , X2) 및 에탄올 농도(0.{12}} 퍼센트 ~99.5퍼센트 ,X3)가 최적화되었습니다. 각 조건의 실험값을 바탕으로 최적 조건 예측을 위한 2차 회귀 모델을 도출하였다. 독립변수의 결정계수(R2)는 0.89~0.96으로 회귀모형이 예측에 적합함을 알 수 있다. 중첩법에 의한 최적의 UAE 조건 예측에서는 추출시간 31.2분, 추출온도 36.6℃, 에탄올 농도 93.2%를 확인하였다. 이러한 조건에서 RSA는 74.9%, TAI는 50.6%, CAI는 86.8%로 예측되어 실험값과 잘 일치했습니다. 역전사 중합효소 연쇄 반응은 땅콩 껍질 추출물이 단백질의 mRNA 수준을 감소시키는 것으로 나타났습니다.티로시나제B16-F0 세포의 관련 단백질-1 및 기질 금속단백분해효소-3 유전자. 따라서 우리는 식별피부 미백땅콩 껍질 추출물의 단백질 및 유전자 발현 수준에서의 주름 개선 효과 및 그 결과 땅콩 껍질이 피부 미용에 효과적인피부 미백주름 개선 효과. 이 연구를 바탕으로 부산물로 여겨졌던 땅콩 껍질은 건강식품, 의약품, 화장품 개발에 활용될 수 있다.

키워드:땅콩 껍질; 최적화;피부 미백; 주름 방지; 항산화제;티로시나제; 콜라게나제; 인간 티로시나제 관련 단백질-1(TRP-1); 기질 금속단백분해효소(MMP)

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1. 소개

멜라닌은 표피에 있는 멜라닌 세포의 멜라닌소체에서 합성되는 갈색 또는 검은색 고분자 안료입니다. 주요 기능은 피부를 보호하기 위해 자외선(UV)을 차단하는 것입니다. 또는 과도한 생산은 기미, 두더지 및 검버섯과 같은 색소 침착을 유발할 수 있습니다[1-3]. 티로시나아제는 멜라닌 생합성 과정에서 티로신이 디히드록시페닐알라닌을 통해 도파퀴논으로 전환되고 도파크롬을 통해 멜라닌을 생성하는 자가산화 및 중합 반응을 촉매하는 주요 효소이다[4]. 따라서 멜라닌 생성을 억제하거나 감소시키는 데 널리 사용됩니다.티로시나제화장품의 미백효과를 높이기 위한 활성 [5]. 급속한 산업화와 염화불화탄소의 사용 증가는 지구의 보호 오존층을 심각하게 손상시켜 더 많은 양의 자외선이 지상에 도달하여 피부를 노출시켰습니다. 이러한 UV 복사의 증가는 결과적으로 인체에서 슈퍼옥사이드 음이온, 과산화수소 및 하이드록실 라디칼과 같은 활성 산소종(ROS)의 활성 생성을 유도합니다. 이러한 종은 티로신의 지속적인 산화를 촉진하여 멜라닌 생성을 증가시킵니다. 이와 관련하여 의 억제에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.티로시나제활성뿐만 아니라 ROS의 제거를 개발하기 위해피부 미백에이전트 [6]. 콜라겐은 진피의 90%를 구성하는 주요 세포외 기질입니다. 콜라겐은 피부를 보호하고 탄력을 부여하며 피부의 기계적 강성, 저항, 결합조직의 결합, 세포의 증식과 분화에 관여한다[7]. 콜라겐과 같은 세포외기질을 구성하는 단백질은 MMP(Matrix Metalloproteinase)와 같은 콜라게나아제에 의해 분해되어 주름, 탄력저하, 피부처짐을 유발한다[8]. ROS에 의해 발현되는 다양한 유형의 MMP는 피부 결합 조직인 콜라겐 사슬을 가수분해하고 비정상적인 가교를 일으켜 콜라겐 분해를 증가시키고 주름 형성을 촉진시킨다[9]. 이러한 이유로 ROS 생성 감소를 통한 멜라닌 생성 및 콜라겐 분해 억제는 피부 미백 및 주름 예방을 위한 주요 초점이 되어 왔습니다. -주름 화장품은 최근 몇 년 동안 널리 사용되었습니다. 그러나 이러한 물질은 빛과 열에 불안정하고 피부 자극, 접촉성 피부염 등의 부작용이 있어 사용이 제한적이다[11]. 기존 미백 및 주름개선 성분의 단점을 극복하기 위한 천연 항산화제에 대한 관심이 높아짐에 따라 식물 유래 추출물을 적극적으로 활용하여 피부 친화적이고 안전한 생체 활성 화합물 개발희게 함및 주름 방지 화장품 [12,13].

현재 식물에서 생리활성 화합물을 추출하기 위해 사용되는 다양한 추출 방법이 있습니다. 그러나, 천연자원, 특히 식물로부터 생리활성 화합물의 추출은 주로 용매, 열수 및 속슬렛 추출법을 통해 수행되어 왔으며, 이는 낮은 추출 효율, 성분 분해, 낮은 안정성, 높은 운영 비용 등 다양한 단점을 보였다. [14]. 따라서 최근에는 초음파 보조, 마이크로파 보조 및 초임계 추출을 포함한 추출 방법이 테스트되었습니다[15]. 특히, 초음파는 약 20kHz 이상의 주파수를 갖는 음파로 액체의 압축, 공동화 및 희박한 반응을 일으켜 짧은 시간에 분자 운동을 최대화하여 높은 추출 효율을 얻을 수 있다[16]. 또한 초음파는 추출시간이 짧아 생리활성 화합물의 분해를 최소화할 수 있다는 장점이 있으며, 항산화제로 천연성분을 추출하는 효과적인 방법으로 평가되고 있으며,희게 함, 많은 식물과 허브의 주름 방지 특성 [17]. 추출 조건 최적화는 초음파 보조 추출(UAE)의 효율성을 높이는 데 필수적이며 최적화 프로세스는 실험적 또는 통계적 방법으로 수행할 수 있습니다. 한 번에 하나의 요인만 다변량 실험인 경우 상호작용 효과를 결정하는 데 한계가 있습니다. 한편, RSM은 최소한의 표본을 사용하여 효과적인 실험과 함께 다변량 실험에서 변수 간의 상관 관계에 대한 통계 정보를 제공할 뿐만 아니라 회귀 모델의 유효성과 적합성을 평가하기 위한 중요한 수학적 및 통계적 기법을 제공합니다. 통계 기반 최적화의 경우, 완전 요인 설계, Box-Behnken 설계 및 중심 합성 설계(CCD)와 같은 다양한 RSM 설계가 널리 사용되었습니다. 그 중 CCD는 매우 효율적이어서 최소한의 실행 횟수로 실험 변수 효과 및 전체 실험 오차에 대한 많은 정보를 제공합니다[18]. 따라서 기존의 많은 연구에서 CCD가 프로세스를 개발, 개선 및 최적화하는 데 널리 사용되었습니다. 천연 제품에서 다양한 항산화제 및 기타 대사 산물을 추출하기 위한 조건.

땅콩(Arachis hypogaea)은 콩과에 ​​속하는 한해살이 식물입니다. 한국, 인도, 중국, 미국 등 전 세계 50여 개국에서 자랍니다[19]. 땅콩은 단백질(25%), 지질(47%), 탄수화물(16%)뿐만 아니라 미네랄, 비타민, 니아신, 불포화 지방산, 안돌레산이 풍부한 공급원입니다[20]. 견과류, 버터, 식용유를 포함하여 가공되지 않거나 가공된 제품으로 소비됩니다. 전 세계의 연간 땅콩 생산량은 총 410만 톤으로 추정되며, 땅콩 껍질은 전체 땅콩 무게의 35~40%를 차지한다[21]. 연간 150만 톤 이상의 땅콩 껍질이 부산물로 버려지는 것으로 추산됩니다. 그러나 땅콩 껍질의 일부만이 동물 사료로 사용되며 대부분이 소각 또는 매립되어 폐기 비용과 환경 문제를 야기하고 있다는 점을 감안할 때 부산물 문제를 극복하기 위해서는 땅콩 껍질을 이용한 고부가가치 물질 생산이 필요하다[22 ]. 항산화제에 대한 이전 연구에서는 땅콩 껍질 추출물의 항염 및 항비만 활성이 보고된 바 있다[23,24]. 그러나 아직까지 개선을 위한 기능성 화장품 소재의 생산에 대한 연구는 없다.희게 함땅콩 껍질의 생리 활성 화합물을 사용한 주름 방지 효과. 따라서 본 연구는 땅콩 껍질에서 생리활성 화합물을 초음파 보조추출법(UAE)을 이용하여 추출하여 항산화, 미백, 주름 개선 효과를 확인하고, 나아가 반응표면법(RSM)을 이용하여 최적의 UAE 조건을 제시하고 추출물의 기능성을 증가시켰다. 식품, 화장품, 의료용 원료로의 사용 가능성을 확인하기 위함입니다.

2. 결과 및 논의

2.1. RSM 모델 맞추기

본 연구에서는 UAE에 영향을 미치는 중요한 변수를 결정하기 위해 한 번에 한 요인씩 예비 실험을 통해 추출 온도, 추출 시간 및 에탄올 농도를 CCD의 주요 변수로 선택했습니다(표 1).

그런 다음 3-변수와 5개 수준 CCD를 사용하여 중심점에서 3회 반복 실험을 포함하여 17개의 실험 실행이 구성되었습니다. 설명할 수 없는 변동성의 영향을 최소화하기 위해 실험 순서를 무작위화하여 실험 오류를 최소화했습니다. DPPH 라디칼 소거 활성(RSA)에 대한 실험 및 예측 결과,티로시나제활성 억제(TAI) 및 콜라게나제 활성 억제(CAI)는 표 2에 나와 있습니다.

CCD 실험 조건의 17개 실험 실행과 실험 결과 간의 상관 관계를 결정하기 위해 이 3개 변수의 최적 수준을 예측하는 다중 회귀 모델이 제안되었습니다. 실험 데이터에 다중회귀분석을 적용하여 종속변수(Y)와 시험변수를 다음과 같은 2차 회귀식으로 연관시켰다(Table 3).

분산 분석(ANOVA)은 실험 데이터를 분석하기 위한 통계적 테스트입니다. 분산 구성 요소를 추정하기 위해 모델러의 변수에 대한 가설을 테스트하기 위해 데이터 세트의 총 변동을 특정 변동 소스와 관련된 구성 요소 부분으로 세분화합니다[25]. 반응 표면 분석과 ANOVA를 사용하여 계수를 결정하고, 모델 항의 통계적 유의성을 평가하고, 반응 변수에 대한 전체 영역을 최적화하는 것을 목표로 하는 실험 데이터의 수학적 모델을 맞추었습니다[26]. 모형에서 설정한 바와 같이 회귀 모형에 의한 실험 및 예측 응답 간의 관계를 결정하는 데 사용된 상관 계수(R2)는 0.8862~0.9622의 범위에 있었습니다. 이는 분석된 공정변수가 독립변수의 88.6% 이상을 설명함을 시사한다. Design-Expert 소프트웨어를 사용하여 2차 회귀 방정식의 계수를 계산하고 ANOVA로 모델 적합성을 테스트했습니다. 일항계수값에 따라 이차회귀식을 Table 4에 나타내었으며 독립변수의 주효과 중 우선순위는 에탄올 농도(X3) > 추출온도(X2) > 추출시간(X1)이다.

2.2. RSA에 대한 추출 조건의 영향

Table 2는 UAE 조건에 따른 RSA의 실험 데이터이다. 땅콩 껍질 추출물의 RSA는 7.6%~89.9% 범위에서 측정되었다. 가장 높은 RSA는 다음 추출 조건에서 확인되었습니다. 추출 시간 55.0분, 추출 온도 60.{{1{15}}}} ◦C, 에탄올 농도 5 0.0퍼센트(실행 #1{19}}). 30.{28}} min의 추출 시간, 60.0℃의 추출 온도, 0.0%의 에탄올 농도에서 7.6%의 가장 낮은 RSA를 실험값으로 확인했습니다(Run #13). . 다중회귀분석을 적용하여 실험 데이터와 반응을 2차 회귀방정식으로 연관시켰다(표 3). 통계분석 결과 회귀모형의 R2는 0.9308(p{25}}.0027)로, 이 식이 실험조건 결과의 93.0%를 설명할 수 있어 모형이 매우 유의하고 정확한 예측에 사용될 수 있음을 시사함 응답 기능.

RSA에 대한 다른 변수의 고정 수준에서 개별 UAE 변수의 효과가 예측되고 그림 1a에 나와 있습니다. RSA는 모든 UAE변수가 증가함에 따라 증가했다가 감소하는 경향이 있습니다. 세 가지 UAE 변수 중 에탄올 농도가 RSA에 가장 큰 영향을 미치는 반면 추출 시간과 추출 온도는 RSA에 가장 작은 영향을 미쳤다. 이 결과는 표 4에서와 같이 에탄올 농도가 RSA에 더 유의한 효과(p=0.{12}}002)를 나타냈다는 ANOVA 결과와 일치합니다. RSA에 대한 독립 변수 간의 상호작용 효과는 3D를 사용하여 시각화했습니다. 응답 표면 곡선. 추출 온도 및 추출 시간은 고정된 수준의 에탄올 농도에서 동시에 변경되었습니다(그림 2A). 두 변수(추출 온도 및 시간)가 증가함에 따라 RSA는 최대 수준까지 증가했다가 다시 감소했습니다. 가장 높은 RSA는 56.1℃의 추출 온도에서 얻어졌으며, 따라서 폴리페놀과 같은 항산화 가능성이 있는 생리 활성 화합물의 추출은 최대 56.1℃의 온도에서 리그닌과 같은 식물 벽 성분의 파괴와 함께 증가함을 시사합니다. 그러나 고온에서는 항산화 성분의 분해 또는 중합으로 인해 RSA가 감소하였다. 그림 2B, C는 RSA가 추출 시간이나 온도에 크게 영향을 받지 않는 반면, RSA는 에탄올 농도의 영향을 크게 받는 것으로 나타났으며, 이는 에탄올 농도 61.0%에서 가장 높았고 다시 감소했습니다. 이는 Kim et al.의 Lespedeza cuneata 열수추출 실험과 일치하는 결과이다. RSA는 추출 온도보다 에탄올 농도의 영향을 더 많이 받았고 RSA는 60~70%의 에탄올 농도 범위에서 최대값을 보였다[27]. 이러한 결과는 2성분 용매(물과 에탄올)의 추출 효율이 UAE에서 땅콩 껍질의 단일 용매 추출에 더 효과적임을 나타냅니다.

2.3. TAI에 대한 추출 조건의 영향

티로시나제표피의 기저층에 있는 티로신을 산화시켜 멜라닌 ​​생성을 촉진시키는 효소로 이 효소의 억제는피부 미백 [28]. The TAI of peanut shell extracted via UAE, according to 17 extraction conditions, ranged from 0.34% to 51.8% (Table 2). Based on experimental values, the relationship between independent variables (X1, X2, X3) and the dependent variable (TAI) was modeled using quadratic regression equations as shown in Table 3. To evaluate the agreement between the experimental and predicted values derived by the quadratic regression models, the goodness-of-fit of the model was evaluated based on ANOVA. The R2 was 0.9622, which is close to 1 and indicates a high degree of correlation between the experimental and predicted values. p-value is used as a tool to evaluate the significance of each coefficient and interactions between each independent variable. The UAE variables will be more significant if the p-value becomes smaller and significance was confirmed at the level of p < 0.05 [29,30]. In evaluating the effects of independent variables, the significance was determined in the order of ethanol concentration (p < 0.0001) >추출 온도(p < {0}}.0598) > 추출 시간(p < 0.4329)으로 TAI에서 에탄올 농도의 영향이 가장 큰 것으로 확인되었습니다.

UAE 조건이 TAI에 미치는 영향을 비교하기 위해 섭동 플롯을 사용하여 두 개의 변수를 중심점에 고정하여 TAI에 대한 개별 변수의 영향을 평가했습니다. 이는 에탄올 농도가 증가함에 따라 증가하는 반면, 추출 시간은 TAI에 유의한 영향을 미치지 않았다. 에탄올 농도에 따른 TAI의 상당한 비례 증가는 ANOVA 결과로 설명할 수 있습니다. TAI는 에탄올 농도의 1차 항(X3) 및 (p < 0에="" 의해="" 유의한="" 영향을="" 받았습니다.{13}}5)="" 2차="" 항은="" 통계적으로="" 유의하지="" 않아="" tai와="" 에탄올="" 농도="" 사이에="" 강한="" 비례="" 관계를="" 보여줍니다.="" 3d="" 응답="" 표면="" 곡선은="" 추출="" 온도(x1),="" 추출="" 시간(x2)="" 및="" 에탄올="" 농도(x3)의="" 영향을="" 받는="" 2차="" 회귀="" 방정식과="" tai="" 결과를="" 그래픽으로="" 표현한="" 것입니다.="" 그림="" 3a는="" tai에="" 대한="" 추출="" 시간과="" 에탄올="" 농도의="" 상호="" 작용="" 효과를="" 시각화합니다.="" 그="" 결과,="" 추출시간은="" tai에="" 유의한="" 영향을="" 미치지="" 않는="" 반면,="" 에탄올="" 농도는="" tai와="" 강한="" 비례관계를="" 갖는="" 것으로="" 확인되었다.="" 유사하게,="" 도="" 3b에="" 도시된="" 바와="" 같이,="" tai는="" 추출="" 온도보다="" 에탄올="" 농도에="" 더="" 의존적이었고,="" 가장="" 높은="" tai는="" 에탄올="" 농도가="" 99.5%로="" 증가함에="" 따라="" 달성되었다.="" 최대="" tai에="" 대한="" uae="" 조건="" 탐색에서="" 최대="" tai="" 조건="" 값은="" 3{{20}}.0="" min,="" 26.3="" ◦c="" 및="" 99.5%로="" 예측되었습니다.="" 이="" 결과는="" nakamura="" et="" al.="" [31]="" 유자잎의="" 생물학적="" 활성에="" 관한="" 연구에서="" 에탄올="" 20.0%="" ~="" 80.0%를="" 추출용매로="" 사용한="" 경우="" 에탄올="" 농도="" 증가에="" 비례하여="" tai가="" 증가하였고="" 80%="" 에탄올을="" 사용한="" 추출에서="" 최대치를="" 나타내었다.="" 이것은="" 더="" 높은="" 농도의="" 에탄올을="" 사용하는="">피부 미백땅콩 껍질이나 다른 식물의 영향.

2.4. CAI에 대한 추출 조건의 영향

Collagen is the most abundant protein in mammals and the main structural component of the extracellular matrix with gly-pro-hyp repeating units longer than 1400 amino acids. Collagenase is an enzyme that breaks down peptide bonds of collagen that form skin, bones, tendons, and ligaments. The collagen present in the dermis is decomposed by collagenase, which causes skin wrinkles and reduces skin elasticity; therefore, it is necessary to reduce the activity of collagenase to prevent skin wrinkles [32,33]. The optimization of the UAE condition was performed to maximize the CAI of peanut shell extract. A total of 17 runs were needed for optimizing the three individual variables and the experimental data of CAI obtained under experimental sets were 25.2%~92.3% (Table 2). Based on the 17 experimental runs, by applying multiple regression analysis on the experimental data, response and independent variables were related by the following quadratic regression equation in terms of the coded parameters given in Table 3. Then, ANOVA was applied to determine the regression coefficients, statistical significance, and to fit the mathematical models. The mean-square values were calculated by dividing the sum of the squares of each variation source by their degrees of freedom, and a 95% confidence level (α = 0.05) was applied to determine the statistical significance in the analysis of the quadratic model. The ANOVA results confirmed that R2 of the quadratic regression equation was 0.8862 and that the p-value was 0.0134, which is less than the significance level (p < 0.05), thus indicating a good model of fit and statistical significance for predicting CAI values. In the primary term, the X2 and X3 showed significant effects and the interaction effect terms were significant in the X1X2 and X2X3 (p < 0.05). The effect of UAE conditions on CAI production was confirmed to be in the order of: extraction temperature (p = 0.0236) >에탄올 농도(p=0.0240) > 추출 시간(p=0.8505)으로 추출 온도와 에탄올 농도의 영향이 CAI에 유의함을 나타냅니다.

그림 1c는 두 개의 변수가 고정되어 있고 단일 변수가 CAI에 미치는 영향을 시각화한 섭동 플롯을 보여줍니다. 세 변인 모두 CAI에 미치는 영향은 유사한 것으로 나타났으며, 세 변인은 유의한 효과를 보였으며 각각의 독립변수가 증가함에 따라 CAI가 증가하였다가 감소하였다. 우리 연구에서는 2차 회귀 방정식을 사용하여 CAI에서 두 개의 독립 변수의 상호 작용을 시각화하기 위해 3D 표면 반응 곡선을 개발했습니다(그림 4). 에탄올 농도가 중심점에 고정되었을 때 추출 시간과 온도가 CAI에 미치는 영향을 그림 4A에서 평가했습니다. 두 변수가 동시에 변화함에 따라 CAI는 33.4분과 76.8ºC로 증가하고 최대 CAI 92.8% 이후 다시 감소했습니다. 도 4B, C에서 보는 바와 같이 CAI는 64.3%의 에탄올 농도에서 가장 높은 값을 보였고 이후 점차 감소하는 경향을 보여 64.3%의 에탄올로 구성된 이원 용매가 추출 용매로 더 적합함을 시사한다. 이 결과는 물과 에탄올의 2성분 용매가 Orostachys japonica에서 생리활성 화합물을 추출할 때 물보다 더 높은 CAI를 나타냈다고 보고한 이전 연구와 일치하며, 이는 50% 에탄올이 추출에 더 유리할 것으로 암시합니다.피부 미백성분 [34]. 2차 회귀 모델에 의해 예측된 땅콩 껍질 추출물의 최대 CAI는 94.5%였으며, 이는 추출 시간 45.1분, 추출 온도 93.6℃, ​​에탄올 농도 42.3%의 조건에서 얻은 것입니다. 본 연구에서 구한 CAI는 94.5%로 Oh et al.에 의해 보고된 녹차 추출물의 CAI 값 39.4% 및 40.3%의 2배 이상이다. [35].

2.5. 최적의 추출 조건

항산화,피부 미백주름 개선 효과는 모두 화장품의 중요한 기능이며 UAE 조건을 최적화하려면 이 세 가지 기능을 동시에 극대화할 수 있는 조건을 도출해야 합니다. 그림 5는 2차 회귀식을 통해 도출된 등고선 그래프의 각 최적 조건을 중첩하여 RSA(Y1), TAI(Y2), CAI(Y3)를 동시에 최대화할 수 있는 최적화 절차를 보여줍니다. 세 변수의 최적화를 위한 독립변수의 범위는 추출 시간 5.0~55.0 min, 추출 온도 26.{{10}}~94로 제한되었습니다. .0 ◦C 및 0.0% ~99.5%의 에탄올 농도(표 5). 개별 최적 추출 조건에 따르면 UAE의 최적 조건은 추출 시간 31.2분, 추출 온도 36.6℃, 에탄올 농도 93.2%, 위 조건에서 RSA 74.9%, TAI 50.6%, CAI 50.6%였다. 86.8%가 예측되었습니다. 예측된 RSA, TAI 및 CAI 값을 검증 실험에서 얻은 값과 비교했을 때 검증 테스트의 값은 각각 78.2%, 52.3%, 87.7%로 예측값과 유사했습니다.

2.6. SE와 UAE의 비교

UAE의 추출 효과를 확인하기 위해 UAE와 Soxhlet 추출(SE) 기술을 사용하여 생산된 땅콩 껍질 추출물의 RSA, TAI 및 CAI를 비교합니다. 99.5% 에탄올을 7{15}} ℃에서 4시간 추출시간 동안 사용하여 일반 SE 조건에서 SE를 수행한 결과, RSA, TAI 및 CAI는 75.5%, 60.2%, 74.4%로 검출되지 않은 것으로 나타났습니다. UAE 최적 조건에서 얻은 결과와는 많이 달랐다. 그러나 SE 조건을 UAE 최적 조건인 31.2%와 93.2% 에탄올과 동일하게 설정했을 때 RSA, TAI 및 CAI는 각각 62.0, 28.3, 45.6% 감소했으며, 최적의 조건에서 UAE와 비교. 땅콩 껍질에서 유용한 물질을 생산하는 초음파의 장점은 낮은 용매 소비와 짧은 추출 시간으로 인해 높은 생산성과 산업화에 적합한 공정으로 평가되었습니다.

2.7. MMP-3 및 TRP-1의 mRNA 발현

포유류 멜라닌 세포에서 멜라닌 생성과 콜라겐 가수분해는 각각 TRP와 MMP 유전자에 의해 조절되며 TRP{0}}와 MMP{1}}는 멜라닌 생성과 콜라겐 가수분해 조절의 주요 유전자로 알려져 있습니다. 따라서 B16-F{18}} 세포의 전체 세포 용해물에 대한 RT-PCR 분석을 수행하고 UAE에서 생산된 땅콩 껍질 추출물의 효과를 최적 조건(31.2분, 36.6도, 93.2%)에서 수행했습니다. MMP{12}} 및 TRP{13}}의 mRNA 발현에 대해 연구했습니다. 그림 6에서 볼 수 있듯이 땅콩으로 유전자 발현 실험을 했을 때 땅콩 껍질 추출물은 B{17}}F{19}} 세포에서 MMP{15}} 및 TRP{16}}의 발현을 유의하게 하향 조절했습니다. 껍질 추출물 농도 범위는 0~1 mg/mL입니다. 땅콩 껍질 추출물은 1.{30}} mg에서 MMP{21}} 및 TRP{22}} 발현을 각각 6.{24}}배 및 8.{26}}크게 감소시켰습니다. /mL. 이러한 결과는 땅콩 껍질 추출물이 MMP-1를 비활성화하여 MMP 3를 비활성화하여 B16F0 세포에서 콜라겐 분해를 억제하고 MMP-9[36]의 협력을 방해함을 시사합니다. 기존 연구에 따르면 식물 추출물 처리는 세포외 신호 조절 단백질 키나아제(ERK)를 인산화하여 소안구증 관련 전사 인자(MITF)의 발현을 억제하는 것으로 나타났습니다. 따라서 땅콩 껍질 추출물에 의한 멜라닌 생성 억제 효과는티로시나제ERK 및 MITF의 발현 억제를 통한 활성 [37]. 따라서 땅콩 껍질 추출물은 TRP{1}} 및 MMP-3의 mRNA 발현 수준을 감소시켰는데, 이는 땅콩 껍질 추출물이 콜라겐 분해 및 멜라닌 생성에 대한 강력한 억제 활성을 갖고 있음을 나타내는 우수한 화장품 소재임을 나타냅니다.피부 미백및 주름 방지 효과.

3. 재료 및 방법

3.1. 재료 및 시약

땅콩 껍질은 3월 2일019일 농협마트(한국 전북 고창)에서 구입하여 건조 오븐(FC 49, Lab House, Seoul, Korea)을 사용하여 60℃에서 24시간 동안 건조되었습니다. 건조 중량은 일정하게 유지되었습니다. 말린 땅콩 껍질을 푸드프로세서(한일 HMF{4}}, Seoul, Korea)를 이용하여 분쇄한 후 600 µmsieve에 통과시켰다. 에탄올은 삼천화학(95.0% v/v, Seoul, Korea)에서 구입했습니다. Folin-Ciocalteu 시약, 갈산(97%) 및 케르세틴은 Merck(Kenilworth, NJ, USA)에서 구입했습니다. Sigma-Aldrich(St. Louis, 미주리, 미국). 이 실험에 사용된 다른 모든 화학 물질은 분석 등급이며 Sigma-Aldrich에서 구입했습니다. 모든 원액은 aMilli-Q 정제 시스템(Millipore, Burlington, VT, USA)을 사용하여 정제된 탈이온수로 제조되었습니다.

3.2. 초음파 보조 추출 및 속슬렛 추출

땅콩 껍질 분말(1g)을 용매 1{14}} mL가 담긴 추출 용기에 넣고 볼텍스 믹서(VM{2}}, 대한사이언티픽, 한국 원주)를 사용하여 혼합했습니다. 1 분. 초음파 추출기(250 W,SD-D250H, 대한사이언티픽, 원주, 한국)에서 외부냉동배스순환기(CDRC8, 대한과학, 원주, 한국)를 이용하여 물을 순환시켜 추출하였다. ) 디지털 타이머와 온도 조절기로. 추출은 디지털 타이머와 온도 조절기가 장착된 초음파 장치로 수행하였다. 샘플은 40kHz의 작동 주파수에서 다양한 실험 기간 및 온도에 대해 초음파 처리되었습니다. 그런 다음 추출물을 10분 동안 10,{10} rpm에서 원심분리했습니다(236R, Labogene, Seoul, Korea). 원심분리 후, 샘플 부피는 최대 5mL로 만들어졌고 분석 전에 0.2μmmembrane 필터를 통해 여과되었습니다. Soxhlet 추출을 위해 Soxhlet 장치에서 최고 온도 70℃에서 4시간(8주기) 동안 99.5% 에탄올을 사용하여 분말 땅콩 껍질(5g)을 100mL로 연속적으로 추출하였다. 초음파 보조 추출 기술은 포도씨에서 오일을 추출하는 데 매우 효율적인 것으로 나타났습니다. 초음파의 장점은 오일 및 폴리페놀 모두에 대한 기존의 추출 방법과 비교하여 오일/폴리페놀 수율이 더 낮은 용매 소비 및 더 짧은 시간으로 얻어졌기 때문에 유사했습니다. 추출 시간.

3.3. 실험적 설계

실험설계는 RSM의 일종인 CCD를 이용하여 실험횟수를 최소화하고 요인들 간의 상호작용을 연구하였다. Design-Expert® 소프트웨어 8.{2}}(State-Ease, City, MN, USA)은 항산화제를 갖는 생리활성 화합물의 추출을 최대화하기 위한 실험 설계, 데이터 분석 및 추출 조건 최적화에 사용되었습니다.피부 미백, 땅콩 껍질의 주름 개선 효과. 실험은 CCD에 따라 설계되었으며, 제시된 3개의 독립변수의 범위와 중심점 값은 예비 실험의 결과를 기반으로 하였다(표 1). 땅콩 껍질로부터 RSA, TAI, CAI를 포함한 반응을 최대화하기 위한 최적의 UAE 조건을 예측하기 위해 CCD를 적용하였다. 독립변수로는 추출시간(X1), 추출온도(X2), 에탄올 농도(X3)로 3가지 변수를 선정하였다. 재현성을 추정하기 위해 중앙 지점에서 3번의 복제로 총 17번의 실험 실행이 생성되었습니다. 2차 회귀 모델을 사용하여 실험 데이터를 피팅하고 식 (1)과 같이 응답 변수를 예측하는 데 적용했습니다.

Y= 0 더하기 1X1 더하기 2X2 더하기 3X3 더하기 11X12 더하기 22X22 더하기 33X32 더하기 12X1X2 더하기 13X1X3 더하기 23X2X3 (1)

여기서 Y는 예측된 응답입니다. 0는 상수(절편)입니다. 1, 2 및 3은 선형 효과 항에 대한 회귀 계수입니다. 11, 22 및 33은 2차 효과 항입니다. 12, 13, 23은 각각 상호작용 효과 항이다. 반응표면분석과 ANOVA는 회귀계수와 모형항의 통계적 유의성을 결정하고 실험의 수학적 모형에 맞추기 위해 사용되었다[38].

3.4. DPPH 라디칼 소거 활성(RSA)

땅콩 껍질 추출물의 RSA는 Pereira-Caro et al. [39]. 0.{7}}메탄올(95%) 중 1mM DPPH의 용액을 제조하고 1.25mL를 0.25mL의 희석된 추출물에 첨가했습니다. RSA는 20분 동안 인큐베이션한 후 UV-Visspectrophotometer(UV1650PC, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하기 위해 결정되었습니다. 증류수를 이용하여 블랭크를 제조하고 RSA를 다음과 같이 계산하였다. (수학식 2):

RSA(퍼센트)={1 −Abs(샘플) /Abs(대조군) }× 100(2)

3.5. 티로시나제 활성 억제(TAI)

TAI는 Jo et al.에 의해 기질로 L-DOPA를 사용하여 수정된 방법에 따라 수행되었습니다. [40]. 샘플을 200 μL L-DOPA 및 200 μL 인산칼륨 완충액(pH 6.8) 및 200 μL티로시나제(125 U/mL)를 시험관에 첨가하고 37℃에서 20분 동안 배양하였다. 샘플 흡광도는 UV-Vis 분광 광도계를 사용하여 475 nm에서 측정하였고 그 결과를 대조군과 비교하였다. 각각의 농도에 대해 억제제가 없는 완충액을 사용한 검정과 비교하여 효소 활성을 백분율로 계산하였고, TAI는 다음 식에 따라 계산하였다. (식 (3)):

TAI(백분율)={1 −Abs(대조군) − Abs(샘플) /Abs(대조군)} × 100(3)

여기서 Abs(대조군)는 완충액과 콜라게나아제의 흡광도입니다. Abs(샘플)는 버퍼 + 콜라게나제 + 샘플/표준의 흡광도입니다.

3.6. 콜라게나제 활성 억제(CAI)

추출물의 CAI 측정은 Wünsch와 Heindrich[41]의 방법을 수정하여 수행하였다. 기질인 4-페닐아조베질옥실카보닐-Pro-Leu-Gly Pro-Arg(FALGPA)를 1{12}}mL 완충액에 1.2mg/mL로 용해한 다음 125μL의 용액을 첨가하고 60분 동안 인큐베이션했습니다. 37ºC에서 Collagenase를 완충액에 0.4mg/mL로 녹이고, 완충액에 효소용액 75μL를 첨가하였다. 효소-기질 혼합물을 37℃의 수조에서 30분 동안 인큐베이션하고 20% 시트르산(w/v) 75μL를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 초산에틸 1.5mL를 가한 후 초산에틸층을 분리하여 320nm에서 흡광도를 측정하였다. 억제율은 다음 식에 따라 계산하였다.

CAI(백분율)={1 − [Abs(대조군) − Abs(샘플)] /Abs(대조군)}× 100(4)

여기서 Abs(대조군)는 완충액과 콜라게나아제의 흡광도입니다. Abs(샘플)는 버퍼 + 콜라게나제 + 샘플/표준의 흡광도입니다.

3.7. 세포주의 유지 및 배양

멜라닌을 생성하는 B16-F{2}} 흑색종 세포는 한국세포주은행(KCLB, Chongno, Seoul, Korea)에서 입수하여 Dulbecco's Modified Eagle's medium(DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 소태아혈청(FBS, 10%, Welgene, 경산, 한국)과 페니실린-스트렙토마이신 항생제 용액(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 보충하였다. Trypsin-EDTA(Gibco, Grand Island, NY, USA)는 세포의 트립신 처리에 사용되었습니다. 사용된 모든 재료는 세포 배양 등급이었습니다.

3.8. 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)

RT-PCR은 다음과 관련된 MMP-3 및 TRP-1 유전자 발현 수준의 변화를 측정하기 위해 수행되었습니다.희게 함주름 방지 효과가 있는 B16-F{2}} 세포는 무혈청 DMEM에서 다양한 농도의 땅콩 껍질 추출물로 처리한24-웰 플레이트에서 배양하고 24시간 동안 배양했습니다. 미처리 세포 대조군은 실험 동안 시험군과 동일한 조건에서 유지하였다. AccuPrep® Universal RNA Extraction Kit(Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 세포로부터 RNA 분리를 수행했습니다. AmfiRiert Platinum cDNA 합성 MasterMix(GenDEPOT, Barker, TX, USA)를 사용하여 상보적 DNA를 합성했습니다. mRNA 수준을 결정하기 위해 CFX 96 터치 PCR 시스템(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 RT-PCR 분석을 수행했습니다. 사용된 프라이머는 다음과 같습니다: MMP-3 센스, {{10}AGTTTGGTGTCGCGGAGCAC{11}} 및 안티센스, 50-TACATGAGCGCTTCCGGGCAC-30; 및 TRP{14}} 센스, 50-GCTGCAGGAGCCTTCTTTCTC 30 및 안티센스, 50-AAGACGCTGCACTGCTGGTCT{18}}. 위에서 언급한 적절한 프라이머 세트를 사용하여 다음 순환 조건을 사용하여 각 유전자를 증폭했습니다: 94°C에서 5분, 95°C에서 5초, 60°C에서 30초(forMMP-3) , 30초 동안 60ºC(TRP-1의 경우), 72ºC에서 30초 연장. PCR 산물을 1% 아가로스 겔에서 전기영동하고 에티듐 브로마이드로 염색하고 Gel Doc TM XR plus System 및 Quantity One 소프트웨어 2.0(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 시각화했습니다. 하우스키핑 단백질인 α-액틴은 이들 단백질의 발현 수준이 일정하게 유지된다는 가정하에 로딩 대조군으로 사용되었습니다.

4. 결론

본 연구에서는 땅콩 껍질의 농업 부산물에서 생리 활성 물질의 회수 및 사용에 대해 보완적인 접근 방식을 사용하여 다용도의 부가가치 성분을 개발했습니다. 먼저 UAE 공정을 최적화하여 항산화, 피부 미백, 주름 개선 효과가 있는 생리활성 화합물의 추출 효율을 높이려고 했습니다. 따라서 본 연구에서는피부 미백땅콩 껍질의 주름 개선 효과와 통계 기반 최적화를 적용하여 RSA, TAI 및 CAI를 동시에 최대화했습니다. UAE 조건은 CCD를 사용하여 최적화되었으며 땅콩 껍질에서 생물 활성 화합물을 추출할 때 용매 및 농도 선택을 고려해야 함을 확인했습니다. 반응표면을 중첩하여 세 가지 종속변수의 곡선, 추출시간 31.2분, 추출온도 36.6℃, 에탄올 농도 93.2%가 UAE의 최적 조건으로 결정되었다. 땅콩 껍질 추출물의 RSA가 매우 높은 것으로 확인되었으며,피부 미백및 주름 방지 효과, 각각. UAE 조건의 최적화를 통해 땅콩 껍질의 생리 활성 물질 생산 증가와 땅콩 껍질 추출물의 미백 및 주름 개선 활성을 확인했습니다.티로시나제및 콜라게나제 활성 하향조절. 이를 토대로 땅콩 껍질이 MMP와 TRP의 발현 수준에 미치는 영향을 유전자 발현 수준에서 미백 및 주름 개선 효과가 있는지 여부를 평가하였다. 땅콩 껍질 추출물의 미백 및 주름 개선 효과는 MMP-3 및 TRP-1의 mRNA 발현 및 단백질 발현 억제. 따라서 땅콩 껍질 추출물은희게 함및 단백질 발현 및 유전자 수준에서의 주름 개선. UAE를 사용한 땅콩 껍질 추출물은 항산화 활성이 높고 피부 미백 및 주름 개선 효과가 우수하여 땅콩 껍질에 천연 화장품 및 식품 재료로서의 잠재력을 부여합니다. 또한, UAE를 이용한 생리활성 화합물의 생산은 기존 공정에 비해 높은 생산 수율과 낮은 가공 비용을 감안할 때 화장품, 식품, 의약품 등의 생산을 위한 상업화 공정에 적용할 수 있을 것으로 사료된다.