Cistanche Tubulosa의 활성 성분은 알츠하이머병에서 어떻게 역할을 합니까?

JIANHUA YANG1*, BOWEI JU1,2*, YAO YAN1, HUANHUAN XU1, SHANSHAN WU1, DANDAN ZHU1, DANDAN CAO1 및 JUNPING HU2

추상적인.본 연구의 목적은 신경 보호 효과를 조사하는 것입니다.페닐에타노이드 배당체(PhGs) H2O2- 및 α-아밀로이드 펩타이드(A)1-42-의 시험관 내 모델로서 PC12 세포의 손상 유도알츠하이머병 (기원 후). 다양한 인큐베이션 시간과 농도의 스크리닝을 통해 최적의 유도 조건을 설정했습니다. PC12 세포를 PhG의 존재 하에 24시간 동안 0.5 μM A 1-42 및 H2O2로 처리한 다음 MTT 분석으로 세포 생존율을 평가했습니다. 젖산 탈수소효소(LDH) 방출과 말론디알데히드(MDA) 함량도 측정했습니다. 설립을 위한 최적의 조건기원 후모델은 PC12 세포를 48시간 동안 0.5 µM A 1-42 처리하거나 PBS와 함께 DMEM에 용해된 25 µM H2O2로 처리했습니다. 5, 25 및 50 µg/ml 농도의 PhG는 A 1-42 또는 H2O2로 손상된 PC12 세포에 의한 생존력을 증가시키고 LDH 및 MDA 방출을 감소시켰습니다. 결론적으로 A{15}} 및 H2O{17}}유도 PC12 세포 손상 모델이 성공적으로 확립되었습니다. PhG는 A{19}} 또는 H2O{21}}유도 세포 손상에 대해 상당한 신경 보호 효과가 있는 것으로 나타났습니다.

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소개

알츠하이머병 (기원 후), 진행성 기억 상실 및 인지 기능 장애의 임상적 특징을 갖는 신경퇴행성 장애(1)는 전 세계적으로 치매의 가장 흔한 원인이다(2). AD(3)의 유행으로 인해 재정적 비용이 엄청나다. 따라서 적절한 관리 및 예방 수단을 개발하는 것이 시급합니다.기원 후.

의 병인기원 후영향을 받는 뇌 영역에서 신경원섬유 엉킴 및 노인성 플라크(SP)의 축적과 밀접하게 관련되어 있습니다(4,5). - SP의 주요 성분인 아밀로이드 펩타이드(A)는기원 후신경 세포에 독성 효과가 있기 때문입니다(6). A 1-40, A 25-35 및 A 1-42를 포함한 A 단편은 아밀로이드 전구체 단백질의 분할을 통해 생성되었습니다(7). A 1-42의 신경 독성은 A 25-35 및 A 1-40보다 유의하게 높은 것으로 나타났으며 A 1-42는기원 후모델(1,{1}}). 산화 스트레스는 발병 기전에 관여할 수 있습니다.기원 후A-유도 신경독성(11-13)의 기본 메커니즘입니다. 여러 연구에 따르면 A 1-42는 활성 산소 종(ROS)의 세포 내 축적을 일으켜 지질 및 단백질 산화, DNA 손상 및 세포 주기 체크포인트 신호의 활성화를 유도합니다(1,14,15). 과도한 양의 H2O2는 산화적 손상을 유발하고 PC12 세포의 세포자멸사를 유도할 수 있습니다(16). 따라서, 산화 스트레스를 표적으로 하는 것은 알츠하이머병에서 A-유도된 신경독성을 억제하기 위한 치료 전략의 개발을 위한 유망한 접근 방식일 수 있습니다.

허바(H.)시스탄체, 신장에 영양을 공급하고 에센스와 혈액을 보충하기 위해 중국 본토에서 일반적으로 사용되는 한약은 기억 상실과 노인성 변비를 치료하는 데 사용되었습니다(17). H.의 주요 성분 중 하나인 페닐에타노이드 배당체(PhG).시스탄체, 항산화 효과를 통해 A 25-35에 의한 신경 세포 사멸의 손상을 개선합니다(18,19). 이전 연구에서는 총 PhGs의 5가지 주요 구성 요소를 확인했습니다.악티오사이드, 2'-아세틸락테오사이드,에키나코사이드, 시스타노사이드 및 이소악테오사이드(20). 이러한 구성요소 중,악티오사이드그리고에키나코사이드A 25-35- 또는 H2O2-유도 신경독성(21-23)에 대한 신경보호 효과가 있는 것으로 보고되었습니다. 예를 들어, Wu et al(24)은 acteoside와에키나코사이드

키워드:페닐에타노이드배당체, PC12 세포, H2O2, -아밀로이드 펩타이드1-42, 신경보호, 시스탄체

재료 및 방법

박사 준비. 총 PhGs는 H에서 추출되었습니다.시스탄체앞서 설명한 대로(25). 공기 건조 줄기 H.시스탄체가루로 만들고 8{6}}% EtOH로 여과하여 추출했습니다. 여과액을 감압하에 증발시킨 다음, 적절한 양의 H2O2(1{{2{23}}}}0 µmol/l)에 재현탁시켰다. 혼합물을 SP{5}} 거대다공성 수지 컬럼(Mitsubishi Chemical, Tokyo, Japan)에서 분리하고 물 중 0, 30, 50, 70 및 90% EtOH로 용리했습니다. PhG가 풍부한 분획을 얻기 위해 30-50% EtOH 용리액을 농축하고 감압 하에 건조했습니다. 총 PhGs를 결정하기 위해 자외선(UV) 분광광도법을 수행했습니다. echinacoside와 acteoside의 함량은 이전 프로토콜(26)에 따라 고압 액체 크로마토그래피에 의해 결정되었습니다. Hypersil ODS{15}} 컬럼(4.6x250mm, 5µm; Dalian Elite Analytical Instruments, Co., Ltd., Dalian, China)을 사용하고 실온에서 유지했습니다. 이동상은 0.4% 인산(v/v; Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Germany)을 포함하는 메틸 시안화물 및 물이었습니다. 유속은 0.75 ml/min이고 파장은 333 nm로 설정되었습니다.

세포 배양 및 약물 치료. PC12 쥐 갈색세포종 세포주는 Xinjiang Medical University의 He Chunhui 박사(중국 우루무치)가 제공했습니다. 세포는 10%의 태아 소 혈청을 함유하는 고글루코스 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA)에서 배양되었습니다(Sangon Biotech Co. Ltd., Shanghai, China). , 100U/ml 페니실린 및 100U/ml 스트렙토마이신을 5% CO2 및 95% 공기를 포함하는 37˚C의 인큐베이터에 넣습니다. 80% 합류에 도달하면 세포를 0.25% 트립신으로 처리하고 계대했습니다.

PC12 세포의 성장에 대한 약물 자체의 간섭을 제거하기 위해 독성 실험을 수행했습니다. 간단히 말해서, PC12 세포(3x104 cells/ml)를 {{4}웰 플레이트에 100µl/웰로 시딩하고 37˚C에서 밤새 배양했습니다. 상층액을 버리고 빈 그룹에 200μl 완전한 DMEM을 추가한 반면 개입 그룹의 세포는 다양한 용량(5, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 및 200μg/ ml). 37˚C에서 48시간 동안 세포를 배양한 후 MTT 용액(Sigma‑Aldrich; Merck KGaA) 20µl를 각 웰에 첨가했습니다. 4시간 동안 배양한 후, 상층액을 버리고 150 ㎕ 디메틸설폭사이드를 웰당 첨가한 후 10분 동안 교반하였다. 490 nm에서의 광학 밀도(OD) 값은 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 검출되었습니다.

1‑42‑유도 PC12 세포 손상. Bioss Biotech(Beijing, China)에서 구입한 1-42 펩타이드를 물(100μg/ml)에 녹였습니다. 이어서, 혼합물을 37˚C에서 4일 동안 인큐베이션하고 사용하기 전에 4˚C에서 보관하였다.

PC12 세포를 96-웰 ​​플레이트에 접종했습니다(웰당 100µl에 3xl04개 세포). 부착을 위해 24시간 동안 배양한 후, 무혈청 DMEM에 용해된 다양한 최종 농도(0, 0.25, 0.5, 1, 1.5 또는 2 μM)의 50 μl A{7}}를 첨가한 다음, 24, 48, 72 또는 96시간 동안 배양합니다. 세포 생존력은 MTT 분석에 의해 평가되었습니다. 최적 A{22}} 농도는 0.5로 µM으로 결정되었습니다.

PC12 세포(웰당 3x1{3}}4개 세포)는 24시간 동안 0.5 µM A 1-42 세포 생존력은 MTT 분석에 의해 평가되었습니다.

H2O2 유발 PC12 세포 손상. PC12 세포를 96-웰 플레이트에 접종했습니다(웰당 1{20}0µl에 3xl{12}}4개 세포). 부착을 위해 24시간 동안 배양한 후, PBS(0.01 mol/l) 유무에 관계없이 DMEM에 용해된 다양한 최종 농도(0, 25, 50, 100, 200, 300, 400 및 500 μM)의 100 μl H2O2를 첨가하고, 이어서 24시간 동안 배양하였다. 세포 생존력은 MTT 분석에 의해 평가되었습니다. 최적의 H2O2 농도와 용매는 AD의 시험관내 모델을 확립하기 위해 결정되었습니다.

PC12 세포(웰당 3x104개 세포)를 다양한 용량의 PhG(0, 0.5, 5, 25 및 50 μM)로 처리했습니다. 부착을 위해 24시간 동안 배양한 후, PC12 세포를 24시간 동안 PhG의 존재 하에 PBS와 함께 DMEM에 용해된 100μl H2O2로 처리하였다. 세포 생존력은 MTT 분석에 의해 평가되었습니다.

젖산 탈수소효소(LDH) 방출 분석. 세포 손상은 제조사의 프로토콜(cat. no. 2{4}}15{12}}604; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, 중국). 간단히 말해서, 이중 증류된 H2O, 0.2μmol/ml 피루브산, 매트릭스 완충액 및 코엔자임 I 완충액을 약물 처리 후 48시간에 순서대로 첨가했습니다. 37˚C에서 15분 동안 배양한 후 2,4-dinitro-phenylhydrazine을 첨가했습니다. 이어서, 0.4M NaOH 용액 250㎕를 각 웰에 첨가하였다. 상층액은 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 후 수집되었습니다. 그런 다음 450 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기로 측정했습니다.

말론디알데히드(MDA) 측정. 제조사의 프로토콜에 따라 상업용 키트(cat. no. 20150604; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute)를 사용하여 PC12 세포의 상층액에서 MDA를 측정했습니다. 간단히 말해서, 탈수 알코올 및 기타 시약을 순서대로 첨가한 다음 수조에서 인큐베이션했습니다. 95˚C에서 40분간 혼합물을 냉각 후 1,006 xg 및 25℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 그런 다음 상층액을 사용하여 MDA 함량을 결정했습니다. 흡광도는 532 nm에서 마이크로플레이트 판독기로 후속적으로 측정되었습니다.

시험관 내 AD에 대한 echinacoside 및 acteoside의 보호 효과 평가. PC12 세포를 96-웰 플레이트(100µl/웰)에 3x1{7}4세포/웰의 밀도로 시딩했습니다. 세포는 echinacoside(cat. no. 111670-200503, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing, China) 및 acetonide(cat. no. 111530-200505, National Institutes for Food and Drug Control)를 포함한 약물과 함께 배양되었습니다. ) 다양한 농도(0.5, 25 및 50μg/ml). 그 후, 세포를 A{11}} 또는 H2O2로 24시간 동안 처리하고 MTT assay로 세포 생존율을 측정하였다.

통계 분석. 값은 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다. 학생의 t-검정은 그룹 간 비교에 사용되었습니다. 통계적 분석은 SPSS 18.{3}}(SPSS, Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하여 수행되었습니다. 피<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

결과

H. Cistanches의 PhG 정량화. 자외선 스펙트럼박사추출된 표준 솔루션뿐만 아니라에키나코사이드그리고악티오사이드기록되었고 결과는 UV 스펙트럼이 일정함을 보여주었습니다(그림 1). UV 분광광도법

PhG 함량은 87.6%로 나타났다. HPLC 결과 echinacoside와 acteoside의 함량은 각각 37.7%와 17.8%였다(Fig. 2).

이상적인 PhG 농도의 결정. 빈 그룹과 비교하여 75, 100, 125, 150, 175 및 200 µg/ml의 PhG는 PC12 세포에 대해 유의한 억제 효과를 보였습니다(P<0.05), while="" phg="" at="" 5,="" 25="" and="" 50="" µg/ml="" showed="" low="" toxicity="" on="" pc12="" cells,="" and="" the="" cell="" viability="" was="">80%(그림 3). 따라서 5, 25 및 50 μg/ml 농도의 PhGs는 세포 생존력에 영향을 미치지 않기 때문에 후속 실험에서 PC12 세포를 처리하는 데 사용되었습니다.

1‑42 유발 PC12 세포 손상. 대조군과 비교하여 0.5 µM A 1-42 손상 그룹의 세포 생존율은 63%(P<0.05). the="" cell="" viability="" was="" decreased="" by="" aβ1-42="" in="" a="" concentration-dependent="" manner,="" and="" the="" viability="" was=""><50% in="" the="" 1,="" 1.5,="" and="" 2="" µm="" aβ1-42="" injury="" groups="" (fig.="" 4).="" thus,="" treatment="" with="" 0.5="" µm="" aβ1-42="" for="" 48="" h="" was="" determined="" to="" be="" the="" optimal="" condition="" for="" establishing="" the="" in="" vitro="" ad="">

24시간 동안 안전한 용량의 PhGs(5, 25 및 50 µg/ml)가 있는 상태에서 0.5 µM A 1-42로 처리한 PC12 세포의 활성도 측정했습니다. 모델군(P<0.01), phgs="" showed="" a="" significant="" neuroprotective="" effect="" on="" pc12="" cells.="" the="" cell="" viability="" was="" rescued="" by="" phgs="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (fig.="">

H2O2 유발 PC12 세포 손상. PBS가 포함된 DMEM에 용해된 25μM H2O2로 처리된 PC12 세포의 생존율은 56.43%였습니다. PBS 없이 DMEM에 용해된 200μM H2O2로 처리된 PC12 세포의 생존율은 71.64%였습니다(표 I). 따라서, PBS와 함께 DMEM에 용해된 25μM H2O2로 처리된 PC12 세포가 AD 모델을 설정하기 위한 최적 조건으로 선택되었습니다.

대조군과 비교하여 모델군의 세포 생존율은 48.8%(P<0.05). compared="" with="" the="" model="" group,="" phgs="" had="" a="" significant="" neuroprotective="" effect="" on="" pc12="" cells.="" the="" cell="" viability="" was="" dose-dependently="" increased="">

PhGs 및 5, 25 및 50μg/ml 농도에서 PhGs로 처리된 PC12 세포의 생존율은 각각 54%, 57% 및 64%였습니다(표 II).

PhG는 PC12 세포에 의한 손상 유발 LDH 방출을 억제합니다. 대조군과 비교하여 손상된 PC12 세포의 상청액의 LDH 함량이 증가하였고, 이는 농도 의존적으로 PhGs에 의해 억제되었다. 이 결과는 PhGs가 PC12 세포에 상당한 신경 보호 효과가 있음을 나타냅니다(그림 6).

표 I. H2O2 처리 후 세포 생존율(%).

표 II. 약물 간섭 후 세포 생존.

농도 의존적 ​​방식으로 PhGs에 의해 억제됩니다. 이 결과는 PhGs가 PC12 세포에 상당한 신경 보호 효과가 있음을 나타냅니다(그림 7).

PhG와 그 구성 요소인 에키나코사이드와 악테오사이드는 손상된 PC12 세포의 생존력을 구합니다. 모델 그룹과 비교하여 악테오사이드 처리는 A 1-42-손상된 PC12 세포의 생존력을 용량 의존적으로 유의하게 증가시켰습니다. PhGs와 echinacoside는 테스트한 모든 농도에서 1-42-손상된 PC12 세포의 생존력을 유의하게 증가시켰습니다(그림 8A).

**P<0.05, vs.="" model="" group.="" aβ,="" â-amyloid="" peptide;="" phgs,="" phenylethanoid="" glycosides;="" ech,="" echinacoside;="" as,="">

모델 그룹과 비교하여, 악테오사이드는 H2O2로 처리된 PC12 세포의 생존력을 유의하게 증가시켰습니다. PhGs는 또한 H2O2로 처리된 PC12 세포의 생존력을 증가시켰지만, 그 효과는 5와 25 µg/ml 농도에서 유의하지 않았습니다(그림 8B). 또한 echinacoside는 25 µg/ml에서 세포 생존율을 증가시켰습니다.

결론적으로, acteoside, PhGs 및 echinacoside는 A 1-42 또는 H2O2로 손상을 받은 PC12 세포에 상당한 신경 보호 효과를 발휘했습니다.

논의

산화 스트레스는 알츠하이머병(11-13)에서 A-매개 신경독성의 근간이 되는 주요 기전입니다. 따라서 산화 스트레스를 표적으로 하는 것은 알츠하이머병 치료를 위한 접근 방식을 나타낼 수 있습니다. 본 연구에서 A1-42- 및 H2O2-유도 PC12 세포 손상을 포함하는 알츠하이머병의 시험관 내 모델이 성공적으로 확립되었습니다. MTT, LDH 및 MDA 분석 결과는 PhG가 세포 생존력을 증가시키고 손상을 받은 PC12 세포에 의한 LDH 및 MDA 방출을 감소시키는 것으로 나타났습니다. PhG는 PC12 세포에 상당한 신경 보호 효과가 있다고 결론지을 수 있습니다.

PC12 세포 성장에 대한 PhG 자체의 영향을 줄이고 비정상적인 증식을 방지하기 위해 스크리닝 분석에서 PhG의 안전한 용량을 결정했습니다. 결과는 75, 100, 125, 150, 175 및 200μg/ml의 PhG가 PC12 세포에 대해 유의한 억제 효과를 가짐을 보여주었습니다(P<0.05,><0.01), while="" cell="" viability="" remained="">5, 25 및 50 µg/ml 농도에서 80%. 따라서 5, 25 및 50μg/ml 농도의 PhG는 PC12 세포에 안전했습니다.

A {{0}}의 부상은 용매, 배양 시간 및 제품 품질을 포함한 특정 요인의 영향을 받았습니다. 본 연구에서는 A 1-42 펩타이드를 물(100 µg/ml)에 녹이고 37˚C에서 4일 동안 CO2 인큐베이터에서 배양한 후 사용했습니다. PC12 세포는 0.5, 1, 1.5 및 2 μM 농도의 A{7}}로 처리되었습니다. 그 결과 A 1-42의 증가에 따라 세포 생존율이 감소하였고, 생존율은<50% in="" the="" 1,="" 1.5,="" and="" 2="" µm="" aβ1-42="" injury="" groups.="" thus,="" treatment="" of="" pc12="" cells="" with="" 0.5="" µm="" aβ1-42="" for="" 48="" h="" was="" determined="" to="" be="" the="" optimal="" condition="" for="" establishing="" the="" ad="" model.="" aβ25-35="" has="" been="" commonly="" used="" to="" establish="" ad="" models="" due="" to="" its="" low="" cost="" and="" simple="" operation="" (27-29).="" the="" neurotoxicity="" of="" aβ1-42="" is="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" aβ25-35,="" and="" aβ1-42="" is,="" therefore,="" the="" optimal="" aβ="" fragment="" for="" establishing="" an="" ad="" model="">

H2O2는 산화제이며 과도한 H2O2는 산화적 손상을 일으키고 세포 사멸을 유발할 수 있습니다(30). 본 연구에서 PC12 세포는 PBS 유무에 관계없이 DMEM에 용해된 25-500 µM H2O2로 처리되었습니다. 결과는 PBS 없이 DMEM에 용해된 H2O2가 PC12 세포의 비정상적인 증식을 유발함을 보여주었다. 따라서 DMEM에 용해된 25μM H2O2를 PBS로 PC12 세포에 처리하는 것이 AD 모델을 설정하기 위한 최적의 조건이었습니다. 1-42-유도 손상은 H2O2의 낮은 안정성과 용매 효과로 인해 H2O{18}}유도 손상보다 더 컸습니다.

세포가 손상되면 배양 배지로의 LDH 누출이 크게 증가합니다. ROS는 MDA의 생성을 일으키는 것으로 알려져 있습니다. 따라서 MDA와 LDH의 함량은 산화 손상의 양을 반영합니다. 현재 연구에서 손상 유발 LDH 및 MDA 활성은 PhG의 투여량이 증가함에 따라 감소했습니다. 이러한 결과는 PhG가 PC12 세포에 상당한 신경 보호 효과가 있음을 나타냅니다. MTT 분석은 PhG가 PC12 세포에 대한 용량 의존적 신경보호 효과를 나타냄을 보여주었다.

결론적으로 A{0}} 및 H2O{2}}유도 PC12 세포 손상을 포함하는 AD의 시험관 내 모델이 성공적으로 확립되었습니다. PhGs 처리는 A 1-42 또는 H2O2로 처리된 PC12 세포에 의한 세포 생존력을 증가시키고 LDH 및 MDA 방출을 감소시켰습니다. PhG는 A 1-42- 또는 H2O{10}}유도 세포 손상에 상당한 신경 보호 효과가 있었습니다.

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