HPTLC-농도계 스크리닝 및 곡물 가루 내 형광 미백제 오염 물질의 질량 식별
Mar 22, 2022
연락처: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 이메일:audrey.hu@wecistanche.com
Yisheng Chen1,2 & Caihong Huang1,2 & Xueming Xu
추상적인
최근 몇 년 동안 식품 안전 문제에 대한 우려가 증가하고 있습니다.형광증백제포장 재료에서. 여기에서, 우리는 고성능 박막에 의해 플랫폼화된 곡물 제품(밀과 쌀가루)에서 두 가지 일반적인 형광 증백제(FWA 184 및 FWA 367)의 고처리량 정량화 및 식별에 적합한 간편하고 신뢰할 수 있는 방법의 개발을 보고했습니다. 층 크로마토그래피. 첫째, 최적화된 고액 추출을 통해 샘플 준비 및 정리가 신속하게 수행되었습니다. 톨루엔과 에틸 아세테이트(1{7}}/0.3, v/v)의 혼합물을 이동상으로 사용하여 추출물과 참조 표준물질을 실리카겔 플레이트에서 동시에 분리했습니다. 그런 다음 형광 모드(365HPTLC다목적 분석 플랫폼은 처리량, 단순성 및 검출 가능성 사이에서 이상적인 균형을 달성할 수 있으므로 특히 화면 중심 식품 분석에 적합합니다.
키워드 HPTLC. 농도계.형광증백제
소개
최근 몇 년 동안 식품 포장재의 붐을 목격했습니다. 한편, 포장재와 관련된 식품 안전 문제도 전 세계적으로 주목을 받았습니다.형광증백제(FWA)가 특히 높은 관심을 받았습니다. FWA의 분자는 복사선을 흡수하는 동시에 가시광선을 방출할 수 있습니다. 이러한 변형은 물질의 노란색을 상쇄하여 흰색 인상을 강화할 수 있습니다. 따라서 식품 패키지에는 FWA가 포함된 재료가 집중적으로 고려되었습니다. 특히 시리얼 제품의 경우 이러한 패키지는 소비자의 매력도와 수용도를 높이는 데 유리하게 사용되었습니다. 예를 들어, 비정상적으로 높은 수준의FWA팝콘과 라면 판지에서 발견되었습니다(Jiang et al. 2015). 결과적으로 FWA는 곡물 식품으로 이동하여 오염을 초래하여 공중 보건에 새로운 도전을 제기했습니다.
수십 년 전, 의 현저하게 높은 안정성FWAFWA의 잠재적인 독성에 대한 집중적인 우려를 불러일으켰습니다. FWA가 인간 건강에 미치는 실제 영향은 아직 결정적이지 않았지만, FWA의 발달 독성 및 모델 동물에서 유전자 발현의 변경 효과는 실험적으로 입증되었습니다(Belliveau et al. 1990; Jung et al. 2012). .이러한 잠재적 위험과 관련하여 전 세계의 식품 안전 당국은 식품 접촉 물질에서 FWA를 전환할 수 있는 제한 및 제한을 규정했습니다.
이러한 법적 표준을 구현하기 위해 FWA 검출을 위해 주로 UV 형광 검사 또는 컬럼 크로마토그래피(HPLC 및 모세관 전기영동)를 기반으로 하는 다양한 분석 방법이 제안되었습니다(Jiang et al. 2015; Wu et al. 2018). . 그러나 실제의 관점에서 볼 때 이러한 모든 기존 방법은 비용 효율적이고 신뢰할 수 있는 스크리닝 원칙에 적응되지 않았습니다. 예를 들어, UV-형광 검사 방법은 열악한 선택도에서 큰 어려움을 겪었습니다. 한편, 컬럼 크로마토그래피 시스템을 기반으로 한 분석은 단순성과 비용 효율성 측면에서 현저한 부족을 보였습니다. 그에 반해 고성능 박막 크로마토그래피(HPTLC)는 식품 스크리닝 방법론의 새로운 지평을 열고 있었습니다.HPTLC단순성, 특이성 및 신뢰성 측면 사이의 격차를 이상적으로 채우면서 비할 데 없는 유연성을 보여주며 다양한 식품 성분의 분석에 개발 및 적용되었습니다(Galarce-Bustos et al. 2019; Li et al. 2018; Mikropoulou et al. 2019 ; Pedan et al. 2018; Premarathneet al. 2018; Stanek et al. 2019; Sun et al. 2018). 이러한 방식으로 많은 샘플(최대 40개)을 거의 무제한 매트릭스 허용 오차로 동시에 분석할 수 있습니다. 각 플레이트는 일회용이기 때문입니다(Li et al. 2019). 이는 샘플 정리 및 기기 유지 관리에 대한 요구가 현저하게 절약될 수 있음을 의미했습니다. 육안 검사에 대한 시행으로 농도계는 HPTLC 플레이트의 분리 결과를 정확하고 정확하게 측정할 수 있게 했습니다(Lebot et al. 2020). 하이픈 넣기 기술의 빠른 발전과 함께 HPTLC의 가장 큰 특징은 표면 강화 라만 분광법(Kang et al. 2019;Qu et al. 2018; Wang)과 같은 강력한 분석 도구의 사용성을 효율적으로 조립하는 플랫폼으로 사용할 수 있다는 것입니다. et al. 2018a, b), 바이오센서(AgatonovicKustrin et al. 2020; Chen et al. 2020a, b; Choma and Grzelak2011; Galarce-Bustos et al. 2019), 이미지/화학계량 분석(Rejšek et al. Liu 2021, Xu et al. 2019) 및 질량 검출(Wang et al. 2018a, b). 따라서 HPTLC는 특히 스크리닝 작업에 적합한 다목적 도구 상자였습니다.
이러한 배경에 대해 이 작업의 목적은HPTLC, 형광 농도 측정법(FLD) 및 질량 분석법(MS). 분석법 개발 후, 그 성능이 양적, 질적으로 검증되어 손쉬운 스크리닝 도구로서의 진정한 우월성을 실질적으로 입증했습니다.
재료 및 방법
재료
Standards of FWA184 (2,5-bis(5′-tert-butyl-2-benzoxazolyl) thiophene, CAS 7128-64-5, > 99% purity) and FWA367 (1,4-bis(2-benzoxazolyl) napthalene, CAS 5089-22-5, >98% 순도)는 Aladdin(중국 상하이)에서 구입했습니다. 분석 등급의 유기 용매 및 화학 물질은 Sigma Aldrich(중국 상하이)에서 구입했습니다. 실리카 겔 플레이트60 F254(분석 등급, 층 두께 0.1mm, 10 × 20cm 크기, 일련 번호 1.05729.0001)는 Merck(Darmstadt, Germany)의 제품입니다. 3개의 밀가루 샘플과 3개의 쌀가루 샘플을 포함하는 6개의 빈 시리얼 샘플을 지역 슈퍼마켓에서 구입했습니다. 그 외에도 FWA 오염이 확인된 밀과 쌀가루 샘플은 Shenzhen Customs Food Center에서 제공했습니다.
시스탄체 튜불로사 추출물
표준 솔루션
FWA 184 및 FWA 367의 원액({0}}.01 mg/mL)을 에틸 아세테이트에 별도로 또는 혼합물로 제조하여 냉장고(4도)에 보관하였다. 검량선을 확립하기 위한 작업 용액은 원액을 0.0001 mg/mL로 추가로 희석하여 준비했습니다.
샘플 준비
곡물 시료, 에틸 아세테이트, 아세톤 및 이들의 혼합물에서 분석 물질 추출용(혼합 비율, v/v, 10/0, 6/4, 4/6 및 0 /1{22}})을 추출 용매로 테스트했습니다. 간단히 말해서, 5g의 곡물 가루 샘플을 20mL의 추출 용매와 혼합했습니다. 오염. 30도 초음파 욕을 5분 동안 처리한 후, 현탁액을 4도에서 5분 동안 원심분리하여 분리하였다. 그 후, 1mL 상청액을 5mL 주사기에 조심스럽게 피펫팅하고 바늘이 막히는 것을 방지하기 위해 0.{23}}μmnylon 멤브레인을 통해 여과하여 고체 입자를 제거했습니다.
HPTLC 단계
샘플 추출물 및 참조 표준품은 6-mm 밴드로 분무되었습니다.HPTLC100-μL 주사기가 장착된 Linomat 5 반자동 샘플러(CAMAG, Switzerland)로 플레이트를 100 nL/s 및 0.2 μL의 전달 속도로 밴드 배열은 처음에 왼쪽 가장자리에서 15mm, 바닥에서 10mm였으며 서로 자동으로 계산된 간격입니다. 적용 부피는 블랭크 및 스파이크 샘플 추출물의 경우 10μL였습니다. 검량선을 설정하기 위해 1, 5, 10, 15 또는 20μL 작업 용액(0.0001mg/mL)을 적용하여 각각 100, 500, 1000, 1500 및 2000pg/band에서 농도 구배를 생성했습니다. 샘플링 시, 주사기는 교차 오염을 방지하기 위해 각 적용 사이에 순수한 에틸 아세테이트로 두 번 수동으로 헹구었습니다. 도포 후 도금을 TLC-히터 III(CAMAG, Switzerland)로 60도에서 2분 동안 가열하여 도포 밴드의 용매 잔류물을 제거했습니다. 크로마토그래피는 ADC{25}}(CAMAG, Switzerland)로 자동 수행되었습니다. 재현 가능한 분리를 실현합니다. 먼저, 현상 챔버의 두 트렌치 모두 10mL 톨루엔과 0.3mL 에틸 아세테이트로 구성된 고정상으로 채워졌습니다. 플레이트 바닥을 이동상에 담그기 전에 포화 MgCl2 수용액을 통해 33%의 최종 상대 습도, 10분 탱크 포화 및 10분 플레이트 전제 조건으로 버블링함으로써 5분 건조 제어가 있었습니다. 용매 전선의 이동 거리는 50mm로 고정하였다.
플레이트 문서화 및 농도계
현상 후 현상된 판의 디지털 사진은 366nm UV 램프로 조명된 Sony EOS7{11}D 디지털 카메라와 통합된 DD7{12}} 이미징 시스템(Biostep, Germany)으로 문서화되었습니다. 그런 다음, 분리 결과는 TLC 스캐너 3(CAMAG, Switzerland)에 의해 밀도 측정적으로 평가되었습니다. 농도계의 작동 파장을 찾기 위해 실리카 겔 플레이트에 증착된 분석물의 여기 스펙트럼을 K400 광학 필터와 함께 D2 & W 램프를 사용하여 220-400 nm에서 연속적으로 프로파일링했습니다. 정량 스캐닝은 형광 모드, 수은 램프, 여기 파장 365 nm, K400 광학 필터, 3.00 × 0.30 mm 마이크로 슬릿 치수, 스캐닝 속도 100 μm/s 및 데이터 해상도 100 μm/단계와 같은 일반 설정으로 수행되었습니다. 기기 작동 및 데이터 처리는 winCATS 소프트웨어 버전 1.4.4에 의해 제어되었습니다.
혜택시스탄체 튜불로사 추출물
HPTLC-MS
FLD 측정 후, TLC-MS 인터페이스(CAMAG)에 의해 매개되는 MS 지문에 의해 양성 밴드가 추가로 확인되었습니다. 4차 펌프로 구동하여 366nm 조명 아래에서 시각화된 표적 밴드를 60초 동안 0.2mL/분의 속도로 0.1% 포름산을 함유하는 아세토니트릴의 흐름으로 용리했습니다. 용리액을 전기분무 소스에 직접 주입하고 동시에 삼중 사중극자 질량분석기(Quattro Premier XE, Waters)로 분석했습니다. 전체 스캔 MS 데이터 수집은 모세관 전압 3.5kV, 콘 전압 50V, 이온 소스 온도 100도, 탈용매 온도 400도, 탈용매 가스 유량 700L/h 및 콘 가스 유량 50L/h. 스펙트럼은 50-1000m/z 범위에서 기록되었습니다.
결과 및 논의
크로마토그래피 최적화
표적 화합물의 낮은 극성과 관련하여 이동상의 최적화는 다양한 소수성 용매(아세톤, 톨루엔, 헥산 및 석유 에테르 포함) 및 이들의 혼합물을 사용한 시험 테스트로 시작되었습니다. 초기 스크리닝에서 톨루엔만으로도 대부분 트랙 하단에 남아 있는 간섭 샘플 매트릭스로부터 표적 화합물의 충분한 분해능을 제공하는 것으로 밝혀졌습니다. 분석물의 분해능을 더욱 높이기 위해 다른 양(1-10%)의 에틸 아세테이트를 첨가했습니다. 비교에서 이동상(액체), 챔버 분위기(기체) 및 고정상(고체) 사이의 깨지기 쉬운 평형에 기인합니다. 즉, 판을 수동으로 움직일 때 위상 평형이 즉시 깨집니다. 이것은 반복성을 위한 계측의 중요성을 강력하게 입증했습니다.HPTLC분석. 또한 인공적으로 오염된 곡물 샘플을 분석하여 최적화된 분리 조건의 적용 가능성을 추가로 평가했습니다. 그림 1a에서 샘플 매트릭스의 존재가 크로마토그래피 결과의 유의미한 변화로 이어지지 않았다는 결론을 내릴 수 있습니다. 따라서 톨루엔/에틸 아세테이트(1{2}}/0.3, v/v)는 이 작업 내내 이동상으로 고정되었습니다.
시각적 스크리닝 및 FLD 정량화
전체 플레이트의 이미지 획득은 특징 중 하나였습니다.장점HPTLC, 반정량적 분리 프로파일은 육안 검사로 쉽게 얻을 수 있습니다. 여기에서 분석 물질의 강력한 고유 형광으로 인해 366nm 조사에서 크로마토그래피 결과를 직접 판독할 수 있었고 감도는 100pg/band까지 낮아졌습니다. 그 후, 트랙 간의 수평 비교만이 샘플 오염 정도의 직접적인 추정으로 이어질 수 있으며, 이는 스크리닝 작업에서 매우 선호되었습니다. 또한, 형광 모드의 농도 측정법을 사용하여 트랙 스캐닝을 수행했습니다. 이 단계도 매우 효율적이어서 2-3분 안에 완료할 수 있습니다. 밀도 측정을 위한 최적의 여기 파장을 식별하기 위해 실리카겔 층에 증착된 분석물의 여기 스펙트럼(220–400 nm)을 조사했습니다. 그림에 제시된 바와 같이. 도 1b에 도시된 바와 같이, 상이한 조건에서 분석물의 스펙트럼 프로파일은 365 nm 여기에서 가장 집중적인 방출을 나타내는 높은 유사성을 보였다. 따라서 400-nmedge 필터(K400)와 함께 365nm에서 수은 램프의 빛을 사용했습니다. 그림 1d에서 볼 수 있듯이, 이러한 광학 매개변수의 적용 가능성은 공동 추출된 샘플 매트릭스가 있는 경우에도 분석물 밴드의 명확한 신호 피크에 의해 입증됩니다.
정량 최적화 및 검증
선형성과 감도
확립된 농도 측정 검출의 정량적 능력은 선형성과 감도 측면에서 먼저 검증되었습니다. 이를 위해 100 ~ 2000pg/band 농도 내 5가지 레벨에 따른 보정 그래프를 구축하였습니다. 표 1에 요약된 결과HPTLC-FLD는 만족스러운 상관계수(R2=0.9999)로 좋은 선형성을 나타냈습니다. 검량선을 기반으로 하여 검출한계(LOD) 및 정량화(LOQ)를 포함한 방법 감도는 95%의 통계적 신뢰도로 DIN 32645 방법에 따라 계산되었습니다(Deutsches Institut für Normung 2013). 계산에서 LOD 표현 aspg/band는 FWA 184 및 FWA 367에 대해 각각 45 및 52였습니다. 살포량을 10μL로 고정하면 이러한 검출 가능성은 각각 18 및 21ug/kg으로, 이는 EU에서 규정한 법적 허용 한도(600ug/kg)보다 약 30-배 낮습니다(European Union 2002).
회복과 정확성
개발된 데이터의 정확도를 평가하기 전에HPTLC-FLD는 곡물 시료에 첨가된 분석물의 회수율을 결정하여 적절한 추출 방법을 최적화해야 합니다. 시리얼 가루의 ForFWA 추출, Wu et al. 디클로로메탄과 아세톤의 혼합물(3/2, v/v) 사용을 제안합니다(Wu et al. 2018). 디클로로메탄의 환경 및 발암성 독성과 관련하여 여기에서 추출 용매로 에틸 아세테이트와 아세톤의 혼합물을 대안적으로 테스트했습니다. 도 2에 예시적으로 제시된 바와 같이, 순수한 에틸 아세테이트가 Wu et al.(2018)의 방법에 의한 것과 비교하여 양곡물 샘플에서 표적 화합물을 추출하기 위한 최선의 선택임이 분명했습니다. 적용 가능성을 보장하기 위해 최적화된 추출 방법을 밀가루 3개를 포함한 곡물 샘플 6개로 확장하고 쌀가루 3개를 추가로 스파이크 회복 실험을 테스트했습니다. 표 2에 요약된 바와 같이 계산된 회수율은 88.7-108.4% 범위 내에 있었습니다. 한편, 삼중의 상대표준편차(% RSD) 측면에서 정량의 재현성은 10.5% 미만인 것으로 밝혀졌습니다. 또한 얻은 데이터가 사용된 샘플 및 스파이크 수준에 유의하게 의존하지 않는 것으로 나타났습니다. 정량적 분석은 다음을 위한 효율적인 선별 도구가 될 수 있습니다.FWA허용 가능한 정확도와 정밀도로 시리얼 샘플에서.
포장된 곡물 샘플의 FWA 측정
최적화된 추출 조건의 적합성을 추가로 평가하고HPTLC-FLD 검출, 이 방법은 패키지에 FWA가 포함된 2개의 곡물 샘플을 정량화하기 위해 예시적으로 적용되었습니다. 그림 3a에 표시된 접시 이미지의 육안 검사만으로 두 곡류 샘플이 FWA 잔류물로 오염되었다는 결론에 쉽게 도달할 수 있었습니다. 그 다음, FLDscanning에 의해 정량화를 수행하였다. 도 3b에 도시된 바와 같이, 얻어진 덴드로그램에서 검출의 양호한 선택성을 관찰할 수 있다. 표 3에 요약된 바와 같이, 두 곡물 제품의 분석물의 잔류물은 ug/kg 수준(최대 262.8ug/kg) 이내였으며, 이는 특정 이동 한계(600ug/kg)보다 훨씬 낮습니다. 그럼에도 불구하고 만성 노출로 인한 부작용이 아직 충분하지 않았기 때문에 그러한 오염의 잠재적인 부정적인 영향은 여전히 경고적이었습니다.
혜택시스탄체 튜불로사 추출물
MS 지문으로 분자 식별
밴드의 화학적 식별을 달성하기 위해HPTLC개발, 현장 MS 검출은 용출 헤드 기반 TLC-MS 인터페이스에 의해 촉진되는 확인 도구로 스크리닝 접근 방식에 통합되었습니다. 관심 밴드 내의 화합물을 실리카 겔 층에서 씻어내고 전자분무 MS로 직접 측정하였다. 표 4는 실리카겔층에서 기록된 분석물질의 진단 신호를 요약한 것이다. FWA 184의 경우 363.1m/z가 가장 풍부한 이온 신호인 반면 FWA 367의 경우 431.2m/z임이 분명했습니다. 양성자화된 형태의 이론적인 분자 이온과 잘 일치하는 이러한 특정 신호는 직접적으로 자명하므로 다음으로 사용할 수 있습니다. 확인을 위한 지문 증거. 또한, 이 방법의 적용 가능성은 실제 샘플에서 긍정적인 발견으로 예시적으로 검증되었습니다. 도 4에 도시된 바와 같이, 얻어진 신호는 분석물의 지문과 양호한 유사성을 나타내어 의심되는 밴드가 표적 화합물에 명확하게 할당될 수 있음을 입증한다.
혜택시스탄체 튜불로사 추출물
결론
이 작품에서는HPTLC시리얼 샘플에서 FWA 오염의 손쉬운 정량화 및 확인을 위해 분리 및 분광 분석을 효율적으로 조립하는 유연한 플랫폼으로 성공적으로 사용되었습니다. 최적화된 추출 방법을 사용하여 HPTLC-FLD에 의해 밀 및 쌀가루 샘플의 분석 물질을 선택적이고 정확하게 정량화했으며, 선형성 및 LOD가 허용 한계보다 훨씬 낮습니다. 또한 도금층에 머무는 분리된 결과는 in situ MS 분석과 더 연결되어 분리된 트랙에서 양성 밴드의 빠른 분자 식별이 가능하므로 스크리닝 결과의 신뢰성을 명확하게 보장합니다. 식품 스크리닝 분석의 현실로 인해 제기된 과제에 직면하여, HPTLC는 점점 더 인정을 받았습니다. 이 작업은 HPTLC가 매우 비용 효율적인 방식으로 정량 및 정성 검출을 통합하는 다목적 플랫폼으로서 식품 분석 화학에서 강력한 도구가 될 수 있음을 보여주었습니다.
혜택cistanche tubulosa 추출물 보충제