Wen-Lan Li, Jing-Xin Ding, Jing Bai, Yang Hu, Hui Song, Xiang-Ming Sun, Yu-Bin Ji

자세한 내용은 다음으로 문의하십시오.Joanna.jia@wecistanche.com

추상적인

LC Technology는 중국 전통 의약품(TCM)의 품질을 평가하기 위해 전 세계적으로 사용되는 인정된 방법입니다. TCM의 품질은 효능에 직접적인 영향을 미칩니다. 그러므로 한의학이 어떻게 그 효능을 발휘하는지 철저히 밝히기 위해서는 먼저 그 효능에 대한 물질적 근거를 이해한 다음 활성 화합물의 품질을 제어할 필요가 있습니다. 스펙트럼 효과 관계 방법의 적용은 약리학적 물질 기반을 결정하는 데 중요합니다. 이 논문의 목표는 화학적 프로필과 에스트로젠 활성 사이의 근본적인 상관관계를 조사하는 것이었습니다.시스탄체, 활성 화합물을 표시합니다. 의 화학적 프로파일시스탄체HPLC/Q-TOF-MS/MS를 사용하여 기록하였고, 에스트로겐 활성은 자궁 성장 테스트 및 MTT 분석에 의해 결정되었습니다. 그런 다음 이변량 분석, 주성분 분석 및 회색 상관 분석 방법의 결과를 결합하여 15개의 활성 화합물을 식별했습니다. 그들은 8-에필로간산, 살리드로사이드, 시린갈리드 A 3'{4}}l-람노피라노사이드, 시스타노사이드 A, 에키나코사이드, 시스타노사이드 F, 시스타노사이드 B, 시스타노사이드 C, 오스만투사이드 B, 악테오사이드, 이소악테오사이드, 튜불로사이드 B, '-acetylacteoside, 그리고 2개의 미지의 화합물. 이 연구는 생체 내 연구의 토대를 마련합니다.시스탄체, 그리고 임상 응용 프로그램의 개발을 위해.

시스탄체세뇨관

키워드:시스탄체데저티콜라; LC/Q-TOF-MS; 에스트로겐 활성; 주성분 분석(PCA); 자궁 성장 검사.

약어

TCM: 중국 전통 의학

HPLC/Q-TOF-MS: 고성능 액체 크로마토그래피/4중극자 비행 시간 질량 분석기

BA: 이변량 분석

PCA: 주성분 분석

GCAM: 회색 상관 분석 방법

MTT:트립신, 3-(4, 5-디메틸티아졸-2-일)-2, 5-디페닐테트라졸륨브로마이드

DMSO: 디메틸 설폭사이드

RPMI1640 로스웰 공원 기념 연구소 1640

1. 소개

최근 한의학은 안정적인 치료 효과와 임상에서의 낮은 독성으로 인해 아시아 및 서구 국가에서 점점 더 대중화되고 있습니다. 결과적으로 새로운 유형의 TCM을 개발하고 임상 적용 중에 사용되는 효과적인 구성을 이해하는 것이 필요합니다[{0}}].

첫째, 크로마토그래피 지문과 약력학 효능 사이의 상관관계를 식별하기 위해 스펙트럼 효과 관계를 연구합니다. 그런 다음 관계를 사용하여 TCM에서 효과적인 구성 요소를 찾고 내부 품질을 반영하는 제어 표준을 공식화합니다. 스펙트럼 효과 관계는 단일 및 복합 TCM의 재료 기반, 구성 요소 호환성, 처리 메커니즘, 약리학적 효과 예측 및 기술 최적화와 같은 TCM 연구의 많은 영역에서 적용되었습니다[7-12]. 스펙트럼 효과 관계는 활성 물질 탐색, 공식 최적화, 준비 과정 개선, 표적 성분 추적 및 분리, 새로운 TCM 약물 개발을 위한 새로운 아이디어와 방법을 제시하는 데 사용됩니다[13-17].

시스탄체성기능 장애, 변비, 전립선염 및 신장 결핍증의 치료에 널리 사용되었습니다. 그것은 에스트로겐 효과, 노화 방지, 항산화 및 면역 작용[18-19]을 포함한 광범위한 생체 활성을 가지고 있습니다. 일반적으로 페닐에타노이드 배당체(예: cistanoside A, tubuloside A), 리그난 및 이리도이드 배당체는 Cistanche 및 그 제품의 품질 관리를 위한 약리 성분 및 화학적 마커로 간주되었습니다[20-21]. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)[22-23]를 사용하여 다양한 지역에서 Cistanche의 화학 스펙트럼을 기록했습니다. 이 연구에서 우리는 에스트로겐 활성을 평가하기 위해 자궁 성장 검사와 MCF7 세포 증식 분석을 선택합니다. 주성분 분석, 이변량 분석 및 회색 상관 분석 방법을 사용하여 개별 구성 요소와 에스트로겐 활성의 상관 관계를 확인했습니다. 이 연구는 생체 내 에스트로겐 효과에 책임이 있는 Cistanche의 생리 활성 화합물을 식별하는 것을 목표로 하고 있습니다. 이 연구는 Cistanche에 대한 심층 연구의 토대를 마련합니다.

모든 실험 절차는 Harbin University of Commerce의 동물 윤리 위원회에서 검토하고 승인했습니다.

시스탄체Deserticola(cd{0}})는 의약품 시장에서 구입했으며 Zhang Delian 교수(Harbin University of Commerce)가 확인했습니다. Diethylstilbestrol은 HEFEI JIULIAN PHARMACEUTICAL CO., LTD.에서 구입했습니다. 페놀 레드가 없는 RPMI1640 및 RPMI1640은 HyClone Company(미국)에서 구입했습니다. MTT 및 DMSO는 모두 Sigma-Aldrich Co. LLC(St Louis, USA)에서 구입했습니다. 인간 유방암 MCF7 세포주는 생명 과학 및 환경 과학 연구 센터(하얼빈 상공 대학)에서 제공했습니다. 사용된 표준은 다음과 같습니다. 악테오사이드(111530- 200505), 에키나코사이드(111670-200503) 및 살리드로사이드(110736-200628)는 National Institute for Control of Pharmaceutical and Biological Products(Beijing , 중국). 아세토니트릴, 메탄올 및 포름산은 MS 등급인 반면 물은 초순수였습니다. 다른 시약은 분석 등급이었고 상업적으로 이용 가능했습니다.

2 실험 절차

2.1 재료

Agilent 1290 HPLC 시스템, Agilent 6530 시리즈 Quadrupole Time-of-Flight LC/MS(Q-TOF) 시스템 및 Chemical HPLC{5}}D 워크스테이션은 분석 화학 실험 및 데이터 처리에 사용되었습니다. Milli-Q 초순수는 샘플 및 표준 준비에 사용되었습니다. 추가 기기에는 전자 분석 저울 AR1140(Ohaus International Ltd), 680 Microplate Reader(Bio-Rad Corporation) 및 64R 고속 원심 분리기(Beckman Coulter Allegra)가 포함됩니다.

미성숙 암컷 Kunming 마우스(출생 후 약 21일, 이유) 무게(12 ± 2)g을 Changchun National Biological Industry Base Laboratory Animal Center(Changchun, China)에서 구입했습니다. 마우스는 음식과 물에 제한 없이 접근할 수 있는 온도 조절된 방(22 ± 2도)에 수용되었습니다. 동물 실험은 순응 5일 후에 시작되었습니다. 시험 용액을 투여하기 전에 마우스를 물에 자유롭게 접근하면서 밤새 금식시켰다. 이 연구는 국립 보건원의 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침의 권장 사항에 따라 엄격하게 수행되었습니다.

2.2 시료 용액의 준비

시스탄체샘플은 Neimeng, Xinjiang, Ningxia, Guizhou, Chaidamu, Xizang, Alashan, Qinghai, Sichuan 및 Hubei 지방과 같은 10개의 다양한 서식지에서 수집되었습니다.

용액(1.{1}} g/mL)시스탄체샘플은 경구 투여를 위해 증류수에서 준비되었습니다. 디에틸스틸보에스트롤의 농도는 20ug/mL이었고 양성대조액으로 사용하였다. Cistanche 샘플의 용액(1.0g/mL)은 50% 아세토니트릴에서 제조되었습니다. Acteoside, echinacoside 및 salidroside(각각 2.0mg)를 10mL의 50% 아세토니트릴 용액에 용해시켰다. 샘플 및 표준 용액은 모두 분석 전에 0.{9}}μm 필터를 사용하여 필터링되었습니다.

2.3 LC-MS 조건

Waters Symmetry Shield RP18(3.9mm×15{5}}mm, 5μm; Waters Corporation, Milford, MA, USA)을 사용하여 샘플을 분석했습니다. 이동상은 아세토니트릴(A) 및 0.2%(v/v) 포름산 수용액(B)으로 구성되었으며 0.5mL/분의 유속으로 펌핑되었습니다. 각 샘플의 주입 부피는 10 μL였습니다. 기울기 용출 프로그램은 다음과 같습니다. 이동상 A는 5%에서 시작하여 35분에 23%까지 선형으로 증가했습니다. 용액 A는 이후에 25%로 증가되었습니다(35분에서 65분). 그런 다음 이동상 A는 실행의 마지막 5분(65~70분) 동안 5%로 감소했습니다. 컬럼 온도는 30도를 유지하였다. 크로마토그램을 254 nm에서 모니터링했습니다. 분무 가스 압력은 30psi이고 모세관 전압은 3.5kV였다. 건조 가스의 유량은 30도의 온도에서 8L/min으로 설정하였다. 질량 스펙트럼은 100- 3,{28}} Da의 스캔 범위 내에서 기록되었으며 음이온 스캐닝 모드에 있었습니다.

2.4 지문 평가

10개의 서로 다른 배치에서 수집한 샘플의 LC 지문을 설정하고 TCM의 크로마토그래피 지문 유사성 평가 시스템(버전 2012; 중국 약전 위원회, 베이징, 중국)을 사용하여 자동으로 일치시켰습니다. 또한, 중앙값 방법을 사용하여 참조 크로마토그램 맵을 생성했습니다. 또한 10개의 다양한 서식지에서 샘플의 품질을 평가하기 위해 클러스터 분석을 적용했습니다.

2.5 주성분 분석(PCA)

PCA는 다변수 통계 방법입니다. 데이터 수집에서 충분한 정보를 유지할 수 있습니다. 현재 연구에서 LC 크로마토그램의 특징적인 피크는 PCA에 의해 추가로 스크리닝되었으며 스펙트럼 효과 관계를 기반으로 활성 화합물을 식별하는 것을 목표로 했습니다.

2.6 자궁 성장 검사

마우스를 12개 그룹(그룹당 1{11}})으로 나누었습니다. Cistanche에서 제조된 샘플 용액은 10개의 다양한 서식지에서 수집되었고 4일 동안 30g/kg 체중의 용량으로 위관 영양법에 의해 매일 2회(아침과 저녁) 투여되었습니다. 블랭크 및 양성 대조군은 동일한 부피의 증류수 및 디에틸스틸보에스트롤 용액으로 구성되었으며 4일 동안 매일 2회 투여되었습니다. 5일째에 마취된 마우스에서 약물 함유 혈액 샘플을 채취했습니다. 샘플을 원심분리하고(5,{5}} rpm, 10분), 상청액(약물 함유 혈청 샘플)을 분리했습니다. 약물이 포함된 혈청 샘플은 수조에서 30분 동안 56도에서 가열하여 비활성화하고 MTT 분석 전에 0.{12}μm 필터를 통해 여과했습니다. 동시에, 마우스의 자궁을 즉시 절제하고 무게를 달아 자궁 중량 지수를 계산했습니다. 동물 실험은 순응 5일 후에 시작되었습니다. 마우스는 시험 용액을 투여하기 전에 물에 자유롭게 접근하면서 밤새 금식했습니다. 본 연구는 국립보건원 실험동물의 관리 및 사용에 대한 지침의 권고에 따라 엄격하게 수행되었습니다. 모든 실험 절차는 Harbin University of Commerce의 동물 윤리 위원회에서 검토하고 승인했습니다. 잠재적으로 스트레스를 줄 수 있는 모든 절차는 나트륨 펜토바르비탈 마취하에 수행되었습니다.

2.7 MTT 분석

MCF7 세포를 4일 동안 페놀 레드(5% CDT-FBS 함유) 없이 RPMI 1640과 함께 공동 배양했습니다. 세포를 96-웰 플레이트에 2,{7}}세포/웰의 밀도로 시딩했습니다. 부착 배양이 달성되었고 72시간의 배양 후, 세포를 Cistanche 처리된 마우스의 혈청 샘플을 함유하는 RPMI 1640 배지에서 공동 배양하였다. 실험은 6번의 복제로 수행되었습니다. 이어서, 20 μL의 MTT 용액(PBS 중 5 mg/mL)을 각 웰에 첨가하고, 세포를 4시간 동안 인큐베이션하였다. 배지를 제거한 후 150 μL의 DMSO를 첨가하여 formazan 생성물을 생성하고 플레이트를 어둠 속에서 흔들어 완전히 용해시켰다. 흡광도는 Microplate Reader를 사용하여 570 nm에서 측정하였다. 증식율은 약물 함유 혈청군의 평균 흡광도 값을 블랭크 대조군(혈청이 없는 RPMI 1640에서 공배양된 세포)의 평균 흡광도 값으로 나눈 값으로 계산하였다.

2.8 통계 분석

paired-sample t-test(two-tailed)는 빈 대조군과 실험군의 값 사이에 통계적으로 유의한 차이를 식별하는 데 사용되었습니다. 차이는 95% 신뢰 수준에서 유의미한 것으로 간주되었습니다(p <>

PCA는 10개의 다양한 서식지에서 채취한 샘플의 크로마토그램에서 특징적인 피크 영역을 평가하는 데 사용되었습니다. 이변량 분석 및 회색 상관 분석을 사용하여 피크 영역과 에스트로겐 활성의 상관 관계를 평가했습니다. 상관 관계는 SPSS 통계 소프트웨어 통계(Windows 21용 SPSS.{1}}, SPSS Inc., USA)에 의해 계산되었습니다. 차이는 95% 신뢰 수준(양측)에서 유의미한 것으로 간주되었습니다.

윤리적 승인: 수행된 연구는 인간 또는 동물 사용과 관련이 없습니다.

3 결과 및 논의

3.1 클러스터 분석 및 유사성 평가

머무름 시간과 특성 피크의 피크 면적의 상대 표준 편차는 {{0}}.58 및 0.34%, 정밀도는 0.52 및 {{8} 재현성은 }.31%, 안정성은 {{10}.19 및 0.13%입니다. 이러한 결과는 지문 설정의 LC 방법이 합리적이고 신뢰할 수 있음을 나타냅니다. 10개 샘플의 크로마토그램 유사도는 0.9보다 컸습니다. 모든 샘플의 공통 피크는 피크가 손실될 수 있기 때문에 Cistanche의 특징적인 구성 요소를 완전히 나타낼 수 없습니다. 따라서 보다 정확한 크로마토그램 맵을 얻기 위해 샘플 매칭 수를 26에서 20으로 조정하였다. 총 26개의 피크를 얻었고, 그 면적의 합은 샘플의 전체 피크 면적과 비교하여 0.8보다 컸다. 따라서 우리는 이러한 크로마토그래피 피크가 Cistanche의 주요 화학 성분을 효과적으로 반영할 수 있다고 결론지었습니다. 클러스터 분석 결과는 그림 1에 나와 있습니다. 총 10개의 다양한 서식지가 다음과 같이 세 가지 범주로 구분되었습니다. (A) 2, Guizhou; 3, 칭하이; 4, 차이다무; 10, 네멍; 7, 신장 및 6, 쓰촨. (B) 1, Xizang; 8, Ningxia 및 5, Alashan. (C) 9, 후베이. 클러스터 분석의 경향은 한약재의 서식지가 임계값의 바닥에 있을 때 유사함을 보여주었다. 그러나 임계 값이 증가함에 따라 서식지의 기후와 성장 조건이 가깝습니다. 군집분석을 통해 다양한 서식지를 잘 구별할 수 있을 뿐만 아니라 이들 간의 친화도를 반영할 수 있음을 알 수 있다.

3.2 화학성분의 확인

Based on the synergy between components, TCM exerted pharmacological effects. Certain studies have been conducted to identify the chemical compositions of C. deserticola [24-26]. The correlation of inherent constituents with their activities indicated that they could be identified based on the combination of LC with the corresponding indices of pharmacological activity. Q-TOF-MS is suitable for multi-constituent identification of TCM since it can provide the exact molecular mass because of its high resolution. A total of 26 compounds were identified by analyzing the primary and secondary MS data. PCA was used to assess whether these compounds concerning their oestrogenic activity. A contribution of the activity is indicated by an eigenvalue higher than 1 (> 1) and a cumulative contribution rate of variables higher than 0.8 (>0.8). 고유 부하의 절대값이 높을수록 에스트로겐 지수에 대한 화합물의 영향이 높아집니다.

Cistanche와 표준 시료의 크로마토그램을 비교하여 동일한 LC-MS 조건에서 개별 성분을 식별했습니다. Table 1과 같이 머무름 시간과 MS 데이터[24-26]를 기준으로 총 26개의 성분을 확인하였다. 활성 성분은 한약재가 혼합물의 형태로 치료 역할을 하는 것처럼 단량체가 아닌 혼합물의 형태로 경구 투여됩니다. 개별적으로 분리된 단일 화합물은 역할을 하지 않는 것으로 나타났습니다. 우리의 목표는 Cistanche [23-30]의 알려진 구성 요소에서 에스트로겐 활성이 있는 화합물을 밝히는 것이므로 NMR 및 기타 기술적 수단을 선택하여 그 정체를 확인하지 않았습니다. 피크 1은 geniposidic acid의 원소 조성과 동일한 373(C16H22O10)의 m/z 비율을 갖는 우세한 탈양성자 이온을 나타냅니다. 이것은 m/z 비율이 211인 단편 이온을 생성하는 포도당 부분의 손실에 의해 뒷받침되었습니다. 피크 2는 원소 조성과 동일한 461(C20H30O12)의 m/z 비율을 갖는 우세한 탈양성자 이온을 나타냅니다. decaffeoylacteoside의 daffeoylacteoside, 그리고 rhamnosyl 부분의 손실에 의해 지원되어 m/z 비율이 315인 단편화를 형성했습니다. 피크 4는 m/z 비율이 375(C16H24O10)인 우세한 탈양성자 이온을 나타냈으며, 이는 8-에필로간산의 원소 조성. m/z 비율이 213인 단편화를 형성한 포도당 모이어티의 손실은 추론을 더욱 뒷받침했습니다. 피크 6은 syringalide A3'{30}} l-rhamnopyranoside의 원소 조성과 동일한 607(C29H36O14)의 m/z 비율을 갖는 우세한 탈양성자 이온을 나타냅니다.

445의 m/z 비율로 단편 이온을 형성한 caff 부분의 손실은 추론을 더욱 뒷받침합니다. 피크 8은 m/z 비율이 799(C36H48O20)인 우세한 탈양성자 이온을 나타내며, 이는 cistanoside A의 원소 조성과 동일합니다. caff 부분의 손실은 m/z 비율이 637인 단편 이온을 형성했으며, 추론을 더 뒷받침했다. 피크 11은 m/z 비율이 487(C21H28O13)인 우세한 탈양성자 이온을 나타냈으며, 이는 cistanoside F의 원소 조성과 동일합니다. 이는 m/z를 갖는 단편 이온을 생성하는 람노실 부분의 손실에 의해 뒷받침되었습니다. 비율이 341이고 다른 caff 부분의 손실이 m/z 비율이 179인 단편 이온을 형성하여 추론을 더욱 뒷받침했습니다. 피크 12는 m/z 비율이 813(C37H50O20)인 우세한 탈양성자 이온을 나타내며, 이는 cistanoside B의 원소 조성과 동일합니다. 포도당 부분의 손실은 m/z 비율이 651인 단편 이온을 형성했으며, 추론을 더 뒷받침했다. 피크 13은 m/z 비율이 827(C37H48O21)인 우세한 탈양성자 이온을 나타내며 이는 tubuloside A의 원소 조성과 동일합니다. 람노실 부분의 손실은 m/z 비율이 681인 단편화를 형성했습니다. 추론을 뒷받침했다. 피크 14는 m/z 비율이 637(C30H38O15)인 우세한 탈양성자 이온을 나타내며, 이는 cistanoside C의 원소 조성과 동일합니다. 람노실 부분의 손실은 m/z 비율이 491인 단편 이온을 형성했습니다. 추론을 더 뒷받침했다.

피크 15는 591의 m/z 비율(C29H36O13)을 갖는 우세한 탈양성자화된 이온을 나타내며, 이는 오스만투사이드 B의 원소 조성과 동일합니다. 람노실 부분의 손실은 445의 m/z 비율을 갖는 단편 이온을 형성하고, 추론을 더 뒷받침했다. 피크 16은 m/z 비율이 623(C29H36O15)인 우세한 탈양성자 이온을 나타내며, 이는 악테오사이드의 원소 조성과 동일합니다. m/z 비율이 461인 단편 이온을 형성하는 caff 부분의 손실은 추론을 더욱 뒷받침합니다. 피크 18은 isoacteoside의 원소 조성과 동일한 623(C29H36O15)의 m/z 비율을 갖는 우세한 탈양성자 이온을 나타냅니다. caff 모이어티의 손실, 앞부분 15는 591(C29H36O13)의 m/z 비율을 갖는 우세한 탈양성자화 이온을 나타내며, 이는 오스만투사이드 B의 원소 조성과 동일합니다. 람노실 모이어티의 손실은 445의 m/z 비율은 추론을 더욱 뒷받침했습니다. 피크 16은 m/z 비율이 623(C29H36O15)인 우세한 탈양성자 이온을 나타내며, 이는 악테오사이드의 원소 조성과 동일합니다. m/z 비율이 461인 단편 이온을 형성하는 caff 부분의 손실은 추론을 더욱 뒷받침합니다. 피크 17은 cis-acteoside의 원소 조성과 동일한 623(C29H36O15)의 m/z 비율을 가진 우세한 탈양성자 이온을 나타냅니다. m/z 비율이 461인 단편 이온과 단편을 형성한 caff 모이어티의 손실은 추론을 더욱 뒷받침합니다. Peak 21은 m/z ratio 653(C30H38O16)으로 deprotonated ion이 우세한 것으로, campneoside Ⅰ의 원소 조성과 동일하였다.

caff 부분의 손실은 m/z 비율이 491인 단편 이온을 형성하고, 다른 rhamnosyl 부분의 손실은 m/z 비율이 345인 단편 이온을 형성하여 추론을 더욱 뒷받침합니다. 피크 22는 m/z 비율이 665(C31H38O16)인 우세한 탈양성자 이온을 나타내며 이는 튜불로사이드 B의 원소 조성과 동일합니다. CH3 CO 부분의 손실은 m/z 비율이 623인 단편 이온을 형성했으며, 또 다른 caff 부분의 손실은 m/z 비율이 461인 단편 이온을 형성하여 추론을 더욱 뒷받침합니다. 피크 23은 m/z 비율이 639(C29H36O16)인 우세한 탈양성자 이온을 나타내며 이는 campneoside의 원소 조성과 동일합니다. 493의 m/z 비율로 단편 이온을 형성하는 람노실 부분의 손실은 추론을 더욱 뒷받침합니다. 피크 24는 m/z 비율이 665(C31H38O16)인 우세한 탈양성자 이온을 나타내며, 이는 2'-아세틸락테오사이드의 원소 조성과 동일합니다. Ac 부분의 손실은 m/z 비율이 623인 단편 이온을 형성하고, 다른 caff 부분의 손실은 m/z 비율이 461인 단편 이온을 형성하여 추론을 더욱 뒷받침합니다. 피크 25는 cistanoside G의 원소 조성과 동일한 445의 m/z 비율(C20H30O11)을 갖는 우세한 탈양성자화된 이온을 나타냅니다. 람노실 부분의 손실은 m/z 비율이 299인 단편 이온을 형성했으며, 추론을 더 뒷받침했다. 화합물의 구조는 그림 2에 나와 있습니다.

3.3 PCA

As shown in Table 2, the eigenvalues of the first eight principal components were higher than 1(> 1), and the cumulative contribution rate of the first six principal components was 93.417%. Therefore, the first six principal components were evaluated further. Table 2 indicates their eigenvalues and factor loadings. The first principal component exhibited a higher load based on the eigenvalues of the eight peaks (>0.9). 이러한 피크는 9, 12, 14 및 15였습니다. 결과적으로 총 4개의 피크에 해당하는 echinacoside, cistanoside B, osmanthhuside B 및 acteoside가 에스트로겐 활성에 대한 대표 변수로 선택되었습니다(그림 3).

.

3.4 에스트로겐 활성 측정

각 마우스의 체중에 대한 자궁 습윤 중량의 비율을 계산했습니다(그림 4). 9개 서식지에서 Cistanche에 노출된 동물은 빈 대조군의 마우스와 비교하여 자궁 무게를 증가시켜 상당한 에스트로겐 활성을 나타냈습니다. 도 4는 Cistanche-처리 마우스의 혈청으로 처리된 MCF7 세포의 증식 속도를 추가로 보여준다. 10개 서식지에서 Cistanche를 투여한 마우스의 혈청으로 처리된 세포는 처리하지 않은 세포와 비교하여 유의하게 더 높은 성장을 나타냈다.

3.5 이변량 분석

본 연구에서 우리는 미성숙 암컷 Kunming 마우스의 자궁 무게가 증가하고 MCF7 인간 유방암 세포의 증식이 촉진되는 것을 관찰했습니다. 이러한 결과는 Cistanche의 에스트로겐 활성을 입증했습니다. 도 5는 이들 성분의 자궁 지수 및 MCF7 세포 증식율을 나타내었다. 피어슨 상관 계수는 샘플의 에스트로겐 활성에 해당하는 상대 피크 면적을 계산하는 데 사용되었습니다. 0.3보다 높은 상관 계수는 유의미한 것으로 간주되었으며(p < 0.05),="" 0.5보다="" 높은="" 상관="" 계수는="" 매우="" 유의한="" 것으로="" 간주되었습니다(p="">< 0.01).="" 결과에="" 따르면="" cistanche는="" 에스트로겐="" 활성이="" 있는="" 것으로="">

총 9개의 화합물이 자궁 무게의 증가와 유의한 상관관계가 있는 반면(p < {0}}.05),="" 10개의="" 화합물은="" mcf7="" 세포="" 증식과="" 유의한="" 상관관계가="" 있었습니다(p="">< 0.05).="" 자궁="" 무게="" 및="" 세포="" 증식과="" 유의하게="" 상관관계가="" 있는="" 화합물은="" 8-에필로간산,="" 살리드로사이드,="" 시린갈리드="" a3'-="" -="" l-람노피라노사이드,="" 시스타노사이드="" a,="" 시스타노사이드="" b,="" 시스타노사이드="" c,="" 오스만투사이드="" b,="" 악테오사이드,="" 이소악테오사이드,="" 튜불로사이드였습니다.="" b,="" 2'-acetylacteoside="" 및="" 두="" 개의="" 미지의="" 화합물(그림="" 5).="" 이="" 13가지="" 화합물은="" 에스트로겐="" 활성을="">

3.6 그레이 상관 분석 방법

도 6은 26개 화합물의 특성 피크와 자궁 지수의 상대적인 상관관계를 나타내고, 도 7은 26개 화합물의 특성 피크와 세포 증식 속도의 상대적인 상관관계를 보여줍니다. 총 3개의 화합물, 즉 8-epiloganic acid, cistanoside F 및 acteoside가 자궁 지수와 가장 높은 상관관계를 나타냈습니다(그림 6, 내림차순). MCF7 세포 증식과 가장 높은 상관관계를 나타내는 6가지 화합물은 에키나코사이드, 시스타노사이드 F, 시스타노사이드 B, 오스만투사이드 B, 이소악테오사이드 및 튜불로사이드 B였습니다(그림 7, 내림차순). echinacoside, osmanthhuside B, acteoside, isoacteoside의 상대적 상관관계는 0.5보다 높았다.

3.7 LC-MS 조건의 최적화

더 나은 크로마토그램 맵을 얻기 위해 메탄올과 아세토니트릴을 비교했습니다. 최종적으로 수성 포름산({0}}.2%, v/v)-아세토니트릴의 조합이 분리에 가장 적합한 이동상이었습니다. 200-400nm 전체 파장 스캐닝 범위에서 254nm가 최적으로 선택되었습니다. 또한 MS 매개변수도 개선되었습니다. 음이온 스캐닝 모드를 선택한 이유는 Cistanche의 대부분의 성분에 대한 반응 값을 개선했기 때문입니다.

4 결론

LC-Q-TOF-MS 기술을 사용하여 Cistanche의 에스트로겐 활성 성분을 식별했습니다. 본 연구에서는 8-epiloganic acid, salidroside, syringalideA3'- -l-rhamnopyranoside, cistanoside A, echinacoside, cistanoside F, cistanoside B, cistanoside C, osmanthhuside B, acteoside, isoacteoside, tubuloside 2'-acetylacteoside와 두 가지 미지의 화합물이 Cistanche의 주요 활성 성분이었습니다. 그러나 이러한 발견은 구성 요소의 생체 내 효과와 작용 메커니즘을 탐구하기 위한 추가 연구가 필요합니다.

감사의 말:

이 프로젝트는 중국 국립자연과학재단(No. 81073015), 흑룡강성 자연과학재단(ZD2017014), 흑룡강성 대학의 젊은 혁신 인재 양성 계획(UNPYSCT-2017209)의 지원을 받았습니다. . 저자는 이 논문의 출판과 관련하여 이해 상충이 없음을 선언합니다.

참고문헌

[1] Wang Z., Xia Q., Liu X., Liu W., Huang W., Mei X., Luo J., Shan M., Lin R., Zou D., Ma Z., 식물화학, 약리학 , 품질 관리 및 Forsythia suspensa(Thunb.) Vahl: A review, J. Ethnopharmacol., 2018, 210, 318- 339.

[2] Shu Y., Liu Z., Zhao S., Song Z., He D., Wang M., Zeng H., Lu C., Lu A., Liu Y., 통합 및 글로벌 pseudotargeted metabolomics 전략 적용 Citrus TCMs의 품질 관리 마커에 대한 스크리닝, Anal. 바이오애널. Chem., 2017, 409(20), 4849-4865.

[3] Yang B., Wang Y., Shan L., Zou J., Wu Y., Yang F., Zhang Y., Li Y., Zhang Y., 새롭고 실용적인 크로마토그래피 "Fingerprint-ROC-SVM" " 한약 주사제의 품질 분석에 적용된 전략: 사례 연구로 KuDieZi 주사제 사용, 분자., 2017, 22

(7). 개인 식별 정보: E1237.[4] Zhuo L., Peng J., Zhao Y., Li D., Xie X., Tong L., Yu Z., 초고성능 액체 크로마토그래피 지문 간의 관계를 기반으로 한 QiShenYiQi 점적약의 생리 활성 품질 관리 마커 스크리닝 및 혈관 보호 활성, J. Sep. Sci., 2017, 40(20), 4076-4084.

[5] Liu N., Li J., Li BG, 다변수 통계 분석 및 한약 품질 관리 사고의 응용, Zhongguo. 중. 야오. 자. 지., 2014, 39

(21), 4268-4271.

[6] Wang DD, Liang J., Yang WZ, Hou JJ, Yang M., Da J., Wang Y., Jiang BH, Liu X., Wu WY, Guo DA, HPLC/qTOF-MS 지향 특성 성분 데이터 복잡한 TCM 제제의 전체적인 품질 관리를 위한 세트 및 화학 측정 분석: Niuhuang Shangqing 환약의 예, J. Pharm. 바이오메드. Anal., 2014, 89, 130-141. [7] Hernaez R., Thrift AP, 높은 음수 예측값, 낮은 유병률 및 스펙트럼 효과: 해석상의 주의, Clin. 위장병. Hepatol., 2017, 15(9), 1355-1358.

[8] Liang J., Chen Y., Ren G., Dong W., Shi M., Xiong L., Li J., Dong J., Li F., Yuan J., Euodia rutaecarpa의 간독성 성분 스크리닝 스펙트럼-독성 관계 기반 UHPLC-QTOF/MS, 분자., 2017, 22(8). 개인 식별 정보: E1264.

[9] Li W., Sun X., Liu B., Zhang L., Fan Z., Ji Y., 스펙트럼 효과 관계 및 UPLC-Q-TOFMS에 기반한 Evodia rutaecarpa의 간독성 성분 스크리닝 및 식별, Biomed . Chromatogr., 2016, 30(12), 1975-1983.

[10] Chopard G., Puyraveau M., Binetruy M., Meyer A., ​​Vandel P., Magnin E., Berger E., Galmiche J., Mauny F., 스크리닝 테스트 성능의 스펙트럼 효과 및 스펙트럼 바이어스 기억상실 경증 인지 장애: 임상적 의미는 무엇입니까?, J. 알츠하이머. Dis., 2015, 48(2), 385-393.

[11] Xu GL, Xie M., Yang XY, Song Y., Yan C., Yang Y., Zhang X., Liu ZZ, Tian YX, Wang Y., Jiang R., Liu WR, Wang XH, She GM, 중국 전통 의학 연구에 대한 체계적인 접근으로서의 스펙트럼 효과 관계: 현재 상태 및 미래 전망, Molecules., 2014, 19(11), 17897-17925.

[12] Zheng Q., Zhao Y., Wang J., Liu T., Zhang B., Gong M., Li J., Liu H., Han B., Zhang Y., Song X., Li Y. , Xiao X., UPLC 지문과 Aconitum carmichaelii Debeaux(Fuzi)의 생물학적 활성과 미토콘드리아 성장에 대한 세 가지 가공 제품 간의 스펙트럼 효과 관계, J. Ethnopharmacol., 2014,153(3) , 615-623.

[13] Shi Z., Liu Z., Liu C., Wu M., Su H., Ma X., Zang Y., Wang J., Zhao Y., Xiao X., 화학 지문 간의 스펙트럼 효과 관계 및 Lonicerae Japonicae Flos 및 Lonicerae Flos Base의 UPLC 및 미세 열량 측정에 대한 항균 효과, 전면. Pharmacol., 2016, 7, 12.

[14] Usher-Smith JA, Sharp SJ, Griffin SJ, 위험 예측, 선별 및 진단 테스트의 스펙트럼 효과, BMJ, 2016, 353, i3139.

[15] Chen Y., Yu H., Wu H., Pan Y., Wang K., Liu L., Jin Y., Zhang C., 스펙트럼에 의한 Flos Sophorae의 총 플라보노이드 가열 제품에서 새로운 지혈 화합물 추적 -효과 관계 및 컬럼 크로마토그래피, J. Sep. Sci., 2015, 38(10), 1691-1699.

[16] Liu X., Wang XL, Wu L., Li H., Qin KM, Cai H., Pei K., Liu T., Cai BC, Da-Huang-Fu-의 스펙트럼 효과 관계에 대한 조사 UHPLC-ESI-Q-TOF-MS 방법에 의한 쥐의 Zi-Tang, J. Ethnopharmacol., 2014, 154(3), 606-612.

[17] Xie RF, Zhou X., Shi ZN, Li YM, Li ZC, Rhizoma Rhizoma, Magnoliae Officinalis 피질, Fructus Aurantii Immaturus 및 그 공식의 스펙트럼 효과 관계 연구, J. Chromatogr. Sci., 2013, 51(6), 524-532. [18] Li F., Yang X., Yang Y., Guo C., Zhang C., Yang Z., Li P., 난소 절제된 쥐에서 echinacoside의 Antiosteoporotic activity, Phytomedicine., 2013, 20(6), { {9}}.

[19] Xiong WT, Gu L., Wang C., Sun HX, Liu X., 2형 당뇨병 DB/DB 마우스에서 Cistanche tubulosa의 항고혈당 및 고지혈증 효과, J. Ethnopharmacol., 2013, 150(3) , 935- 945.

[20] Morikawa T., Ninomiya K., Imamura M., Akaki J., Fujikura S., Pan Y., Yuan D., Yoshikawa M., Jia X., Li Z., Muraoka O., 아실화 페닐에타노이드 배당체 , echinacoside 및 Cistanche tubulosa의 악테오사이드는 생쥐의 내당능을 개선합니다, J. Nat. Med., 2014, 68(3), 561-566.

[21] Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y., Tu PF, Fitoterapia의 Tarim 사막에서 배양된 Cistanche Deserticola의 줄기에서 항염 작용이 있는 Phenylethanoid 배당체, 2013, 89, {{4 }}.

[22] Lu D., Zhang J., Yang Z., Liu H., Li S., Wu B., Ma Z., 다이오드 어레이 검출 및 고성능 액체 크로마토그래피와 결합된 고성능 액체 크로마토그래피를 사용한 Cistanches Herba의 정량 분석 화학 측정 방법과 결합된 분해능 질량 분석, J. Sep. Sci., 2013, 36(12), 1945-1952.

[23] Han L., Boakye-Yiadom M., Liu E., Zhang Y., Li W., Song X., Fu F., Gao X., Cistanches Deserticola YC Ma에 의한 페닐에타노이드 배당체의 구조적 특성화 및 식별 UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS, Phytochem. Anal., 2012, 23(6), 668-676.

[24] Xiang Y., Jing Z., Haixia W., Ruitao Y., Huaixiu W., Zenggen L., Lijuan M., Yiping W., Yanduo T., Lagotis brevituba Maxim, Phytother에서 분리된 페닐프로파노이드의 항증식 활성 . Res., 2017, 31(10), 1509-1520.

[25] Yan Y., Song Q., Chen X., Li J., Li P., Wang Y., Liu T., Song Y., Tu P., 광범위한 극성 및 함량 범위의 성분 동시 측정 직렬 결합 역상-친수성 상호작용 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법을 사용한 세뇨관, J. Chromatogr. A., 2017, 1501, 39-50.

[26] Zou P., Song Y., Lei W., Li J., Tu P., Jiang Y., Cistanche Deserticola에 대한 새로운 처리 워크플로 개발 및 다른 부분 식별을 위한 1H NMR 기반 대사체학 적용, 액타. 제약 죄. B., 2017, 7(6), 647-656.

[27] Pan YN, 신선한 Cistanche tubulosa의 성분 및 생리활성에 관한 연구, Ph.D. 논문, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang, China, 2011.

[28] Cui Q., ​​Pan Y., Xu X., Zhang W., Wu X., Qu S., Liu X., UPLC를 사용하여 시험관 내에서 인간 또는 쥐의 장내 세균 또는 장 효소에 의해 생성된 액테오사이드의 대사 프로파일 Q-TOF–MS, Fitoterapia., 2016, 109, 67-74.

[29] Cui Q., ​​Pan Y., Bai X., Zhang W., Chen L., Liu X., 쥐의 혈장, 담즙, 소변 및 대변에서 Cistanche tubulosa의 echinacoside 및 acteoside 대사 산물의 체계적인 특성 규명 UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Chromatogr., 2016(9), 1406-1415.

[30] Cui Q., ​​Pan Y., Yan X., Qu B., Liu X., Xiao W., 초고성능 액체 크로마토그래피를 사용하는 쥐에서 이소악테오사이드의 경구 전달에서 불량한 생체이용률을 유발하는 관련 장애물을 조사하는 대사 방법/ 사중극자 비행 시간 탠덤 질량 분석기, Rapid. 통신 질량 스펙트럼., 2017(4), 371-380.