면역 자극 항체 접합체는 강력한 골수 활성 및 내구성 항종양 면역을 유도합니다(1부)

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추상적인

toll-like receptors(TLRs)를 포함한 타고난 패턴 인식 수용체는 종양 미세 환경과 주요 적응 항종양 면역을 변경할 수 있습니다.그러나, TLR 작용제는 전신 투여 후 광범위한 면역 활성화와 관련된 독성으로 인해 내약성이 좋지 않았습니다.전신 전달에 적합한 치료제를 설계하고종양 표적화 반응을 유도할 수 있는 우리는 종양 표적화 항체에 접합된 TLR7/8 작용제를 포함하는 새로운 부류의 면역 자극 항체 접합체(ISAC)를 개발했습니다.전신적으로 투여된 항-HER2 ISAC는 생체내 내약성이 우수하고 종양내 골수 세포의 강력한 활성화를 유도하여 종양 제거 및 후속 면역학적 기억을 초래하였다.시험관 내 효능 및 생체 내 효능은 식균 작용 및 T 세포 매개 항종양 면역을 가능하게 하는 온전한 Fc 기능 및 TLR 작용에 의해 구동되는 직렬 활성을 필요로 했습니다.ISAC가 매개하는 면역학적 기억은 HER2에 국한되지 않았습니다. ISAC를 처리한 마우스는 HER{3}}음성 종양에 대한 재감염으로부터 보호되었기 때문입니다.이러한 결과는 ISAC의 임상 개발에 대한 강력한 근거를 제공하고 Fc R과 TLR7/8 신호전달 간의 시너지 효과가 ISAC 매개 항종양 면역의 기전에 기여한다는 것을 보여줍니다.

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소개

20세기 말 이전에 암 환자는 일반적으로 외과적 절제, 방사선 및 화학 요법의 세 가지 치료법을 사용할 수 있었습니다. 암 면역 요법의 출현은 비호지킨 림프종에 대한 리툭시맙의 승인으로 시작하여 체크포인트 억제제 1,2의 광범위한 채택으로 확장된 종양학 레퍼토리를 크게 확장한 강력한 네 번째 양식을 추가했습니다. 그러나 면역 요법을 포함한 모든 치료법은 종양의 이질성과 돌연변이 부담을 극복하는 지속적인 생물학적 및 면역학적 반응을 일으키지 않는 한 일시적으로 제한됩니다 3-5. 항-PD{7}} 및 PD-L1 항체와 같은 체크포인트 억제제는 높은 종양 돌연변이 부담 또는 미세위성 불안정성이 있는 환자를 포함하여 여러 적응증에서 결과를 극적으로 개선하며, 체크포인트 면역요법에 대한 종양 감수성의 결정 요인 중 하나는 이전의 정도입니다. -기존 T 세포 침윤. T 세포 침윤이 희박한 "차가운" 종양이 있는 환자는 면역 억제된 종양 반응성 T 세포가 종양 미세 환경(TME) 내에 존재하는 "열성" 종양 환자에 비해 체크포인트 차단에 덜 반응하고 더 불량한 예후를 보입니다. 6,7 . 종양 생검 및 면역조직화학은 수지상 세포(DC)와 같은 전문 항원 제시 세포(APC)가 T 세포보다 종종 TME 내에서 더 빈번하지만, 여전히 면역억제 메커니즘에 민감함을 나타냅니다 8,9. TME에 골수 세포가 존재하고 T 세포 활성화를 촉진하는 역할을 감안할 때 종양 관련 APC를 활성화하여 광범위한 T 세포 면역 및 효과적인 항종양 면역 반응을 유도하는 치료법을 개발하려는 노력이 증가하고 있습니다.

Figure 1: ISAC Design and Characterization. (a) Chemical structure of T785 (b) HEK-Blue-TLR7 or TLR8 reporter cells were cultured for 18 hours in the presence of T785, R848, or Poly-ICLC before the assessment of NF-κB- induced SEAP activity. Data shown are from 8 experiments and EC50 values are calculated as mean with SEM. (c) Freshly isolated human myeloid APCs were stimulated with 1 μM of T785 or R848 for 18 hours before the assessment of myeloid activation by flow cytometry. Data are from 1 experiment with 3 donors and are representative of >9명의 기부자. (d) 리툭시맙은 히드록실아민으로 탈아세틸화하고 T{1}}MCC와 반응하여 리툭시맙-ISAC를 산출하기 전에 유리 아민을 보호된 설프히드릴기로 전환하기 위해 라이신 잔기를 통해 SATA와 반응했습니다. (e) PNGase F 처리 후 리툭시맙-ISAC의 LC-MS 분석. DAR은 606g/mol의 링커 작용제 질량 첨가를 기반으로 계산되었습니다. (f) 형광 표지된 리툭시맙 또는 리툭시맙-ISAC를 CD20 + 톨레도 종양 세포와 함께 4도에서 2시간 동안 인큐베이션한 후 유세포 분석을 통해 분석하였다. 데이터는 3중 샘플을 사용한 1개의 실험에서 얻은 것이며 2개의 실험을 나타냅니다.(gh) 새로 분리된 인간 골수성 APC를 CFSE 표지 CD20과 톨레도 종양 세포의 존재하에 리툭시맙, T785, 리툭시맙 및 T785 또는 리툭시맙-ISAC와 함께 3:1 이펙터 대 표적 비율로 배양했습니다. 리툭시맙 농도는 X축에 표시되며, 이들 검정에서 T785의 농도는 T785의 양과 일치합니다.

conjugated to the rituximab-ISAC. (g) Hoffman modulation contrast microscopy showed at 40X magnification after (g) 18 hours following stimulation with 80 nM of rituximab-ISAC. Data are representative of >10 donors. (h) Myeloid APCs were analyzed via flow cytometry 18 hours after stimulation. Data shown are from 3 donors and are representative of >10명의 기증자(평균 및 SEM); *피<0.05,><0.01,><0.001,><>

이제 전임상 모델에서 면역자극제의 국소 전달이 억제된 종양 상주 APC를 처리할 수 있는 활성화된 세포로 재프로그래밍할 수 있고 신생항원을 포함하는 종양 관련 항원을 후속적으로 항종양 면역을 매개하는 T 세포에 제시할 수 있다는 것이 잘 문서화되어 있습니다 10-13 . Carmi et al이 개척한 이러한 전략 중 하나는 Toll-유사 수용체(TLR){7}} 작용제 또는 기능적으로 구제된 종양 관련 APC와 함께 동종 종양 표적 항체의 종양 내 전달이 향상된 항원 흡수 및 항종양 T 세포 면역의 후속 유도. TLR 작용제와 항체 효과기 기능을 활용한 이 조합 전략은 원발성 종양과 전이성 병변을 근절하고 종양 재발로부터 숙주를 보호했습니다 11,14. 유사하게, TLR9 작용제, CpG, 활성화된 APC 및 T 세포와 조합된 작용제 항-OX40 항체는 마우스의 여러 종양 유형에 대해 인상적인 효능을 나타냅니다. 흑색종 환자의 임상 데이터와 함께 여러 적응증에서 조사되어 항PD{20}} 항체와 함께 TLR9 효능제의 종양 내 전달이 주사되지 않은 병변에서 종양 수축 및 복강경 반응을 유발할 수 있음을 시사합니다 15. 유사하게, 여러 그룹은 인간 APC에서 TLR7/8의 발현 패턴이 뮤린 APC에서 TLR7 및 TLR9의 발현 패턴을 보다 밀접하게 반영하기 때문에 종양 면역 요법을 위해 TLR7/8 효능제를 추구하고 있습니다. 궁극적으로, APC를 표적으로 하는 면역 작용제의 전신 전달이 독성, 짧은 반감기 및 표적 부위에 대한 차선의 전달로 인해 제한되었기 때문에 종양 내 전달 전략의 채택은 효과적인 경우 종양 접근성에 의해 제한될 것입니다.우리의 목표는 면역 작용제에 결합된 종양 표적 단일클론 항체를 포함하는 면역 자극 항체 결합체(ISAC)를 내구성 항종양 면역을 유도하기 위한 새로운 치료 접근법으로 설계하는 것이었습니다. ISAC의 전신 투여는 Fc에 의존하는 TME에서 국소화된 APC 활성화를 유도했습니다.TLR 작용제의 전신 전달과 관련된 전형적인 독성을 회피하면서 이펙터 기능 및 TLR 활성화. 더욱이, 종양 보유 마우스에 대한 이들 접합체의 전신 투여는 항원 처리 및 T 세포에 대한 제시를 가능하게 하여 접합되지 않은 종양 표적화 항체에 내성인 다중 모델에서 지속적인 항종양 면역을 유도하였다.

결과

ISAC 설계 및 특성화 TLR 작용제를 항체에 접합할 수 있도록 분자 도킹 도구를 사용하여 항체에 대한 용매 접근 가능한 부착 지점 역할을 하는 부틸-아민이 있는 새로운 TLR7/8 작용제(T785)를 설계했습니다( 그림 1A, 보충 그림 1A-C). T785는 NF-κB 유도성 분비 알칼리 포스파타제 리포터 및 TLR7 또는 TLR8을 공동 발현하는 HEK293 세포주에서 EC5가 0.643μM인 인간 TLR7 및 EC50이 1.60μM인 인간 TLR8과 관련되었습니다(그림 1B ). TLR7/8에 대한 T785의 특이성은 TLR7/8 발현이 결여된 HEK293 리포터 세포에서 T785가 NF-κB 활성을 유도할 수 없음에 의해 확인되었습니다(보충 그림 2A). 1차 세포에서 작용 활성을 확인하기 위해 TLR7과 TLR8을 모두 발현하는 골수성 APC(~96% 단핵구, 4% DC, 보충 그림 3A)라고 하는 새로 분리된 단핵구 및 DC를 1μM T785 또는 R848로 밤새 자극했습니다. 잘 확립되고 특성화된 TLR7/8 작용제 19. T785 및 R848은 유사한 정도로 골수성 APC를 자극했습니다(그림 1C) 20,21. T785의 활성은 TLR7을 발현하지만 TLR8은 발현하지 않는 새로 분리된 인간 형질세포양 DC(pDC)에서도 확인되었습니다(보충 그림 2B). 인간 체외 배양에서 ISAC의 효과를 조사하기 위해 다단계 반응에서 T785에 접합하여 B 세포 악성 종양의 치료에 사용되는 임상적으로 검증된 항-CD20 단일클론 항체인 리툭시맙(그림 1D)으로 ISAC를 생성했습니다. 호환되는 이종이기능성 가교제 사용 22. T{59}}ISAC 접합 효율은 PNGase F를 사용한 탈당화 후 LC-MS로 측정하여 평균 약물 대 항체 비율(DAR)이 1.71이 되었습니다(그림 1E). 우리는 ISAC가 CD{67}}를 발현하는 Toledo 종양 세포주를 사용한 유세포 분석 실험 후 CD20에 대등한 결합을 유지한다는 것을 확인했습니다. 785-인간 Fc 수용체(FCGR3A, FCGR2A, FCGR2B, FCGR1)에 대한 ISAC 결합은 Biacore에 의해 평가되었으며 리툭시맙과 유사했습니다(보충 표 1).ISAC는 인간 골수성 APC를 활성화합니다. 리툭시맙 T의 면역자극 가능성 }}ISAC는 18시간 동안 CFSE로 표지된 CD20과 톨레도(Toledo) 종양 세포를 사용하여 새로 분리된 인간 골수성 APC를 공배양한 후 평가되었습니다. rituximab T{81}}ISAC로 배양된 골수성 APC는 DC의 형태와 일치하는 빠른 형태학적 변화를 겪었지만 DC 형태는 그렇지 않았습니다. rituximab, T785 또는 rituximab 및 T785의 등몰 혼합물과 함께 배양된 공동 배양에서 관찰되었습니다(그림 1G). 리툭시맙 T785-ISAC로 자극된 APC는 최대 8일 동안 형태학적으로 생존 및 수지상을 유지한 반면 혼합물로 자극된 APC는 8일까지 대부분 생존할 수 없었습니다(그림 1H). 다색 유세포 분석18시간 후 리툭시맙 T{1}}ISAC로 자극된 APC는활성화된 골수성 DC에서 상향 조절됨 24. 반대로, 리툭시맙으로 자극된 APC,T785 또는 혼합물은 이러한 마커의 발현을 조절하지 않았습니다(그림 1I, 보충 그림 4A, 보충 그림 3BC에 설명된 게이팅 전략).

rituximab T{0}}ISAC로 자극된 인간 APC는 또한 용량 의존적 방식으로 공동자극 분자 CD{1}}를 상향 조절했으며, CD40 및 HLA-DR 상향 조절에서 관찰된 유사한 경향이 활성화된 APC의 표현형과 일치합니다(그림 1I 및 보충 그림 4B). 표면 마커 발현의 용량 의존적 변화는 형광 강도 중앙값(MFI, 그림 1)으로 평가하든 또는 각 마커에 대해 양성인 총 세포 집단의 백분율로 평가하든 일관되었습니다(보충 그림 5). 무세포 상청액의 후속 분석은 리툭시맙 T{11}ISAC 자극 APC가 더 많은 양의 TNF 및 IL{13}}을 분비함을 보여주었습니다(그림 2J 및 보충 그림 4C). T{16}}ISAC의 면역자극 가능성은 rituximab에 국한되지 않았습니다. trastuzumab으로 생성된 T{17}}ISAC도 골수 활성화를 증가시켰기 때문입니다(보충 그림 4D). CD8 + T 세포의 항원 제시 및 교차 프라이밍을 유도하는 ISAC 자극 APC의 능력은 오브알부민(OVA) 모델 항원 시스템 25,26을 사용하여 평가되었습니다. 야생형 마우스로부터 단리된 비장 ​​CD11c 플러스 DC를 OVA 및 항-OVA 항체 또는 ISAC로 형성된 면역 복합체와 함께 밤새 배양하였다. OVA-로딩된 DC를 정량화하고 MHC-I와 복합체를 형성한 OVA 펩티드, SIINFEKL에 대한 TCR 특이성을 지닌 T 세포와 OT-1 CD8과 함께 인큐베이션했습니다. MHC-I, 결합된 SIINFEKL 펩티드의 양으로 측정한 항-OVA ISAC 매개 향상된 교차 제시 및 CD8 + T 세포 증식으로 측정한 향상된 교차 프라이밍(보충 그림 6A 및 6B).ISAC는 증폭된 TLR을 유도합니다. 인간 골수성 APC에서 Fc R 관련 세포 내 신호 전달 Fc R 및 TLR의 활성화는 복잡한 인 신호 전달 캐스케이드를 유도하고 이러한 반응의 크기와 특성은 다양한 면역 세포 하위 집합에서 다릅니다 27. 우리는 다양한 리툭시맙 T{43}}ISAC로 자극된 PBMC-종양 공동배양 내 세포 유형과 질량 세포측정법(CyTOF)을 사용한 등몰 혼합물 대조군 비교 28. 백혈구 하위 그룹(즉, 단핵구, CD4 + T 세포)은 계보 마커를 사용한 SPADE 클러스터링을 통해 확인되었습니다. CD20과 Toledo 종양 세포 및 건강한 B 세포를 모두 포함하는 표적 세포 포함 29. TLR(pIRF7) 및 Fc R(pERK1/2) 신호 전달과 관련된 인산화 사건 개별 성분 혼합물 30,31과 비교하여 단핵구 및 cDC에서 T{52}}ISAC로 자극 후 15분에 증가했습니다. 세포내 신호전달은 골수 기원 세포(단핵구 및 cDC)와 pDC로 크게 제한되었습니다.모두 필요한 Fc R 및 TLR7 및/또는 TLR8을 발현한다. 단핵구 및 cDC에서 ISAC에 의해 유도된 자극은 MAPKAPK2, p38, CREB 및 리보솜 단백질 S6(RPS6)의 상당히 더 높은 인산화를 초래했으며, 이는 다운스트림 단백질 합성을 시작하기 위한 요구 사항입니다(그림 2A-C 및 보충 그림 7A). CD141 + cDC 및 CD1c + cDC는 두 CDC 하위 집합에 걸쳐 비슷한 수준의 pIRF7을 보인 반면, RPS6 및 pERK1/2의 수준은 CD1c와 비교하여 CD8 + T 세포 프라이밍 및 항원 교차 제시에서 탁월한 CD141 + cDC에서 더 높은 경향을 보였습니다. 플러스 cDC(보충 그림 7B).

T785-ISAC 자극의 역학은 예상되는 신호 역학과 일치했습니다. ERK1/2 인산화는 5분 후에 최고조에 달한 반면 다운스트림 파트너인 RPS6은 15-분 시점까지 인산화 최고치에 도달하지 않았습니다(보충 그림 7C). 이 동역학은 신호가 시간이 지남에 따라 전파될 때 예상되는 역학을 지원하고 APC의 ISAC 자극에 대한 지속적이고 증폭된 신호 반응이 있음을 시사합니다. Fc R 및 TLR 신호 전달 경로와 관련된 ISAC 자극 후에 관찰된 증폭된 반응을 감안할 때, 우리는 다음으로 조건부 밀도 재표본 추정 상호 정보(DREMI) 및 조건부 밀도 재조정 시각화(DREVI) 알고리즘을 활용하여 내에서 쌍별 관계의 강도를 정량화했습니다. Fc R 및 TLR 신호 전달 경로 32. 이러한 알고리즘은 시각화를 위한 DREVI 플롯을 생성합니다. 여기서 곡선 아래 면적(AUC)은 전체 신호 강도의 지표이고, 변곡점(IP)은 활성화 임계값의 척도이며, DREMI 점수는 문제의 두 인단백질의 쌍별 의존성을 정량화합니다. 이 분석에서는 등몰 혼합물 대조군과 비교하여 T{10}ISAC 자극 후 Fc R 및 TLR 신호전달 경로와 관련된 단백질 간의 쌍방향 의존성이 향상되었음을 나타내는 증가된 DREMI 점수를 확인했습니다(그림 2D). pERK1/2와 pIRF7 사이의 강한 상호 의존성은 T{15}}}ISAC로 자극한 후 고유하게 관찰되었지만, IRF7 인산화에 필요한 증가된 DREMI 점수, 증폭된 신호 강도 및 감소된 활성화 임계값에서 알 수 있듯이 혼합물은 아닙니다(그림 2D ). 이 분석은 또한 pERK1/{20}}pRPS6 및 pIRF{22}}pRPS6의 쌍별 조합에 대해 증가된 DREMI 점수 및 감소된 IP로 정량화된 ISAC 자극 후 단백질 번역(RPS6 인산화)을 시작하는 데 필요한 감소된 활성화 임계값을 나타냈습니다. . 또한, RPS6 인산화 수준은 증가된 쌍별 AUC에 의해 결정된 바와 같이 ERK1/2 또는 IRF7 인산화의 결과로 증폭되었습니다(그림 2D). 이러한 결합된 결과는 예상되는 Fc R 및 TLR 경로를 통한 ISAC의 신호전달을 확인할 뿐만 아니라 두 경로 간의 시너지 효과를 지원하여 감소된 활성화 임계값과 증폭된 신호 강도를 초래합니다.

그림 3: ISAC는 골수 활성화를 매개하기 위해 Fc 이펙터 기능과 TLR 작용제가 필요합니다. 새로 분리된 인간 골수성 APC를 CD20과 톨레도 종양 세포의 존재 하에 3:1 이펙터 대 표적 비율 및 (a) 80 nM의 존재 하에 18시간 동안 배양했습니다. 1 μM R406이 있거나 없는 리툭시맙-ISAC의 (b) 표시된 항체 이소타입에 대한 리툭시맙-ISAC, (c) 리툭시맙-ISAC 또는 탈당화된 리툭시맙-ISAC(ISAC-탈당화된). (ac) 세포를 유세포 분석으로 분석하고 데이터를 형광 강도 중앙값으로 보고합니다. (d) HEK-Blue-TLR7 또는 TLR8 리포터 세포를 NF-κB 유도 SEAP 활성 평가 전에 T785 또는 TLRnull의 존재 하에 18시간 동안 배양하였다. 표시된 데이터는1개의 실험과 최소 3개의 실험을 대표합니다. (e) 새로 단리된 인간 골수성 APC를 CD20 + 톨레도 종양 세포 및 표시된 리툭시맙-ISAC의 존재 하에 18시간 동안 배양하고 유세포 분석에 의해 분석하였다(데이터는 중앙값으로 표시됨형광 강도). (ae) 표시된 데이터는 1-4 추가 실험을 나타내며 각 실험(평균 및 SEM)에 대해 3명 이상의 기증자입니다. 통계적 유의성은 *P로 정의됩니다.<0.05,><0.01,><0.001,><>

ISAC는 골수성 APC의 활성화를 매개하기 위해 Fc 이펙터 기능이 필요합니다. ISAC 기능에 대한 Fc 활성의 기여는 활성화 Fc Rs의 다운스트림 신호 전달을 방지하는 Syk의 소분자 키나제 억제제인 ​​R406을 사용한 다운스트림 Fc R 신호전달의 제거 후 조사되었습니다 33,34 . R406의 추가는 공동자극 분자 CD{6}}의 상향조절 부족으로 입증된 바와 같이 T785-ISAC 매개 골수성 활성화를 중단시켰지만 T785에 의한 TLR7/8 활성화에 대한 세포 반응은 변경하지 않았습니다(그림 3A & 보충 그림 8). T{13}}ISAC 자극 후 단핵구에서 R406을 사용한 Syk 억제도 신호전달을 폐지하는 것으로 관찰되었으며,측정된 인산화된 MAPKAPK{0}}, ERK1/2 및 IRF7의 수준이 크게 감소했습니다(보충 그림 7D).이러한 데이터가 주어지면 rituximab T{0}}ISAC는 T{1}}ISAC 활성이 알려진 Fc R 결합 친화도에 따라 변하는 정도를 정의하기 위해 4가지 자연 발생 동형 각각에 대해 비교 가능한 DAR과 함께 공식화되었습니다35,36. 글리코실화가 Fc R 결합을 제거하는 반면 푸코실화가 FCGR3A 37에 대한 결합 친화성을 증가시키기 때문에 비글리코실화 및 푸코실화된 리툭시맙 ISAC도 조사되었습니다. 리툭시맙 T{6}}ISAC의 면역자극 능력은 항체 이소타입의 Fc R 친화성과 상관관계가 있었습니다(그림 3B). 반대로, 푸코실화된 IgG1(IgG1-AF), 야생형 IgG1 및 IgG3 T{12}}ISAC는 골수성 활성화를 유도했으며, IgG{13}}AF T{14}}ISAC는 가장 높은 CD{15}} 상향 조절 수준(그림 3B). Fc-Fc R 결합 친화도를 감소시키는 PNGase F를 사용한 야생형 리툭시맙 T{17}}ISAC의 탈당화는 시험관 내 ISAC 면역 자극 활성을 감소시켜 기능적으로 활성인 Fc 영역의 중요성을 뒷받침합니다(그림 3C).

ISAC는 골수 활성화를 매개하기 위해 TLR 작용을 필요로 합니다. TLR7 및 TLR8 38의 포켓(TLRnull, 그림 3D). TLRnull 화합물은 리툭시맙(TLRnull ISAC)에 접합되었고 시험관 내에서 CD20 플러스 종양 세포의 존재 하에 골수 활성화 가능성에 대해 평가되었습니다. TLRnull ISAC는 공동자극 분자 CD{6}}의 상향조절을 유도하지 않았거나 CD14 또는 CD123의 발현을 조절하지 않았으며, 이는 T785-ISAC에서 관찰된 활성화 표현형에 TLR 작용제가 필요함을 나타냅니다(그림 3E). 또한 TLRnull ISAC는 단핵구에서 IRF{11}}의 인산화를 유도하지 않았으며 이는 TLR7/8에 관여하지 못하는 것과 일치합니다(보충 그림 7E). 전신 투여된 trastuzumab T{15}}ISAC는 인간 이종이식 종양 모델에서 B, T 또는 NK 세포 활성 B, T 및 NK 세포 활성이 없을 때 고형 종양의 골수성 및 호중구 매개 파괴를 유도하는 ISAC의 능력은 인간 이종이식 모델을 사용하여 평가되었습니다 39,40. 임상적으로 검증된 HER{20}표적화 항체인 Trastuzumab은 trastuzumab T{21}}ISAC가 HER2 및 고형 종양 모델에서 trastuzumab에 대한 종양 내성을 극복할 수 있는지 여부를 확인하기 위한 조사를 위해 선택되었습니다(그림 4 및 보충 그림 9 ) 41,42. 먼저, trastuzumab T{27}}ISAC의 전신 투여를 trastuzumab과 T785 혼합물의 종양 내 전달과 비교했습니다. 트라스투주맙 T{30}}ISAC는 종양 퇴행 및 제거를 유발한 반면 등몰 성분 혼합물의 전달은 트라스투주맙 단독과 비교하여 최소한의 치료 이점을 제공했습니다(그림 4A). 종양 표적 ISAC를 적절한 이소타입 대조군과 비교한 후속 연구에서 항종양 활성이 종양 표적화를 필요로 함을 확인했습니다(그림 4B 및 보충 그림 10). 중요하게도, trastuzumab T{37}} ISAC의 전신 투여 및 이의 동형 대조군은 체중에 대한 영향을 최소화하면서 내약성이 우수했습니다(보충 그림 11).생체 내 ISAC 효능에 기여하는 작용 기전이 시험관 내에서 기술된 것과 유사한지 여부를 결정하기 위해 Fc-불능(trastuzumab N297A-ISAC) 및 trastuzumab TLRnull-ISAC를 동일한 유방 종양 이종이식 모델에서 테스트했습니다.야생형 trastuzumab T{0}}ISAC와 병행합니다.trastuzumab T{0}}ISAC가 종양 퇴행 및 제거를 유도한 반면, Fc-무능력 및 TLRnull ISAC는 모두 항종양 활성을 유도하지 못했습니다(그림 4C).함께 이러한 데이터는 ISAC 항종양 활성에 대한 종양 표적화 및 Fc R 및 TLR 결합에 대한 요구 사항을 나타냅니다.

항종양 효과를 매개하는데 있어서 호중구 대 다른 골수 세포의 차등 기여는 세포 특이적 고갈에 의해 평가되었다.호중구는 Ly6G 항체를 사용하여 고갈되었고, 호중구와 미성숙 APC(단핵구) 모두 고갈되었습니다.항-Gr1 항체로 달성되었습니다.클로드로네이트-로딩된 리포솜을 사용하여 식세포를 고갈시켰다.우리는 식세포, 아마도 대식세포가 ISAC 치료 후 항종양 활성을 매개하는 데 크게 기여한다는 것을 발견했습니다(그림 4D).그러나 항-Ly6G를 사용한 호중구 고갈은 ISAC 효능에 영향을 미치지 않았습니다.Gr1 고갈은 ISAC 매개 효능에 즉시 영향을 미치지 않았지만 종양 제어 기간을 단축했습니다(그림 4D).T{0}}ISAC가 더 낮은 모델에서 종양 성장을 제어하는 ​​능력을 조사하기 위해HER2 발현, 우리는 다음으로 트라스투주맙 내성, HER2-매체 발현 종양 모델인 JIMT-1에서 효능을 모델링했습니다.JIMT{0}} 암 세포주는 표면 HER2의 약 6.5 x105 사본을 갖는 것으로 추정되며 감소된 수준의 발현을 나타냅니다.유세포 분석에 의한 HCC1954 종양 세포주와 비교한 HER2 43.동안trastuzumab T{0}}ISAC는 isotype ISAC 또는 trastuzumab 대조군과 비교하여 종양 성장을 유의하게 둔화시켰지만 종양 퇴행이나 제거는 관찰되지 않았습니다(그림 4E).우리는 trastuzumab의 결합 부위와 다른 HER2 에피토프에 결합하는 pertuzumab이 Fc-클러스터링을 증가시키고 후속적으로 JIMT{2}} 모델에서 ADCP 및 ISAC의 효능을 향상시킬 것이라고 가정했습니다.트라스투주맙 T{0}}ISAC와 페르투주맙의 조합은 상당히 향상된 효능과 상당한 종양 퇴행을 초래했습니다(그림 4F).트라스투주맙 T{0}}ISAC의 면역 자극 없이 페르투주맙과 트라스투주맙의 조합은 아무런 이점이 없었습니다.

다음으로 궁극적으로 항종양 효능을 나타내는 trastuzumab T{0}}ISAC에 의해 유발된 분자 및 세포 이벤트를 조사했습니다.종양의 초기 유전자 발현 변화NanoString 마우스 범암 면역 프로파일링 패널로 측정한 결과, TLR7 신호 전달 및 활성화와 관련된 유전자(IRF-7, NF-kB 관련 유전자)를 포함하여 치료 24시간 이내에 13.7%의 유의한 상향 조절이 나타났습니다.트라스투주맙 또는 동형 T{2}}ISAC 치료 후 0-0.1%와 비교하여(그림 4G) 44.nSolver Advanced Analysis Pathway Score에 의해 평가된 유전자 발현 경로의 분석은 주요 면역 관련 유전자 시그니처(대식세포 기능, DC 기능, 항원 처리 및 표현)의 상당한 상향 조절을 밝혀냈습니다.Fc-Fc R 상호 작용이 ISAC 매개 활성에 중요하다는 시험관 내 및 생체 내 발견과 일치합니다(그림 4H 및 보충 그림 12).케모카인 및 사이토카인과 관련된 유전자 시그니처 점수는 트라스투주맙 T{0}}ISAC 처리 후 높게 상승했으며, 이는 투여 24시간 후 종양 내에서 사이토카인 및 케모카인 분비를 측정하여 수행된 단백질 정량화와 일치합니다(그림 4H및 보충 그림 13).시험관 내 및 생체 내 효능 데이터와 일치하는 이러한 발견은 강력한 TLR 및 Fc R 매개 반응이 ISAC에 의해 유도됨을 나타냅니다.

유세포 분석 및 IHC를 사용하여 증가된 T{0}}ISAC 매개 활성화 및 케모카인 발현이 궁극적으로 면역 효과기 세포의 모집을 유도하는지 여부를 평가했습니다.골수성 면역 침윤물은 트라스투주맙 T{3}}ISAC 또는 트라스투주맙의 단일 용량 투여 후 24시간 및 7일 후 유세포 분석에 의해 프로파일링되었으며 처리되지 않은 대조군과 비교되었습니다.치료 24시간 후 종양 분석 밝혀미처리 대조군과 비교하여 트라스투주맙 또는 트라스투주맙 T{4}}ISAC로 처리된 종양에서 CD11b + Ly6C + 단핵구 및 CD11b + Ly6G + 과립구의 침윤.치료 7일 후, CD11b + CD11c + F4/80 + 양성 골수성 APC는 트라스투주맙 T{5}}ISAC 처리군에서트라스투주맙 또는 미처리 대조군(그림 4I) 45,46.골수성 APC의 이러한 증가는trastuzumab T{1}}ISAC 치료 후 골수성 관련 케모카인 생성이 크게 증가했기 때문입니다.24-시간 시점에서 골수성 APC의 빈도는 유의하게 증가하지 않았지만, 세포 표면에서 CD40의 상향 조절에 의해 측정된 바와 같이 이 표현형의 세포는 trastuzumab T{1}}ISAC 처리 후에 활성화되었습니다. , 트라스투주맙 또는 미처리 대조군의 동일한 모집단과 비교합니다(그림 4I).이 발견은 NanoString 데이터와 함께 종양 미세 환경에서 골수 세포에 관여하고 활성화하는 trastuzumab T{0}}ISAC의 능력을 추가로 보여줍니다.치료 1주 후 관찰된 골수성 APC의 CD11b 양성을 감안할 때, 단핵구의 초기 침윤은 ISAC 치료 종양에서는 성숙하지만 트라스투주맙 치료 종양에서는 성숙하지 않는 골수성 APC 집단의 전구체일 수 있습니다.그러나 NanoString 및 MSD에 의한 ISAC 자극 후 24시간에 측정된 전염증성 근위 사건이 나중에 6-일 시점에서 변형 종양 미세 환경에서 골수 세포의 성숙과 같은 말단 사건에 궁극적으로 어떻게 영향을 미쳤는지 결정해야 합니다. , 그리고 궁극적으로 종양 퇴행 및 제거에 영향을 미쳤습니다.
마지막으로 IHC를 수행하여 대조군과 비교하여 트라스투주맙 T{0}}ISAC로 치료한 후 종양에서 주요 면역 세포 집단의 존재 및 위치를 평가했습니다.7일차 유세포 분석과 일치하여 F4/80 발현 세포트라스투주맙 T{1}}ISAC로 단일 처리한 후 9일째에 종양 및 종양 주위 영역이 상승했습니다(그림 4J).더욱이, 표적화된 ISAC 치료는 rHER2 항체 치료 또는 이소형 또는 이소형-ISAC로 처리한 후에 볼 수 없었던 종양 주변 영역에서 CD11c 플러스 세포의 극적인 증가를 초래했습니다(그림 4J).유세포 분석 및 IHC 모두에 의한 CD11c 플러스 세포의 상승은 NanoString 데이터에서도 입증되었으며, 여기서 ITGAX의 mRNA 발현은 트라스투주맙 T{3}}ISAC 투여 후 6일과 9일에 유의하게 상승했습니다(보충 그림 14).

그림 5: T785-ISAC는 MMC 동계 종양 모델에서 강력한 항종양 효과를 나타냅니다. (ah) FVB/N-TgN(MMTV-Erbb2) 마우스에 MMC 종양 세포주가 이식되었습니다. (a) 종양 부피가 약 500mm3에 도달했을 때 암컷 마우스를 무작위로 추출했습니다. 그런 다음 마우스에 5 mg/kg q5d x 2의 마우스 항-랫트 HER2 항체, 마우스 항-래트 HER2 T{16}}ISAC 또는 동형 T{17}}ISAC(TA99)를 복강내 주사하여 처리했습니다(n 팔당 =4-7 마우스). (b, c) 수컷 마우스는 종양 부피가 약 500mm3에 도달했을 때 무작위로 지정되었고 초기 치료 날짜 하루 전부터 식세포 고갈(6주기, 15일까지)을 위한 클로드로네이트 로딩 또는 대조군 리포솜으로 사전 처리되었습니다. -CD8 depleting antibody (rIgG2b control) for CD8 T cell depletion (8 cycles, through Day 21). Animals were treated with 5 mg/kg rHER2 T785-ISAC q5d x 2 (n=6 mice per group) intraperitoneally. For phagocyte depletion, statistics reflect a comparison of T785-ISAC treatment with clodronate or control liposomes, while for CD8 T cell depletion, statistics reflect a comparison of T785-ISAC with T785-ISAC + CD8 Depletion or T785-ISAC + rat isotype IgG2b. (d) Anti-rHER2 T785-ISAC treated mice that experienced complete tumor regression for >그들의 마지막 치료 60일 후에 MMC 종양 세포주로 챌린지되었습니다. 종양 경험이 없는 마우스가 이식 대조군으로 사용되었습니다(그룹당 n=5마리의 마우스). (ad) 데이터는 최소 2번의 실험을 나타냅니다. 일단 종양이 생기면 마우스를 인도적으로 안락사시켰다2,{1}} mm3에 도달했습니다. 종양이 도달하지 않은 그룹에 대한 데이터가 표시됩니다.2,{1}} mm3. (ei) MMC 종양 종양 부피가 약 5{7}}0 mm3에 도달하고 0일 및 5일에 투여된 5 mg/kg ISAC 또는 대조군 항체로 처리된 경우 마우스 집단을 무작위화했습니다. MSD에 의한 사이토카인 측정을 위해 종양을 처리했습니다. , 유세포 분석, NanoString mRNA 정량 또는 포르말린 고정 및 파라핀 포매표시된 시간의 면역조직화학. (e) 화산 플롯은 24시간(그룹당 n{2}}마리의 마우스)에 NanoString으로 측정한 처리된 종양 대 이소형 대조군 종양에서 유전자 발현의 log2 배 변화를 나타냅니다. 조정된 p-값이 < 0.05인="" 변경="" 사항은="" 빨간색으로="" 표시됩니다.="" (f)="" 치료="" 24시간="" 후에="" 분석된="" 종양에="" 대한="" nsolver="" 고급="" 분석="" 경로="" 점수에="" 의해="" 정량화된="" 유전자="" 서명="" 점수(그룹당="" n{7}}마리의="" 마우스).="" (g,="" h)="" 치료="" 시작="" 후="" 24시간="" 및="" 6일="" 후="" 종양="" 세포="" 조성="" 및="" 활성화="" 상태의="" 유세포="" 분석="" 분석(그룹당="" n{10}}="" 마우스).="" 데이터는="" 최소="" 2회의="" 실험을="" 나타냅니다.="">각각의 표시된 처리 후 6일에 수확된 종양의 대표적인 이미지 및 F4/80, CD11c 및 CD8 IHC의 정량화. 스케일 바는 50μm입니다. (ai) 데이터는 평균 및 SEM으로 보고됩니다. *피<0.05,><0.01,><0.001,><>

종양 표적 T{1}}ISAC는 동계 MMC 종양 모델에서 종양 퇴행을 유도합니다
B, T 및 NK 세포의 존재 하에서 항종양 효능을 매개하는 ISAC의 능력을 평가하기 위해, 우리는 자발적 유방에서 유래한 동계 쥐 HER2(rHER2)-발현 마우스 유방 암종(MMC) 세포주를 사용했습니다. FVB 마우스를 발현하는 rHER{4}}의 암종.MMC에서 rHER2 발현과 관련된 종간 면역원성을 최소화하기 위해 대조군 하에 랫트 Her2를 내인적으로 발현하는 형질전환 마우스MMTV 프로모터의 일부가 숙주로 사용되었습니다(보충 그림 15). 47. 우리는 완전한 온전한 면역 체계의 존재를 활용하여 500mm3의 큰 종양 부담을 가진 종양과 싸울 수 있는 ISAC의 능력을 평가하는 것을 목표로 했습니다. 전임상 모델에서는 치료가 더 어렵습니다. 48. rHER2 T{7}}ISAC를 포함한 모든 치료제의 전신 투여는 체중에 대한 영향을 최소화하면서 내약성이 우수했습니다(보충 그림 16A). 그러나 rHER2 T{11}}ISAC만이 크고 확립된 종양이 있는 마우스를 치료할 수 있었습니다(그림 5A). 이종이식 모델에서 볼 수 있는 바와 같이, 세포 고갈 연구는 식세포가 클로드로네이트 로딩 리포솜으로 고갈되었을 때 상당한 항종양 활성이 손실되었음을 보여주었습니다(그림 5B). ISAC가 T 세포에 직접 작용할 것으로 예상되지는 않지만 CD 고갈 항체로 사전 처리된 마우스는 rHER2 T{19}}ISAC를 두 번 투여한 후 종양을 제거하는 능력을 상실했습니다(그림 5C). 이것은 종양 표적 ISAC가 종양 관련 항원의 제시에 따라 T 세포를 통해 간접적으로 작용할 수 있음을 시사합니다. 면역학적 기억의 존재와 일치하여, 생쥐rHER2 T{1}}ISAC 처리 후 치유된 MMC 종양은 종양 재공격으로부터 보호되었습니다(그림 5D).

동계 모델에서 ISAC 효능의 기본 메커니즘을 추가로 조사하기 위해 우리는 다음으로 ISAC 투여 후 종양 미세 환경에서 세포, 전사 및 사이토카인 변화를 조사했습니다. 큰 MMC 종양이 있는 두 집단의 마우스를 rHER2 T{1}}ISAC 또는 대조군으로 처리했습니다. 첫 번째 코호트의 종양은 모든 종양이 유사한 크기인 경우 투여 24시간 후(1일째) 수확되었습니다(보충 그림 16B). 다른 코호트는 첫 번째 투여 5일 후 두 번째 투여를 받은 후 24시간 후(6일째) 수확했으며, 이 시점에서 T{8}}ISAC로 처리된 종양을 제외하고 모든 치료 그룹의 종양이 측정 가능하게 성장했습니다(보충 그림 16B). ). 종양은 IHC, mRNA 발현 및 단백질 용해물에서 사이토카인 분비에 의해 분석되었습니다. 종양 표적화가 ISAC 활성에 필요하다는 이종이식 모델에서의 관찰을 추가로 뒷받침하는, rHER2 T{12}}ISAC 처리 24시간 후 종양의 mRNA 분석은 NanoString 마우스 범암 면역에서 유전자의 34.1%의 극적인 상향조절을 보여주었습니다. 이소타입 처리된 종양과 비교한 프로파일링 패널. 항-rHER2 항체 단독은 유전자 발현에 약간의 영향(분석된 유전자의 3.5%)만 있었던 반면 비표적 이소타입 T{22}}ISAC는 유전자 발현에 영향을 미치지 않았습니다(그림 5E). HCC1954 이종이식 모델에서 볼 수 있듯이 TLR{25}}매개 신호 및 활성화와 관련된 유전자는 종양 표적화 rHER2 T{28}}ISAC에 의해 유의하게 상향 조절되었으며, 이는 강력한 TLR 매개 반응을 나타냅니다(그림 5E). 유전자 발현 경로 분석에서 유전자 발현 경로 분석을 위한 시그니처를 포함한 주요 면역 관련 유전자 시그니처의 상당한 상향 조절이 다시 밝혀졌으며, 케모카인과 관련된 것을 포함하여 rHER2 T{34}}ISAC 처리 후 주요 면역 관련 유전자 시그니처의 상당한 상향 조절이 밝혀졌습니다. 및 사이토카인(그림 5F). NanoString으로 분석한 것과 동일한 종양에서 단백질 정량을 수행했으며, 유전자 시그니처 발견과 일치하여 rHER2 T{39}}ISAC 처리 후 24시간에 염증유발 사이토카인 및 케모카인의 수준이 유의하게 증가하는 것으로 측정되었습니다(보충 그림 17 ). 항원 처리 및 표시, 수지상 세포 기능 및 대식세포 기능에 대한 유전자 서명 점수도 상당히 높아졌으며, 이는 rHER2 T785-ISAC 24시간 후에 anFc-Fc R 매개 및 식세포 작용 유도 반응을 추가로 지원합니다.처리(그림 5F 및 보충 그림 18). 강력한 TLR 및 Fc R 매개 반응과 관련된 유의하게 상승된 유전자 특징 점수 외에도 T 세포 기능에 대한 유전자 특징 점수도 rHER2 T{6}}ISAC 처리 후 24시간 이내에 유의하게 증가하여 추가 지원 ISAC 매개 효능에 T 세포가 필요하다는 것을 발견했습니다(그림 5F 및 보충 그림 18).

전염증성 사이토카인 및 케모카인 생성의 초기 증가에 기여할 수 있는 면역 세포를 특성화하기 위해 rHER2 T785-ISAC의 첫 번째 투여 후 24시간 및 이 약 투여 개시 후 6일 후 유세포 분석으로 종양을 분석했습니다. 치료, 두 번째 투여 후 24시간. 1일째에 종양을 분석한 결과 rHER2 T785-ISAC로 처리된 종양에서 CD11b + Ly6C + 단핵구의 침윤이 나타났고 rHER2 mAb 또는 rHER2 T{14}}ISAC로 처리된 종양에서 CD11b + Ly6G + 과립구의 침윤이 나타났습니다. , 그러나 이소형 ISAC 또는 이소형 항체 대조군은 아닙니다(그림 5G). 단핵구 수준은 6일 후 rHER2 T{17}}ISAC 처리된 종양에서 훨씬 더 증가했습니다. HCC1954 이종이식 모델에서 관찰한 것과 유사하게 골수성 APC(CD11b + CD11c + F4/80 + )는 대조군과 비교하여 rHER2 T{26}}ISAC 처리 후 6일째에 유의하게 증가했습니다(그림 5G 및 보충 그림 19). ). 또한, 골수성 APC는 세포 표면에서 CD40의 상향 조절에 의해 측정된 바와 같이 두 시점 모두에서 rHER2 T{30}} ISAC 처리군에서 특이적으로 활성화되는 것으로 밝혀졌습니다(그림 5H). 중요하게도, 클로드로네이트 로딩 리포솜을 사용한 식세포 고갈 후 종양 골수성 APC의 증가는 측정되지 않았습니다(보충 그림 20). 마지막으로, rHER2 T{36}}ISAC로 처리한 후 MMC 모델에서 주요 면역 세포 집단의 존재와 위치를 평가하기 위해 IHC를 수행했습니다. HCC1954 이종이식 모델에서 볼 수 있듯이 rHER2 T{39}}ISAC 처리는 rHER2 항체 처리 또는 이소타입 처리 후에는 볼 수 없었던 종양주위 영역의 CD11c plus 및 F4/80 plus 세포의 극적인 증가를 가져왔습니다. 또는 동형 T785-ISAC(그림 5I). T 세포 케모카인의 초기 발현 및 T 세포 기능에 대한 증가된 유전자 표지 점수와 일치하게, CD8 플러스 세포의 상당한 침윤이 6일째에 rHER2 T{48}}ISAC 처리된 마우스의 종양 내에서 IHC에 의해 관찰된 반면, 항-rHER2 항체 또는 이소형 대조군으로 처리된 마우스에서 CD8 염색은 낮게 유지되었습니다(도 5I). 증가된 CD8 및 IHC 염색은 T 세포 기능 관련 유전자의 증폭된 유전자 발현 및 CD{56}}의존성 종양 제거와 함께 T{57}}한랭 종양을 뜨겁게 만드는 T{57}}ISAC의 잠재력을 뒷받침합니다.CL{ {58}}ISAC는 HER{59}}배지 발현 이종이식 종양 모델에서 종양 퇴행을 유도합니다. ISAC가 여러 면역 자극 페이로드에 걸쳐 강력한 플랫폼임을 입증하기 위해 우리는 DAR이 있는 잘 알려진 TLR7 작용제인 CL264를 사용하여 ISAC를 개발했습니다. trastuzumab T{64}}ISAC와 유사합니다(그림 6A 및 보충 그림 21). HCC1954 이종이식 모델에서 CL264 또는 T785로 생성된 트라스투주맙 ISAC가 트라스투주맙, 트라스투주맙 CL{72}}ISAC 또는 트라스투주맙 T{73}}ISAC의 단일 투여 후 24시간 동안 평가되었습니다. . 트라스투주맙 또는 트라스투주맙 T{74}}ISAC와 비교하여 종양 침윤성 CD11b + CD11c + F4/80 + 골수성 APC에서 증가된 CD40 발현에 의해 입증된 바와 같이 트라스투주맙 CL{74}}ISAC에서 향상된 골수성 활성화가 관찰되었습니다(그림 6B). ).CL{0}}ISAC의 향상된 골수 활성화 능력이 생체 내에서 더 큰 항종양 활성으로 변환되는지 확인하기 위해 trastuzumab CL{2}}ISAC를T785-HER2High HCC1954 및 HER2Med JIMT-1 종양 모델의 ISAC. 둘 다trastuzumab ISAC는 HCC1954 HER2High 모델에서 완전한 종양 퇴행을 중재했으며, CL{2}}ISAC는 JIMT-1 HER2Med 모델에서 항종양 활성이 증가한 것으로 나타났습니다. 연결됩니다(그림 6C-D).

두 ISAC 모두 내약성이 우수했지만 trastuzumab CL264-ISAC 또는 rituximab CL264-ISAC로 치료한 동물에서 일시적인 체중 감소가 관찰되었으며 체중은 다음으로 회복되었습니다. 또는 세 번째 용량에 의해 기준선 초과(보충 그림 16A). T785-ISAC 또는 CL{6}}ISAC로 처리한 후 전신 사이토카인 분비를 측정했습니다. T{7}}ISAC 투여 4시간 후 동물의 혈청에서 낮은 수준의 TNF가 측정된 반면, 표적화된 CL{8}}ISAC는 모두 전신적으로 더 높은 수준의 TNF 분비를 유도했습니다(보충 그림 11). . T785와 CL264 ISAC 사이의 이러한 효과는 ISAC가 시험관 내에서 암세포 증식을 억제하지 않았기 때문에 종양 세포 성장에 대한 ISAC의 직접적인 영향으로 인한 것 같지 않습니다(보충 그림 9).

CL{0}}ISAC는 동계 종양 모델에서 종양 제거 및 면역학적 기억을 유도합니다. 다양한 HER2 항원 밀도를 갖는 인간 종양 이종이식 모델에서 CL{1}}ISAC로 관찰된 증가된 효능 및 효능을 감안할 때, 우리는 다음으로 CL의 활성을 특성화했습니다 264-동계 종양 모델의 ISAC. MMC 모델의 T785-ISAC와 유사하게 CL264-ISAC는 T 세포 의존적 방식으로 종양 퇴행 및 제거를 유도하여 지속적인 면역학적 기억을 유도합니다(보충 그림 22A). 항원 발현이 감소된 동계 종양 모델에서 ISAC 효능을 평가하기 위해 쥐 HER2(CT{10}}rHER2)를 안정적으로 발현하는 CT26 세포주를 개발했습니다. 중요하게도, CT26 세포의 약 8.5%는 종양 이식 후 rHER2를 발현하지 않습니다(그림 6E). rHER2 CL{18}}ISAC로 처리된 야생형 Balb/c 마우스는 실험 기간 동안 마우스의 75%(8명 중 6명)가 종양을 제거하고 종양이 없는 상태를 유지한다는 점에서 상당한 항종양 면역성을 나타냈습니다. 항-rHER2 항체로 처리된 마우스 중 어느 것도 완전한 퇴행을 나타내지 않았다(도 6F). rHER2 CL{29}}ISAC 처리 후 약 10% 체중의 일시적인 체중 감소가 관찰되었으며 체중은 연구 시작 후 8일까지 회복되었습니다(보충 그림 22B). 우리는 이전에 CT{35}}rHER2 종양이 치료된 마우스에 rHER2가 결여된 모 CT26 세포주를 시험하여 표적 항원 rHER2의 발현이 결여된 종양에 대해 rHER2 CL{33}}ISAC가 면역학적 기억을 매개하는지 평가했습니다. 표현. 이전에 rHER2 ISAC로 CT{39}}rHER2 종양이 치료된 마우스는 모체 CT26 세포주에 대한 공격으로부터 완전히 보호되었습니다(그림 6I). 종양 재공격 전 CD4 및 CD8 T 세포의 고갈은 T 세포가 보호에 필요함을 보여주었습니다. 마지막으로, 우리는 이전에 ISAC로 치료한 마우스에서 발달된 면역학적 기억이 치료된 원발성 종양의 종양 관련 항원에 특이적인지 여부를 테스트했습니다. 부모 CT26 종양 재챌린지 동안, 마우스는 반대쪽 옆구리에 이식된 다른 종양인 4T1으로 동시에 챌린지되었습니다. 데이터는 면역학적 기억의 발달이4T1 종양의 종양 성장이 영향을 받지 않았기 때문에 rHER2와 구별되는 CT26 종양 관련 항원에 특이적입니다(그림 6G).