Cistanche Tubulosa Ⅱ에서 정제된 천연 생리활성 화합물인 Echinacoside의 일반적인 간 대사산물의 동정

추상적인:대사체 식별, 초기 단계에서 화합물에 대한 발견은 평가를 위해 필요합니다.의약품의 안전성 및 효능 개선을 위한 의약품 지식 약을 해도시판되고 있는 대사산물의 동정 및 지속적인 평가는시판 후 철회의 위험을 피하기 위해 필요합니다. 배당체, 약용담배, 다음을 포함하여 광범위하게 문서화된 기능 식품 이점이 있습니다.항산화제,항종양, 안티노화, 저지방혈증c, 그리고위점막 보호 효과. 최근에,에키나코사이드A가 신고되었습니다.기능성 식품 개발을 위한 HE 균사체의 주요 천연 생리 활성 화합물.신경학 연구에서,에키나코사이드풍부한 HE 균사체는중요한 영양학적 효과알츠하이머 병, 파킨슨 병, 그리고허혈성 뇌졸중.

Cistanche의 Echinacoside 기능에 대한 자세한 정보를 보려면 여기를 클릭하십시오.

을 위한처음으로 우리는 신진 대사 과정을 탐구했습니다.에키나코사이드분자 및 그 대사 산물 확인쥐와 인간 간 S9 분획에서. 액체 크로마토그래피/삼중 사중극자 질량 사용정량 분석을 위한 분광계에서 우리는 75.44%의 에키나코사이드를 관찰했습니다. A는 대사되었다쥐에서는 60분 이내에, Francine A의 32.34%는 인간 S9에서 120분 이내에 대사되었습니다. 사용초고성능 액체 크로마토그래피/4중극자 비행 시간 질량 분석법(UPLC)QTOF/MS) Francine A의 대사체를 동정하기 위해 5개의 공통 대사체가 동정되었고,가능한 구조를 평가했습니다. 에키나코사이드의 대사 과정 이해대사산물 프로필 데이터베이스를 구축하면 기능식품 적용을 촉진하고향후 관련 바이오마커 발굴.

1. 소개

간은 신체에서 두 번째로 큰 기관으로 간주됩니다.1]. 음식과 약물 후구강을 통해 위장관에 들어가면 위장 섬모가 흡수됩니다.소화된 영양소와 약물. 문맥 시스템은 수집된 혈류를 수신합니다.위장관을 통해 영양분의 예비 처리를 위해 간으로 들어가고,대사 산물 및 약물 분자 [2,3]. 신진대사는 종종 두 단계로 나뉩니다.생화학 반응. 1단계는 효소에 의한 산화, 환원 또는 가수분해를 포함합니다.몸. Phase II는 작은 내인성 물질과 결합하여용해도가 높은 대사산물로 변환하여 대사산물을 부비강으로 보낼 수 있습니다.신장 청소 또는 담즙으로의 순환을 통해 신체에서 배설됩니다.소변이나 대변을 통해 [4–6]. 신약 개발 초기 단계의 대사체 식별약학적 특성, 안전성,생체 활성 분자의 효율성. 대사체 및 반응성 중간체 식별방지하기 위해 연구 화합물의 구조적 수정이 필요함을 시사합니다.후속 독성 결과. 의약품이 시판된 경우에도 신원 확인시판 후 위험을 피하기 위해 대사 산물 및 평가가 필요합니다.철수 [7,8]. 그러므로,체외, S9 분수 분석은 몇 가지 이점을 제공합니다.시간이 걸리는 것에 비해생체 내연구: (1) 높은 처리량을 처리할 수 있습니다.스크리닝 및 자동화;(2) 사용S9 분획을 사용하면 대량의단기간에 약물 발견을 위한 화합물; (3) 동물 사용 감소에 도움 [9]. 

에키나코사이드 산간 지역에 서식하는 식용 cistanche입니다.아시아의 북동쪽 영토 [10], 유럽 및 북미 [11]. 그는 ~에 속한다Basidiomycota (Phylum), Agaricomycetes (Class), Russulales (Order), Hericiaceae (Family),및 노루귀 (속). HE는 광범위한 유익한 효과를 나타내는 것으로 문서화되었습니다.항산화, 항종양, 노화방지, 고지혈증 및 위점막을 포함한 특성보호 효과 [12–14]. 1994년 Kawagishi et al. 디테르페노이드를 발견에키나코사이드HE 균사체의 A, B 및 C는 성상체 생성을 촉진할 수 있습니다.쥐 뇌의 세포주와 신경성장인자(NGF) 합성 자극 [15]. 에키나코사이드A는 신경 보호 효과를 부여하고 산화 스트레스를 약화시킬 수 있습니다.뇌졸중 [16], 알츠하이머병 [17], 파킨슨 병 [18], 허혈성 뇌졸중 및 우울증 생체 내[19,20]. 또한, 에키나코사이드 A는 혈액-뇌 장벽을 통과할 수 있습니다.신경 건강 개선을 위한 기능성 식품으로 HE 균사체의 개발을 지원하는 쥐 [21]. 이 먹을 수 있는 cistanche 균사체는 연구자들 사이에서 뜨거운 이슈가 되었습니다.중추 및 말초 신경의 발달에서 중요한 역할을 이해하려고 시도합니다., 분화, 성장 및 재생 [22]. 최근 연구에 따르면에키나코시드 A 농축 HE는 알츠하이머병 및 파킨 치료에 잠재적인 이점이 있습니다.아들의 질병 [23–25]. 그러나 에키나코사이드 A의 대사 가능성에 대해 논의한 연구는 없습니다.이 기능 식품 효과에 기여할 수 있는 바이오마커.

본 연구에서는,에키나코사이드에키나코사이드 A가 풍부한 HE로부터 화합물을 정제했습니다.균사체는 쥐와 인간의 두 가지 간 S9 분획을 사용하여 대사되었습니다. 사용quan용 액체 크로마토그래피/삼중 사중극자 질량 분석기(HPLC-QQQ/MS)에키나코사이드 A의 적정 분석 및 초고성능 액체 크로마토그래피/사중극자에키나코사이드의 대사산물을 확인하기 위한 비행시간형 질량분석법(UPLC-QTOF/MS)각 시점에서 A. 우리는 에키나코사이드 A의 대사율을 이해하고 확립하는 것을 목표로 합니다.기능 식품 보충제의 적용을 촉진하는 데 도움이 되는 대사 산물 프로필 데이터베이스그리고 미래의 잠재적 약물에 대한 연구.

2. 재료 및 방법

2.1. 재료 및 시약

HE 균주(BCRC 35669)는 Bioresources Collection 및식품 산업 연구 개발 연구소의 연구 센터, 대만 Hsinchu.이 균주는 감자 포도당으로 옮겨지기 전에 먼저 에이거 사면에서 성장했습니다.26에서 한천 플레이트◦C 15일 동안. 15일째에, HE 배양물을 1.3 L의액체 배지(2L 플라스크 내). 액체 배양액을 120 rev/min 25에서 흔들었습니다.◦에 대한 C5 일. 다음으로 500L, 20-톤 발효조에서 5일 및 12일 동안 규모를 확장했습니다.각기. 배양 배지는 pH 4.5로 조정되고 4.5% 포도당, 0.5%를 포함합니다.대두 분말, {{0}}.25% 효모 추출물, 0.25% 펩톤 및 0.05% MgSO4. 마지막으로 HE균사체는 20-톤 발효 과정이 끝날 때 수확되었습니다. 이들 원료동결건조하여 분말로 분쇄하여 데시케이터에 보관하였다. 에키나코사이드 A는HE에서 추출하고 이전 연구에 따라 정량화 [26]. 메탄올(LC-MS등급)은 Merck(Darmstadt, Germany)로부터 얻었고; 아세토니트릴(LC-MS 등급), 포름산산(FA, LC-MS 등급, 순도 98%) 및 아세트산암모늄(순도 98%)을 얻었다.하니웰 (Honeywell Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA). 쥐 간 S9분획은 Moltox(Boone, NC, USA)로부터 얻었다. 인간 간 S9 분획은Thermo Fisher Scientific(Rockford, IL, USA)에서 입수했습니다.

2.2. 쥐와 인간의 간 S9 분획

키트 추천에. 준비된 용액은 4◦C 에키나코사이드 A까지화합물 (10µM)을 첨가한 후 37에서 활성화시켰다.◦C 수조. 때신진대사 시간이 150 시점에 도달했습니다.µL의 용액을 회수하였다.원액을 저장하고 두 권의 얼음처럼 차가운 ACN을 추가하여 담금질합니다. 멈춘그런 다음 추가 대사산물 분석을 위해 용액을 QTOF로 옮깁니다.

2.3. 계측 및 조건

HPLC-QQQ/MS 분석은 Agilent 1100 시리즈 HPLC 시스템(Agilent, Palo Alto, CA, USA) API 3000 삼중 사중극자 질량 분석기와 결합(Applied Biosystems, Warrington, UK), Turbo-assisted ion spray(ESI) 이온화양이온화 모드에서 소스. 크로마토그래피 분리는Agilent Eclipse XDB-C18(4.6mm× 100mm× 3.5 µ중). 칼럼 온도는22에서 유지◦C. 이동상은 0.1% 포름산을 함유하는 물로 구성됨(A) 및 메탄올(B). 70% B에서 시작하여 100%까지 증가하는 구배 용출이 사용되었습니다.5분 이내에 B, 90퍼센트 B로 3분 동안 유지, 0.1분 이내에 B를 70퍼센트로 감소, 그리고2.9분 동안 70% B에서 재평형화. 동료 비율 350µL/min을 적용하고 부피10개 중µL을 주사했습니다.

+4500V의 이온화 전압으로 검출을 수행했습니다. 이온 소스 온도350으로 설정했습니다◦C, 커튼 가스(7psi)로 초고순도 질소 사용. 분무기 가스는8psi. 디클러스터링 전위(DP), 입구와 같은 기타 질량 종속 매개변수각 화합물에 대한 포텐셜(EP), 집속 포텐셜(FP) 및 충돌 에너지(CE)는표준 솔루션을 사용하여 포지티브 모드에서 결정됩니다. 다중 반응 모니터링(MRM)은 질소를 충돌 가스(2psi)로 사용하고 체류 시간은각 전환에 대해 200ms. echinacoside A는 전이를 모니터링하여 감지되었습니다.m/z 443.200 → 301.200, 283.200. 데이터는 Analyst 1.4.2 소프트웨어(AppliedBiosystems, Concord, ON, Canada) 및 GraphPad(Prism 8.0.0.).

UPLC-QTOF/MS 분석은 Agilent 1290 Infinity II UPLC 시스템에서 수행되었습니다.(Agilent, Palo Alto, CA, USA), Agilent 6546 quadrupole time-of-flight 질량과 결합분광법(Agilent, Palo Alto, CA, USA). 크로마토그래피 분리를 실시했습니다.Phenomenex Kinetex에서® C18 LC 컬럼(3mm× 100mm× 1.7 µ중). 열온도는 40도로 유지◦C. 이동상 A는0.1퍼센트(v/v) 포지티브 모드의 포름산, 0.1%(v/v) 포름산, 및 10mM CH3쿤4 네거티브 모드에서. 이동상 B는 아세토니트릴이었다. 구배 용출이 사용되었습니다.5퍼센트 B로 0.5분 동안 유지, 5.5분 이내에 50퍼센트 B로 증가, 100퍼센트로 증가B 10분 이내, 6분 동안 유지. 동료 비율 400µL/min이 적용되었고,볼륨 2µL을 주사했습니다.

Agilent 6546 quadrupole time-of-flight 질량분석법에는 전자 장치가 장착되어 있습니다.ESI(트로스프레이 이온화) 소스. 데이터 수집은 Mass Hunter의 통제하에 있었습니다.워크스테이션 소프트웨어. 양이온 및 음이온의 일반적인 작동 소스 조건ESI 모드는 다음과 같이 최적화되었습니다. 이온 분무 전압(ESI...을 더한/ESI−) 이었다4000 V/3000 V; 가스 온도는 320◦씨; 건조 가스 펠로우율은 8L/분이었고; 분무기 압력은45psi; 시스 가스 온도는 350◦씨; 시스 가스 펠로우율은 12L/분이었고; 충돌에너지는 10, 20, 40 및 60 V였습니다. Agilent MassHunter를 사용하여 대사체를 식별했습니다.Biotransformation 소프트웨어(버전 B.04.00)(Santa Clara, CA, USA). 크로마토그램Agilent를 사용하여 부모 및 확인된 대사체의 질량 스펙트럼을 추출했습니다.MassHunter 정성 분석 소프트웨어(버전 B.05.00) (Santa Clara, CA, USA).

더 요청:

이메일:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp 및 86 15292862950