멜라닌-탈색작용 항산화 효소, 글루타티온 퍼옥시다제, 티올 퍼옥시다제, 카탈라아제

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경찬 전¹· 김진한²· 조욱민²· 황이택³· 황형서⁴· 민지호¹

추상적인

멜라닌은 피부색을 결정하는 가장 중요한 요소입니다. 아름다움을 위해 피부에서 이미 생성 된 멜라닌 화합물을 분해하기위한 많은 연구 노력이 수행되고 있습니다. 이 연구는 리소좀 분획에서 세 가지 항산화 효소인 글루타티온 퍼옥시다제(GPX), 티올 퍼옥시다제(TPX) 및 카탈라아제의 멜라닌 색소 감소에 미치는 영향을 조사했습니다. 멜라닌 용액은 효소와 과산화수소로 처리한 다음, 48시간 동안 반응시키고.GPX TPX는 멜라닌을 탈색시키고, 이들 사이에서는 GPX가 더 효율적이었지만 카탈라아제는 효과적이지 않았다. GPX는 또한 B16F10 흑색종 세포에서 멜라닌의 생성을 억제하였다. 거의 모든 미생물에 존재하는 GPX는 반응성 산소 종에 의한 세포 방어 메커니즘에 중요한 역할을합니다. 또한, 세포독성은 없었지만 멜라닌 색소를 탈색하는데 유의하게 효과적이었다. 따라서, 생물학적 및 미생물학적 분야에서는 피부 미백 화장품에 활용 가능성이 높다.

키워드 멜라닌 · 글루타티온 퍼옥시다제 (GPX) · 티올 퍼옥시다제 (TPX) · 카탈라아제 · B16F10 · 리소좀

Cistanche는 피부 미백 성분입니다.

소개

깨끗한 얼굴은 현대인들에게 아름다움의 필수 요소 중 하나이며, 특히 아시아인들은 하얀 피부에 열광합니다. 멜라닌 화합물은 피부색을 결정하는 가장 중요한 요소입니다. 그것은 검은 색 또는 갈색을 가진 유멜라닌과 페오멜라닌과 구별되며, 이는 분홍색에서 붉은 색조를 띠게됩니다 [1]. 멜라닌 화합물은 표피의 기저층에서 발견되는 멜라노사이트 세포에서 티로신 산화에 의해 syn-크기이고; 피부에서이 색소의 주요 역할은 유해한 자외선을 차단하여 진피를 보호하는 것입니다 [2, 3]. 그러나 피부에 너무 많은 멜라닌 화합물이 존재하면 피부가 어둡고 부정하게 만들고 기미와 같은 과다 색소 침착을 일으킬 수 있습니다 [4].

이러한 문제점을 해결하기 위한 스킨케어 코스메틱스와 관련된 많은 연구가 있어왔지만, 현재 개발된 피부 미백 화장품의 대부분은 멜라닌 합성을 촉진시킬 수 있는 티로신의 산화를 차단하거나 자외선과 같은 여러 기전을 통해 멜라닌 합성을 억제하는 기능을 가지고 있다[5]. 이러한 제품은 효과적이되기까지 오랜 시간이 걸리며 과다 색소 침착과 같은 특정 증상에는 효과적이지 않습니다 [6]. 현재, 이미 만들어진 멜라닌을 제거하는 전형적인 방법은 레이저 치료이다[7]. 해결할 수 있는 재료라면 이러한 절차없이 이러한 문제가 개발되고, 그들은 생물학과 화장품에 큰 유용성을 가질 것입니다. 밭.

이전 연구에서, 우리는 탈색하는 방법을 찾으려고 노력했습니다. 이미 생성 된 멜라닌 화합물을 화하십시오. 있다 리소좀과 멜라닌 상관 관계에 관한 연구 보고서였습니다. 분화된 각질세포가 분화될 가능성이 매우 높다. 특히 외인성 멜라노솜 협정을 저하시킨다- 통제하는 기본적인 autophagy 함수의 종류에 의하여 세포 소기관의 양, 또는 결함 제거 소기관, 예를 들어 퍼옥시솜[8]. 자가포식 경로- 세포질에서 리소좀에 이르기까지 상당한 역할을하는 방법 인간 표피에서 멜라노솜의 분해에서 각질세포 [9]. 이들 데이터는 리소좀 특이적 효소가 멜라닌 분해에 기여한다는 증거를 제공한다. 이전에 우리는 멜라닌 색 감소 활성을 발견했습니다. 리소좀 분획에 효소의, 복합체를 포함하는 복합체 폐물질과 세포를 분해하는 가수분해물 퍼옥시솜과 리소좀의 파편 [10, 11]. 이 논문 멜라닌 색소를 감소시키기 위해 리소좀 분획에서 세 가지 선택된 효소인 글루타티온 퍼옥시다제, 티올 퍼옥시다제, 카탈라아제의 효과를 연구하였다. 이 과산화증 반응성 산소 종(ROS)에 의한 세포 손상으로부터 방어하는 작용을 하며, 모든 진핵생물에 존재한다[12].

반응성 산소 종 (ROS)은 천연으로 형성됩니다. 세포에서 산소의 정상적인 신진 대사의 부산물, 환경 스트레스에 의해 증가 될 수 있습니다. 고도로 생성된 ROS는 세포를 손상시킬 수 있다. ROS의 유해한 영향 세포 상에는 다음과 같다 [12, 13]: DNA의 손상 또는 RNA, 지질에서 고도 불포화 지방산의 산화, 단백질에서 아미노산의 산화, 및 보조인자의 산화에 의한 특정 효소의 산화적 불활성화. 상기 세포는 항산화 시스템에 의해 ROS를 중화시켜 이러한 조직 손상을 방지하십시오. 이 시스템에서, 수퍼옥사이드 신진 대사에 의해 생성 된 음이온은 매우 파괴적입니다. Superoxide dismutase (SOD)에 의해 과산화수소로 전환되지만 과산화수소는 여전히 남아 있습니다. 반응. 과산화수소는 H2O에 의해 H2O로 변환된다. 카탈라아제, 글루타티온의 생산에 소비 의 촉매작용에 의해 글루타티온으로부터의 디설파이드(GSSG) GPX. TPX는 GPX와 유사하게 작동합니다 [13].

이 연구는 멜라닌 탈색 효과를 연구했습니다. 세 가지 항산화 효소, GPX, TPX 및 카탈라아제. 만큼 그 결과, GPX 및 TPX는 멜라닌 색을 감소시키는데 효과적이었다. 그 중에서도, GPX는 세포독성이 없었다. 멜라닌 탈색 활성의 최적 농도, 멜라닌 합성을 효과적으로 억제하였다. 따라서, 그것은 GPX가 리소좀 분획의 멜라닌 탈색의 기전은 항산화 활성뿐만 아니라, 잠재력을 제공합니다. 단일 효소로서 새로운 미백 화장품의.

재료 및 방법

Peroxidases 및 Peroxidase Activity Assay

세퍼옥시다제(글루타티온 퍼옥시다제, 티올 퍼옥시다제, 및 카탈라아제)의 농도는 분석 키트 (퍼옥시다제 분석 키트, D2PD-100, QuantiChromTM) Bioassay Systems에서 구입했습니다. 글루타티온 퍼옥시다제 2 (GPX2, NBP1-78,824, 노부스) 및 티올 퍼옥시다제 (TPX, NBP1-78,805, Novus)를 Novus로부터 구입하였고, 카탈라아제(9001-05-2, 시그마-알드리치)로부터 구입하였다. 시그마-알드리치.

이 분석 키트는 H2O2 및 전자 공여체 염료를 사용합니다. 과산화효소 동안 레소루핀을 형성한다. 상기 분석은 실온(RT)에서 수행하였고, 상기 강도는 색은 570 nm에서 측정되었다. 퍼옥시다아제를 반응시켰다. 0.6 % 과산화수소를 가진 전자 공여체 염료로 RT에서 10 분 동안. 반응 후, 정지 시약을 첨가하였고, 샘플의 흡광도를 마이크로플레이트 분광광도법으로 측정하였다. 활동은 다음과 같이 계산되었다.

퍼옥시다제 활성 = RSAMPLE −RBLANK × [레소루핀](μM) × 반응 Vol(μL)RRESORUFIN −RH2O t(분) 샘플 Vol(μL)

(U/L). 효소의 한 단위 (U)는 형성을 촉매 할 것이다. 분석 조건 하에서 분당 1 μmole의 레소루핀. 여기서 RSAMPLE, RBLANK, RRESORUFIN 및 RH2O는 각각 샘플, 샘플 블랭크, 레소루핀 및 물의 흡광도; n은 샘플 희석 계수이다. 이 이 검정에 대한 [레소루핀]은 50 μM이다. 반응 Vol는 100입니다. μL이고, 본 연구에서 샘플 Vol는 10 μL이다.

글루타티온 퍼옥시다제에 의한 멜라닌 탈색 (GPX), 티올 퍼옥시다제(TPX) 및 카탈라아제

상기 멜라닌 용액은 0.1 mM PBS(인산완충식염수, pH: 7.0)와 멜라닌분말(합성, Sigma)로 티로신을 산화시켜 제조하였다. 과산화수소. 멜라닌 함량을 측정하였다. 450 nm에서의 흡광도에 의해. 멜라닌 농도를 결정하기 위해, 표준 곡선을 본격적인 것으로부터 제조하였다. 합성 멜라닌의 표준 (R2 = 0.999, 데이터는 나타내지 않음).

멜라닌 탈색을 확인하기 위해, 멜라닌 100 ppm (50 ~ 1000) μU/L 퍼옥시다제(GPX, TPX, 카탈라아제)를 1 mM 과산화수소와 반응시켰다. RT에서, 매일 측정. 멜라닌 탈색 값 멜라닌 농도를 뺀 값으로 측정하였다. 반응 후, 초기값부터.

Cistanche는 멜라닌 합성을 억제합니다.

세포 배양

B16F10 마우스의 흑색종 세포(KCLB 80008)를 한국세포주은행(KCLB, 서울, 한국). 세포를 4500 mg/L 글루코스를 함유하는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 배양하였고, 4 mM l-글루타민, 1 mM 피루베이트 나트륨, 10% 소 태아 혈청(FBS), 20mM HEPES, 1% 첨가 페니실린, 및 세포를 가습된 상태에서 인큐베이션하였다. 37°C에서 5% CO2를 함유하는 조건. 배지는 2일마다 교환하고(d), 세포를 수확하여 트립신 / EDTA 솔루션을 사용합니다.

세포 생존율 분석 (MTT 분석)

B16F10 멜라에 대한 글루타티온 퍼옥시다제의 독성 효과 - 노마 세포는 MTT 분석법, 일반적인 방법으로 확인하였다. 샘플이 생존력에 미치는 영향을 결정하는 데 사용됩니다. 부착 세포의. 이 분석은 3-(4,5-디메틸티아졸-)를 사용한다. 2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT)일 수 있음 실행 가능한 미토콘드리아 효소에 의해 포르마잔으로 환원 세포. 3개의 × 103개의 세포를 96-웰에서 웰당 시딩하였다. 플레이트를 24 h 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 샘플을 각 웰을 72 h 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 매체 0.5 mg/mL의 MTT를 함유하는 것으로 교환하였고, 2시간 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, MTT 염료 시약을 제거하고, 생성된 포르마잔을 DMSO에 의해 용해시키고, 30분 마지막으로, 포르마잔의 농도는 마이크로플레이트 분광광도계를 사용하여 570nm에서 측정하였다. 세포 생존율은 다음과 같이 계산되었다: 세포 생존율(%) = (Asample - Ablank)/(Acontrol - Ablank)*100.

힌디어의 시스탄체

멜라닌 함량 분석

3× 105개의 B16F10 세포를 6-웰 플레이트에서 웰당 시딩하고, 부착시키기 위해 24시간 동안 인큐베이션하였다. 각 웰의 배지를 다양한 농도의 효소 및 10 nM α-MSH를 포함하는 배지로 교환한 다음, 72시간 동안 배양하였다. 그 후, 웰을 모두 DPBS 버퍼로 세척하고, 0.5% 트립신/EDTA 용액을 사용하여 수확하였다. 원심분리를 통해 수득된 세포의 펠렛을 80°C에서 1시간 동안 10% DMSO를 함유하는 200 μL의 1 N NaOH로 용해시켰다. 마지막으로, 용해된 멜라닌 함량을 450 nm에서의 흡광도로 측정하였다. 효소의 멜라닌 생성 억제 효율은 알부틴 100mg/mL를 사용하는 양성 대조군과 비교하여 결정되었다.

결과

글루타티온 퍼옥시다제(GPX), 티올 퍼옥시다제(TPX) 및 카탈라아제의 퍼옥시다제 활성

본 연구는 시험관내 및 생체내에서 com-파운드의 멜라닌을 탈색시키기 위한 lys-오솜 분획 치료의 적용에 대한 확장 연구이다. 이전 연구에서, 우리는 Hela 세포, S. cerevisiae, 암탉의 알에서 분리 된 리소좀 분획이 멜라닌 색을 감소시키는 효과가 있음을 발견했습니다.멜라닌 탈색의 효율은 리소좀 및 퍼-옥시좀을 포함하는 비막 결합된 마이크로솜 분획의 리소좀 분획의 퍼옥시다제 활성과 관련되었다. 퍼옥시다제의 멜라닌 색 감소 효과를 확인하기 위해, 글루타티온 퍼옥시다제(GPX), 티올 퍼옥시다제(TPX) 및 카탈라아제의 세 가지 퍼옥시다제를 선택하였다. 이 효소는 세포의 반응성 산소 종으로 인한 산화 스트레스를 줄이는 데 중요한 역할을합니다 [14].

이들 효소의 활성은 분석 키트(Peroxidase assay kit, D2PD-100, QuantiChrom™)에 의해 결정되었다. 이 방법은 퍼옥시다제 반응 동안 분홍색을 형성하는 전자 공여체 염료의 산화에 기초하였다[15]. 퍼옥시다제 활성은 하기 단위를 사용하여 발현되었다: 1 Unit = 1 U = 분석 조건 하에서 분당 1 μmole 레소루핀의 형성. 표 1은 세 가지 퍼옥시다제, GPX, TPX 및 카탈라아제의 활성 및 농도를 요약한 것이다.

글루타티온 퍼옥시다제(GPX), 티올 퍼옥시다제(TPX) 및 카탈라아제의 멜라닌 탈색 활성

퍼옥시다제의 멜라닌 탈색 효과를 확인하기 위해, 100ppm 멜라닌 용액을 1mM 과산화수소와 (50 내지 1000) μU/L 농도의 각 퍼옥시다제로 처리하였다. 샘플을 RT에서 2일 동안 반응시킨 다음, 초기 농도와 비교하였다. 도 1은 48시간 후의 멜라닌 감소를 보여준다. 도 1은 TPX 및 GPX가 멜라닌 탈색 활성을 갖는다는 증거를 보여준다. 카탈라아제는 멜라닌 색을 감소시키는데 아무런 효과가 없었다(도 1a). TPX는 멜라닌 화합물을 탈색시키는 데 효과적이었으며 효율은 1 μU / mL의 농도로 처리 할 때 가장 우수했습니다 (그림 1b). GPX는 또한 멜라닌 색 감소 활성을 가졌으며, 이는 0.2 μU / mL의 농도에서 가장 좋았으며 더 높은 농도에서 점차 감소했습니다 (그림 1c). 이 값은 과산화수소만을 처리한 대조군에 비해 175% 개선된 멜라닌 색 감소를 나타낸다. GPX는 TPX에 비해 농도 및 퍼옥시다제 활성의 측면에서 더 효율적이었다. 0.2 μU/mL GPX 및 1 mM 과산화수소의 처리-멘트멜라닌 용액은 100ppm의 멜라닌 중 13%를 탈색시켰다. 4 d (도 4 d)2). 그러나 GPX와 TPX는 아무 것도 보여주지 않았습니다. 수소 퍼록스의 부재 하에서의 색 감소 효과 - ide (데이터는 표시되지 않음).

표 1 효소, 글루타티온 퍼옥시다제 2, 티올 퍼옥시다제 및 카탈라아제의 구체적인 데이터

글루타티온 퍼옥시다제 (GPX) 및 H2O2on B16F10 세포 생존력의 효과

GPX가 B16F10 흑색종의 생존력에 미치는 영향 세포는 MTT 분석법에 의해 확인되었고, 멜라닌 syn-전에 논문 억제 시험. 적절한 농도를 찾으려면 과산화수소를 처리하여, 세포독성을 평가하였다. 다른 농도에서 72 시간 동안 과산화수소로 처리하십시오. 0.1 mM의 농도 하에서, H2O2는 농도에서 72 시간 동안 세포에 대한 세포 독성이 없습니다. 1 mM 이상에서는 큰 독성이 관찰되었다. (도 3a). 이 이어서, 세포 생존에 대한 GPX의 효과는 0.1 mM 과산화수소의 존재 하에 평가되었고, 이는 세포독성이 아니었다. GPX는 아래의 B16F10 세포에 대한 세포독성이 없었다. 멜라닌에 효과적이었던 0.5 μU/mL의 농도 탈색 연구 (도 3b).

그림 1과산화수소만을 처리하는 것에 비해 상대적으로 멜라닌 색이 감소하였다.

B16F10 흑색종 세포에서 글루타티온 퍼옥시다제(GPX)와 H2O2on 멜라닌 합성의 효과

우리는 가장 효과적인 GPX의 효과를 연구했습니다. 멜라닌 탈색, 멜린 합성에 - 아뇨세포. 도 4는 B16F10의 멜라닌 함량을 나타낸 것이다. 흑색종 세포를 72시간 동안 각 샘플로 처리하였다. 치료- 0.05 μU/mL의 GPX 및 0.1 mM H2O2 유도 멜라닌 생성의 가장 많은 억제율 대비 43 % 제어 (α-MSH로 만 치료). 이것은 153 %였습니다. 양성 대조군보다 높음 (알부틴을 사용한 치료 및 α-MSH), 과산화수소보다 22% 더 높음 효소없이, GPX의 처리는 dra- 보여주지 않은 반면 과산화수소가없는 경우 matic 멜라닌 감소 또한이 뷰 (데이터가 표시되지 않음)를 지원합니다. 그 결과, GPX 멜라닌 화합물의 생성을 억제했지만 멜라닌 세포에서의 합성은 과산화수소에 의해 더 많은 영향을 받았다. GPX에 의해보다.

토론

이 연구에서 우리 연구자들은 GPX, TPX 및 카탈라아제, 항산화 물질의 최적 농도와 효과를 발견했습니다. 멜라닌 화합물의 탈색에 대한 세포의 산화 스트레스를 감소시키는 효소. 합성된 멜라닌 화합물을 이용한 세포외 실험의 결과로서, GPX TPX는 멜라닌 탈색 효과가 있지만 카탈라아제 하지 않습니다. 리그닌 분해 효소가 있다는 보고가 있습니다. laccase, lignin peroxidase와 같은 일부 곰팡이에서는 깨질 수 있습니다. 과산화수소가있는 멜라닌을 떨어 뜨립니다 [16-18]. 본 연구를 통해, 항산화 효과가 있음을 확인하였다. 리그닌 분해 효소가 아닌 모든 진핵생물에 들어있는 효소는 멜라닌 탈색 활성을 갖는다. 있지만 GPX 및 TPX는 또한 과산화수소의 존재하에서 멜라닌 색을 감소시킬 수 있었고, 이들 효소는 리소좀 분획의 멜라닌 탈색 메카니즘의 주요 성분으로서 작용할 가능성이 있다.

GPX, 멜라닌 색을 감소시키는 데 가장 효과적이었습니다. 시험관 내에서, 멜라닌 합성에 대한 그의 효과를 결정하기 위해 B16F10 흑색종 세포로 처리하였다. B16F10 흑색종에서 세포는, GPX가 세포독성이 없었으며 그 농도에서 멜라닌 화합물의 탈색에 효과적이며, 함께 처리된 과산화수소의 농도는 0.1 mM, 독성이 없음. 과산화수소의 치료 멜라닌 합성을 크게 억제하고, 일할 때 GPX를 사용하면 효율성이 더 좋았지 만 약물의 농도 의존성은 없었습니다. 과산화수소는 효소에 의해 빠르게 소비되기 때문에, 해석될 수 있다. 처리되는 효소의 농도가 높을수록, 수소에 의한 멜라닌 합성 억제를 낮춘다 과산화물. GPX의 치료가 과산화수소가없는 상태에서 극적인 멜라닌 감소를 나타내지 않았다는 사실 또한이 뷰 (데이터가 표시되지 않음)를 지원합니다. 그 결과, GPX 멜라닌 화합물의 생성을 억제했지만 멜라닌 세포에서의 합성은 과산화수소에 의해 더 많은 영향을 받았다. GPX에 의해보다. 이러한 결과는 항산화 효소가 유도한다는 것을 시사한다. 소화하는 자가포식 메커니즘의 멜라닌 분해 멜라노솜.

시스탄체 정제

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결론

우리의 연구는 글루타티온 퍼옥시다제 (GPX)와 티올 퍼옥시다제 (TPX)는 멜라닌 탈색에 기여하고, GPX는 멜라닌 합성을 효과적으로 억제하였다. 결과 항산화 효소가 유도한다는 가설을 뒷받침한다. 소화하는 자가포식 메커니즘의 멜라닌 분해 멜라노솜. 명확한 결론에 도달하기 위해, 에 대한 연구 피부 세포, 각질세포 및 멜라노사이트에서의 멜라노좀 소화 기전이 요구될 수 있다.