고인 식단은 쥐 신장에서 Bmp2 및 Spp1 mRNA 발현의 상향 조절을 유도합니다

개발 메커니즘을 명확히하기 위해신석회화증에 의해 유도된고인(P) 식단, 우리는 뼈 형태 형성 단백질 2 및 오스테오폰틴과 같은 뼈 관련 단백질에 중점을 두었습니다. 이 연구는 쥐의 신장에서 Bmp2와 Spp1의 mRNA 발현에 대한 고P 식이의 효과를 조사했습니다. Wistar 쥐를 두 그룹으로 나누어 대조 식단(대조군) 또는 고P 식단(high-P 그룹)을 먹였습니다.신장 칼슘P 농도는 대조군에 비해 높은 P 그룹에서 유의하게 증가했습니다. Bmp2와 Spp1의 mRNA 발현은 대조군에 비해 high-P 군에서 유의하게 증가했습니다. 이러한 결과는 고P 식단이 Bmp2 및 Spp1의 상향 조절을 유도함을 나타냅니다.신장의 mRNA.

키워드:고인 식단, 신장 석회화증, Bmp2, Spp1,신장, 쥐

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소개

신장 석회화증칼슘(Ca) 침전물이 특징입니다.신장 실질. 식이인(P)는 특히 이 장애 발병의 중추적인 요인입니다. 고P 식단을 투여하면 체내 Ca 농도가 증가하는 것으로 나타났습니다.신장및 신장 실질에 Ca 침착물1-6). 신수질 석회화증 발생에 대한 고P 식이요법의 효과가 지속적인 연구의 초점이 되어 왔음에도 불구하고, 이 질환의 발생을 담당하는 메커니즘에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 따라서 이 문제에 대한 시기적절한 해결이 필요합니다.

우리는 투과전자현미경을 이용한 조직학적 검사에서 고인 식이를 섭취한 쥐의 세뇨관에서 수산화인회석과 같은 바늘 모양의 결정이 관찰되었다고 보고했습니다6, 7). X선 미세분석 결과, 고인 식단에 의해 유발된 Ca 침전물은 주로 Ca와 P7로 구성되어 있는 것으로 나타났습니다. 이러한 결과는 고P 식이에 의해 유도된 Ca 침전물이 수산화인회석의 한 형태라는 것을 보여주었습니다. 이러한 발견을 바탕으로 우리는 신석회화증의 발생이 뼈 형성과 유사한 메커니즘에 의해 제어된다고 가정합니다. 따라서 본 연구에서는 뼈 형성 단백질 2(BMP2)와 같은 뼈 관련 단백질에 중점을 두었습니다. BMP2는 골형성 유도 활성을 나타내는 골형성 인자이다9). BMP2가 이소성 골 형성을 유도하는 인자로 확인되었다는 점은 주목할 만하다10, 11). 따라서 우리는 BMP2가 신장 석회화증 발병에 중요한 역할을 한다면 신장에서 이 단백질의 발현이 고P 식이에 의해 상향조절될 것이라는 가설을 세웠습니다. 본 연구는 고P 식단이 mRNA 발현에 영향을 미치는지 여부를 확인하는 것을 목표로 했습니다.신장의 Bmp2.

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한편, 우리의 이전 연구에서는 면역조직화학적 분석을 사용하여 고인 식이가 신세뇨관에서 오스테오폰틴(OPN) 발현을 증가시키는 것으로 보고했는데, 이는 OPN이 고인 식이에 의해 유발된 Ca 축적의 발생과 관련이 있을 수 있음을 시사합니다12). 따라서 우리는 신장에서의 Spp1 mRNA 발현 변화도 조사했습니다.

본 연구의 결과는 고P 식이에 의해 유발된 신장 석회화증의 발생을 담당하는 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

재료 및 방법

동물과 다이어트. 본 연구는 도쿄농업대학 동물이용위원회의 승인을 받았으며, 모든 동물은 실험동물 관리 및 사용에 관한 대학의 지침(승인번호 300049)에 따라 관리되었습니다.

암컷 쥐가 수컷 쥐에 비해 더 쉽게 신석회화증을 일으킨다는 점에 유의하는 것이 중요합니다13, 14). 또한, 우리는 고P 식이가 암컷 쥐의 신세뇨관에서 OPN 발현을 증가시킨다고 보고했습니다12). 본 연구에서는 암컷 쥐를 실험 동물로 사용했습니다. 4주령 암컷 Wistar 쥐(Clea Japan, Tokyo, Japan)를 각각의 스테인레스 철망 케이지에 가두었습니다. 실험 기간 동안 케이지는 12-h 조명: 암흑주기(밝음, 0800-2000 h), 온도 22 ± 1도 및 상대 습도 60%에서 조명이 제어된 방에 배치되었습니다. 65%.

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실험식이의 구성은 Table 1과 같다. 실험식은 AIN-93G 다이어트15)를 참고하여 준비하였다. 실험 식단에는 두 가지 다른 P 농도가 포함되어 있습니다(대조 식단, 0.3%; 고P 식단, 1.5%). 고인 식단의 인 농도는 1.5%로 설정되었는데, 이는 우리의 이전 연구에서 다음과 같은 사실이 관찰되었기 때문입니다.식이 P 농도1.5%의 경우 심각한 신석회화증6, 7, 12, 14) 및 높은 OPN 발현12)을 유발합니다. 모든 실험 식단의 Ca 농도는 동일했습니다(0.5%). 실험 식단 분석을 통해 결정된 P 및 Ca 농도는 표 1에 나와 있습니다. 연구 시작 전 모든 쥐는 7일 동안 순응시켰으며, 이 기간 동안 대조 식단과 탈이온수를 자유롭게 섭취할 수 있었습니다. . 순응 기간 후, 쥐를 비슷한 평균 체중을 가진 두 그룹으로 무작위로 나누어 14일 동안 대조군 식이(대조군) 또는 고P 식이(고P군)를 먹였습니다. 실험 기간 동안 쥐에게 할당된 실험 식단과 탈이온수를 무료로 제공했습니다. 실험 기간이 끝나면 마취제 혼합물(메데토미딘, 미다졸람 및 부토르파놀)을 복강 내 주사하여 쥐를 안락사시키고 분석을 위해 혈액 및 신장 샘플을 수집했습니다. 혈액 샘플을 원심분리하고 상층액을 혈청 샘플로 사용했습니다. 신장을 제거하고 신장 캡슐을 폐기했습니다. 그만큼혈청 및 신장 샘플분석이 필요할 때까지 -80도에 보관했습니다. 오른쪽 신장은 Bmp2 및 Spp1 mRNA의 정량 분석에 사용되었으며 왼쪽 신장은 Ca 및 P 농도 분석에 사용되었습니다.

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미네랄 분석.

실험 사료와 신장의 샘플은 머플로에서 550도에서 48시간 동안 재화되었으며 분석을 위해 1mol/L의 HCl에서 미네랄을 추출했습니다. 실험식이와 신장의 Ca 농도는 원자흡광광도법16)을 이용하여 측정하였다. Gomori17)의 방법을 이용하여 실험사료 및 신장의 인 농도를 분석하였다.

Bmp2 및 Spp1 mRNA의 정량 분석.

제조업체의 사양에 따라 TRIzol 시약(Life Technologies, CA, USA)을 사용하여 균질화된 신장에서 총 RNA를 분리했습니다. RNA의 양과 순도는 NanoDrop 2000c(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)를 사용하여 평가되었습니다. cDNA는 qRT-PCR용 SuperScript III First-Strand Synesis SuperMix(Life Technologies)를 사용하여 합성한 다음 SYBR Select Master Mix(Life Technologies)를 사용하여 정량적 실시간 RT PCR을 수행했습니다. Bmp2(forward, 5'-ACCGTGCTCAGCTTCCATCAC-3'; reverse, 5'-TTCCTGCATTTGTTCCCGAAA-3'), Spp1(forward, 5'-) 분석을 위해 특정 프라이머18-20)를 사용했습니다. TGAGACTGGCAGTGTTTGC-3' ; 역방향, 5'-CCACTTTCACCGGGAGACA-3') 및 Gapdh(정방향, 5'-TGGGAAGCTGGTCATCAAC-3' ; 역방향, 5'-GCAT CACCCCATTTGATGTT-3 '). 실시간 PCR 반응은 StepOne Real-Time PCR System(Applied Biosystems, CA, USA)을 사용하여 수행하였고, mRNA 발현 수준은 Gapdh mRNA 수준으로 정규화하였다. 대조군의 값은 1.00으로 간주되었다.

통계 분석.

결과는 6마리의 쥐로 구성된 각 그룹에 대한 평균 ± SEM으로 표시됩니다. 분산의 동질성을 확인하기 위해 F-테스트를 수행한 후, 두 그룹 간의 유의미한 차이를 확인하기 위해 스튜던트 t-테스트를 사용했습니다. 분산의 동질성이 동일하지 않은 경우에는 스튜던트 t-검정 대신 Welch의 t-검정을 사용했습니다. p < 0.05에서 차이가 유의미한 것으로 간주되었습니다.

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