임신 중 저단백질 섭취가 남성 태아의 배아 신장 MicroRNA 발현 및 네프론 전구 세포에 미치는 영향
Mar 08, 2022
소개
영양소 결핍은 태아 발달의 다양한 단계에서 중추 경로의 신호 변화를 초래할 수 있으며, 이는 성인기에 돌이킬 수 없는 장기 및 시스템 장애를 유발할 수 있습니다[1]. 태아 프로그래밍은 유기체의 구조나 기능에 장기적인 영향을 미치는 발달 중 모욕을 의미합니다[2]. 태아 프로그래밍이 중단되면 저체중아 출산, 네프론 감소, 심혈관 및 심혈관 질환 위험 증가신장성인기의 장애 [3-6]. 다른 저자와 우리의 연구에 따르면 저체중아, 28% 적은 네프론, 감소신장염분 배설, 만성신부전, 그리고 성인기의 표준(NP) 단백질 섭취 자손과 비교한 임신 저단백(LP) 섭취의 동맥 고혈압[3-7]. 신생식은 유전자 발현, 단백질 합성 및 조직 리모델링의 엄격한 제어를 포함합니다. 연구에 따르면 네프론 수는 요관 봉오리(UB)와 후신 중간엽(MM) 전구 세포 사이의 상호 작용에 의해 결정됩니다[8-10]. MM의 신호는 세뇨관 시스템의 UB 자극 성장 및 분기를 유도합니다. 차례로, 중간엽 캡(CM)을 구성하는 MM 증식 및 분화는 UB 말단에 의해 매개됩니다[11].
태아 발달에 대한 태아 스트레스의 장기적인 영향과 관련하여 후성 유전적 변화의 역할에 심각한 관심이 있었습니다[12]. MicroRNA(miRNA)는 약 22개 뉴클레오티드 길이의 게놈으로 암호화된 작은 비암호화 RNA이며 표적 유전자 발현의 전사 후 조절에 필수적인 역할을 합니다[13-16]. miRNA는 mRNA 번역 또는 세포질의 안정성을 조절하여 전사 후 유전자 발현을 제어합니다[17, 18]. 기능 연구는 miRNA가 발달 및 세포 생리학 동안 중요한 생물학적 과정에 관여한다는 것을 나타냅니다[13, 16]. 발현의 변화는 여러 병리학에서 관찰되었습니다[16, 19]. 따라서 miRNA 특성화는 유전자 조절 및 세포 증식, 분화 및 세포자멸사를 이해하고 다음을 포함한 병태생리학적 장애를 설명하는 데 도움이 되었습니다.신장장애 [20-22]. 연구에 따르면 동안신장개체 발생 miRNA는 네프론 발달에 필수적입니다[23-26]. 또한, MM 전구 세포에서 일부 miR NA의 저발현은 세포 증식을 감소시켜 조기 분화를 초래하고 결과적으로 네프론의 수를 감소시킨다[27, 28]. 이 현상은 전구 세포에서 증가된 아폽토시스와 높은 Bim 발현을 특징으로 합니다[27]. 따라서 miRNA는 이러한 후신 1차 세포의 세포자멸사와 증식 사이의 균형을 조절합니다[29].
우리는 알려지지 않은 후성 유전 적 변화와 miRNA 발현 프로파일 링이 다음과 관련이 있다고 가정했습니다.신장모성 단백질 제한 자손의 발달 장애. 따라서 우리는 miRNA의 패턴을 평가하고 태아에서 유전자 발현을 예측하는 것을 목표로했습니다.신장임신 17일(17-DG) 단백질 제한 수컷 새끼를 통해 관련 분자 경로 및 장애 확인신장동안 세포 증식 및 분화신장개발.
키워드:신부전; 신세뇨관; 신장 장애; 신장 발달; 신장
재료 및 방법론
동물과 다이어트실험은 이전에 자세히 설명된 대로 [5, 6] CEMIB/UNICAMP에서 공급한 종에서 유래한 형제 짝짓기 Wistar HanUnib 쥐(250–3{9}} g)의 나이가 일치하는 암컷과 수컷 쥐에 대해 수행되었습니다. , Campinas, SP, 브라질. 환경과 주택은 실험 과정에서 건강과 웰빙을 관리하기 위한 올바른 조건을 제시했습니다. 3주령에 이유 직후, 동물은 수돗물과 표준 실험실 설치류 먹이(Purina Nuvital)에 무료로 접근할 수 있는 제어된 온도(25˚C) 및 조명 조건(07:{11}}–19:00h)에서 유지되었습니다. , Curitiba, PR, Brazil: Na 플러스 함량: 135 ± 3μEq/g, K 플러스 함량: 293 ± 5μEq/g), 번식 전 12주 동안. São Paulo State University의 동물 사용에 관한 기관 윤리 위원회(#{17}}CEUA/UNESP)는 실험 프로토콜을 승인했으며 브라질 동물 실험 대학에서 수립한 일반 지침을 조사 전반에 걸쳐 따랐습니다. 질 도말검사에서 정자가 나타난 날로 임신 1일을 지정하였다. 그런 다음, 어미는 표준 단백질 함량[NP, n=36](단백질 17%) 또는 낮은 단백질 함량[LP, n=51을 갖는 등칼로리 설치류 실험실 사료를 임신 기간 동안 임의로 유지했습니다. ] (단백질 6%). NP 및 LP 모성 식품 소비량은 매일 결정되었고(이후 체중에 대해 정규화됨), 어미의 체중은 두 그룹에서 매주 기록되었습니다. 임신 17일(17-DG)에 ketamine(75mg/kg)과 xylazine(10mg/kg)으로 어미를 마취하고 자궁을 노출시켰다. 태아를 제거하고 즉시 참수로 안락사시켰다. 태아의 무게를 측정하고 꼬리와 팔다리를 채취하여 성별을 구분했습니다. 차세대 시퀀싱(NGS), RT-qPCR 및 면역조직화학 분석을 위해 후신을 수집했습니다.
CISTANCHE는 신장/신부전을 개선할 것입니다
섹스 결정본 연구는 수컷 17-DG 자손만을 대상으로 하였으며 Sry 전통적인 PCR(Polymerase Chain Reaction) 염기서열 분석으로 성별을 결정하였다. DNA는 proteinase K와 Phenol-Chloroform을 이용한 효소적 용해에 의해 추출되었다. 반응을 위해 제조업체의 사이클링 조건과 함께 Master Mix Colorless-Promega가 사용되었습니다. Integrated DNA Technologies(IDT)는 다음 시퀀스에 따라 프라이머를 합성했습니다. 정방향: 5'-TACAGCCTGAGGACATATTA-3'역방향: 5'-GCACTTTAACCCTTCGATTAG-3'.
총 RNA 추출RNA는 NP(n = 4) 및 LP(n = 4) 전체에서 추출되었습니다.신장제조업체가 지정한 지침에 따라 Trizol 시약(Invitrogen)을 사용합니다. 총 RNA 양은 nanoVue 분광광도계(GE Healthcare, USA)를 사용하여 260 nm에서의 흡광도로 측정하였다. RNA Integrity는 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, Germany)를 사용하여 RNA Integrity Number—RIN > 8을 획득함으로써 보장되었습니다[30].
miRNA-Seq 및 데이터 분석시퀀싱은 MiSeq 플랫폼(Illumina)에서 수행되었습니다. 프로토콜은 다음에서 사용할 수 있는 제조업체의 지침을 따랐습니다.간단히 말해서, 시퀀싱은 라이브러리 구축을 포함하며, 이는 1ug total RNA를 사용하였다. 이 단계에서는 어댑터 3'과 5'가 연결됩니다. 어댑터를 연결한 후 역전사 반응을 수행하여 cDNA를 생성했습니다. 그런 다음 샘플 식별을 위한 서열 인덱스를 포함하는 프라이머를 사용하는 표준 PCR 반응에 의해 증폭되었습니다. 이 cDNA 라이브러리는 miRNA 분리를 위해 아가로스 겔 전기영동을 거쳤습니다. 정량화 후, 라이브러리 농도는 10nM Tris-HCl, pH 8.5를 사용하여 2nM으로 정규화되었고, MiSeq Reagent Kit v2(50주기)에 의해 전사체 시퀀싱이 수행되었습니다.
데이터 분석은 Tao Chen, Ph.D.와 공동으로 수행되었습니다. 미국 아칸소 주 제퍼슨에 있는 국립 독성 연구 센터의 유전 및 분자 독성학과에서. miRNA의 NGS(Next Generation Sequencing) 데이터는 FASTA 형식으로 생성되어 BaseSpace.com(Illumina, USA)으로 가져왔습니다. 데이터 품질은 제조사(Illumina)에서 개발한 CASAVA 소프트웨어 기반 호출을 사용하여 평가되었습니다. 분석은 BaseSpace miRNA Analysis(캐나다 토리노 대학교)로 수행되었으며 쥐 게놈에 대한 Small RNA(Illumina, USA)에 의한 서로 다른 miRNA의 서열 매핑을 수행했습니다. Ingenuity Pathway Analysis 소프트웨어(Ingenuity, USA)를 사용하여 차등적으로 발현된 miRNA 연구를 분석했습니다.
miRNA 발현 검증miRNA(miR{0}}p, -144-3p, -298-5p, let-7a{{ 4}}p, -181a-5p, -181c{8}}p 및 -199a{10}}p) 식 분석 간단히 말해서, 제조업체의 지침에 따라 TaqMan1 Micro RNA 역전사 키트를 사용하여 사전 증폭 없이 450ng RNA를 역전사했습니다. 제조업체의 지침에 따라 StepOnePlusTM Real-Time PCR System(Applied BiosystemsTM)에서 TaqMan1 Universal PCR Master Mix, No AmpErase1 UNG(2x)을 사용하여 TaqMan MicroRNA Assays(Life Technologies, USA)를 사용하여 상보적 DNA(cDNA)를 증폭했습니다. 비교 정량화 방법(Pfaffl, 2001)을 사용하여 평가된 상대 유전자 발현을 사용하여 데이터 분석을 수행했습니다. 안정성 분석을 기반으로 U6 snRNA 및 U87 scaRNA를 참조 유전자로 사용했습니다. 모든 상대 정량화는 ΔΔCT 방법을 사용하여 DataAssist 소프트웨어 v 3.0을 사용하여 평가되었습니다. miRNA 데이터는 MIQE 지침에 따라 생성되었습니다[31].
CISTANCHE는 신장/신장 기능을 향상시킵니다.
예측된 표적 유전자의 RT-qPCRcDNA 합성을 위해 High Capacity cDNA 역전사 키트(Life Technologies, USA)를 사용하였다. Bax, Bim, Caspase-3, Collagen 1, GDNF, PCNA, TGF -1, Bcl-2, Bcl{5}}, c-Myc, c에 대한 RT-qPCR 반응 -ret, cyclin A, Map2k2, PRDM1, Six{11}}, Ki{12}}, MTOR, -catenin, ZEB1, ZEB2, NOTCH1 및 IGF1 유전자는 SYBR Green Master Mix(Life Technologies, USA ) IDT1 Integrated DNA Technologies 제공(표 1). 반응은 2μL의 cDNA(1:30으로 희석), 10μL SYBER Green Master Mix(Life Technologies, USA) 및 4μL의 각 특정 프라이머(5nM)를 사용하여 총 20μL의 부피로 수행되었습니다. 증폭 및 검출은 StepOnePlusTM Real-Time PCR System(Applied BiosystemsTM)을 사용하여 수행되었습니다. Ct 값은 GAPDH를 참조 유전자로 정규화한 자손 metanephros 데이터를 사용하여 ΔΔCt 방법을 사용하여 상대 발현 값으로 변환되었습니다[32].
면역조직화학,태아(그룹당 n {{0}})를 제거하고 즉시 4% 파라포름알데히드(0.1M 포스페이트, pH 7.4)에 고정했습니다. 재료를 탈수하고 투명화하고 파라플라스트에 포함시켰고 블록을 5-μm 두께 섹션으로 절단했습니다. 조직학적 절편을 탈파라핀화하고 면역형광 및 면역과산화효소에 대해 처리하였다. 섹션은
차단 용액(8% 소 태아 혈청, 2.5% 소 알부민, 2% PBS 중 탈지 분유)과 함께 배양합니다. 그 후, 1% 탈지유를 함유한 PBS에 희석한 1차 항체(anti-Six-2)로 밤새 냉장 보관합니다. PBS로 세척한 후, 섹션을 실온에서 2시간 동안 1% 우유를 함유하는 동일한 완충액으로 희석한 Alexa 488 형광단에 접합된 특정 이차 항체와 함께 인큐베이션했습니다. PBS로 연속적으로 세척한 후 Vectashield 형광 어셈블리 배지(Vector Laboratories, Inc. Burlingame)를 사용하여 슬라이드를 커버슬립으로 장착했습니다. 표본의 형광은 레이저 공초점 현미경으로 검출했습니다. Focus Imagecorder Plus 시스템을 사용하여 이미지를 얻었습니다. c-Myc, Ki{11}}, Bcl{12}}, TGF{13}}, - catenin, ZEB1, ZEB2, Caspase 3 절단, cyclin A 및 WT1 단백질에 대해 면역 조직 화학을 수행했습니다. 슬라이드를 수화시키고 PBS pH 7.2로 5분간 세척한 후 압력솥에서 citrate buffer pH 6.0으로 25분간 항원을 회복시켰다. 슬라이드를 PBS로 세척했습니다. 이어서, 과산화수소와 메탄올을 이용한 내인성 과산화효소 차단을 암소에서 10분간 수행하였다. 섹션을 PBS로 다시 세척했습니다. 그런 다음 비특이적 결합을 차단하고 슬라이드를 차단 용액(PBS 중 5% 탈지 분유)과 함께 1시간 동안 인큐베이션했습니다. 섹션을 냉장고에서 밤새 1% BSA에 희석한 1차 항체(표 2)와 함께 인큐베이션했습니다. PBS로 세척한 후 상온에서 2시간 동안 특정 2차 항체에 노출시켰다. 슬라이드를 PBS로 세척했습니다. 슬라이스는 DAB(3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride, Sigma-Aldrich CO1, USA)로 밝혀졌습니다. 흐르는 물에 연속적으로 세척한 후, 슬라이드를 헤마톡실린으로 대조염색하고, 탈수하고, Entellan1을 사용하여 커버슬립을 장착했습니다. 이미지는 Axio Observer Z.1 현미경(Carl Zeiss AG, 독일)의 광학현미경(Olympus BX51) 또는 Zeiss LSM 780-NLO 공초점을 사용하여 National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell에서 얻었습니다. 캄피나스 주립대학교 생물학(INFABIC).
형태 정량화파라핀 5μm신장섹션은 현미경(Olympus BX51)의 CellSens Dimension 소프트웨어를 사용하여 분석되었습니다. 그만큼신장연령이 일치하는 NP 자손(n {{4 }}) 다른 어머니로부터. 분석된 각 후신(4NP 및 4LP)의 모든 CM 및 UB를 정량화하고 t-test로 통계 분석을 수행하고 값을 평균 ± SD로 표시했습니다. p.{8}}.05는 유의미한 것으로 간주되었습니다. GraphPad Prism v01 Software, Inc., USA는 통계 분석 및 그림 구성에 사용되었습니다.
통계 분석t-test를 사용하였으며, 그 값은 평균±표준편차(SD)로 표현하였다. P.{1}}.05는 유의미한 것으로 간주되었습니다. GraphPad Prisma v. 01 소프트웨어(GraphPad Software, Inc., USA)는 통계 분석 및 그림 구성에 사용되었습니다.
결과
miRNA-Seq에 의한 miRNA의 발현산모의 저단백과 관련된 microRNA의 변화를 이해하기 위해신장프로그래밍, 우리는 글로벌 miRNA 프로파일링 분석의 표현을 수행했습니다. 44개의 탈조절된 miRNA(p � 0.05)가 확인되었으며, 그 중 19개 및 25개의 miRNA는 각각 상향 또는 하향 조절되었습니다(표 3). Ingenuity Software를 사용하여 상위 발현 miRNA와 그 기능, 경로 및 네트워크를 식별했습니다(표 4).
miRNA 발현 검증LP 그룹의 동물에서 Let{0}}a{1}}p, miR-181a-5p, miR-181c-3p가 상향조절되었고, miR-127-3p, miR-144-3p 및 miR-199a{9}}p는 NP 동물에 비해 하향조절되었습니다. 결과는 두 그룹을 비교할 때 miR{10}} 발현에 어떤 차이도 보이지 않습니다(그림 1). 표 5는 RT-qPCR 검증 데이터로 miRNA를 시퀀싱하여 얻은 값을 보여줍니다. NP 자손에 비해 LP에서 상당한 miRNA 발현 차이가 관찰되었지만 검증된 miRNA의 배수 변화(FC)는 두 기술과 유사했습니다.
miRNA 유전자 표적
LP에서 Six{0}}, Bcl{1}}, PRDM1, cyclin A, PCNA, GDNF, Collagen 1, Caspase 3, Bim과 같은 서로 다른 miRNA의 예측된 표적의 발현 유전자는 NP와 크게 다르지 않았습니다. 태아. 그러나 Bax, TGF -1 Bcl-6, c-ret, Map2k2, Ki{10}}, mTOR, -catenin, ZEB1, ZEB2 및 IGF1 유전자 발현은 {{15 }}연령대조군과 DG LP군 비교. 반대로, c-Myc 및 NOTHC1은 모체 단백질 제한 자손에서 하향 조절되었습니다(그림 2).
태아 체질량 및 후신 형태 측정법17-DG LP 체질량은 연령이 일치하는 NP 자손과 다르지 않았습니다. 그러나 LP의 metanephros mesenchyme은 NP 그룹보다 7.6% 감소된 면적과 29%의 피질 두께 감소를 보였다(그림 3).면역조직화학본 연구에서 LP 태아는 NP 자손에 비해 Six-2 cap 형광이 현저하게 감소(약 69%)되는 것으로 나타났습니다(그림 4).
Six-2 면역과산화효소 분석은 NP 자손과 비교하여 캡 면적에 비해 28% 감소된 Six{3}} 플러스 세포와 관련된 LP CM에서 감소된 세포 수(14%)를 보여주었습니다(그림 4). 본 연구는 또한 NP 자손에 비해 LP에서 c-Myc CM 및 UB 면역염색된 세포의 상당한 퍼센트 감소(14% 미만)를 보여주었습니다(그림 4). 또한 CM에서 Ki{8}} 표지 영역의 비율은 NP 태아에 비해 LP에서 48% 낮았지만 Bcl{10}} 및 절단된 caspase{11}} 면역 반응성은 두 그룹에서 다르지 않았습니다(그림 5 및 6). 본 연구는 또한 NP 자손에 비해 LP에서 c-Myc CM 및 UB 면역염색된 세포의 상당한 퍼센트 감소(14% 미만)를 보여주었습니다(그림 4). 또한 CM에서 Ki{17}} 표지 영역의 비율은 NP 태아에 비해 LP에서 48% 낮았지만 Bcl{19}} 및 절단된 caspase{20}} 면역 반응성은 두 그룹에서 차이가 없었습니다(그림 5 및 6). 반면에 LP에서 CM 및 UB -catenin 표지 영역은 NP 자손에서 사용할 수 있는 영역과 비교하여 각각 154% 및 85% 증가했습니다(그림 7). 동시에 mTOR 면역반응성 분포는 NP 태아보다 LP CM(139%) 및 UB(104%)에서 훨씬 더 광범위한 영역을 차지했습니다(그림 7). LP 자손에서 UBS 세포 염색에서 TGF -1가 증가(약 30%)한 반면, CM에서 면역 염색된 세포는 NP 그룹과 관련하여 차이가 없었습니다(그림 8). CM 핵 세포에 위치한 ZEB1 metanephros-stained는 NP 태아에 비해 LP에서 30% 향상되었습니다(그림 8). 동시에, ZEB2 면역형광은 전체 후신 구조에 존재하지만 두 실험 그룹에서 유사했습니다(그림 8). miRNA 및 mRNA 발현과 단백질을 고려한 현재 연구
논의
신 생성의 세포 및 분자 메커니즘에 대한 지식이 증가했습니다 [33-37]. 그러나 많은 조절 요인과 신호 전달 경로가신장개체발생은 불분명하다[38]. miRNA는 유전자 발현을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다.신장개발 [25, 39–41]. 우리가 아는 한, 모계 LP 섭취 17-DG 수컷 중간엽 세포에서 miRNA 및 mRNA 발현 분석은 수행되지 않았습니다. 우리는 초기 nephrogenesis를 억제하여 nephron의 수를 줄이는 것과 관련된 새로운 분자 메커니즘을 제안합니다. NGS를 사용하여 miRNA 발현을 평가한 결과 NP metanephros와 비교하여 17-DG LP에서 19개의 miRNA가 상향 조절되고 25개가 하향 조절된다는 것을 발견했습니다. 규제 해제된 상위 10개 miRNA 중에서 우리는 증식, 분화 및 세포 사멸과 관련된 생물학적 표적을 가진 7개의 miRNA를 선택했습니다. miRNA-Seq 및 TaqMan 데이터 분석은 대조군 NP 연령 일치 동물에 비해 LP 동물에서 miRNA 발현의 일관되고 구체적인 변화를 보여주었습니다.
miR-181 계열은 4개의 고도로 보존된 구성원, 즉 miR-181a, miR-181b, miR-181c 및 miR-181d [ 42]. 신생물 세포에서 miR{6}}a는 종양 억제인자로 작용하여 세포 증식 및 이동을 억제하고 세포 사멸을 유도합니다[43]. 이 연구에서는 연령이 일치하는 NP 자손에 비해 17-DG LP에서 miR-181a-5p의 발현이 증가된 것으로 나타났습니다. caspase mRNA 발현은 변경되지 않았지만 NP 자손에 비해 LP에서 Bax/Bcl{13}} mRNA 비율이 2배 증가하면 CM에서 증가된 세포자멸사를 암시하며, 이는 세포사멸이 전사 후 조절됨을 나타냅니다. 연구에 따르면 BCL 계열은 미토콘드리아에서 시토크롬 방출을 촉진한 다음 Casp3의 활성화를 억제하여 세포 사멸을 억제하는 것으로 나타났습니다[44]. Li et al. 급성 폐 손상 모델을 사용하여 과발현된 miR{17}}이 감소된 Bcl{18}} 단백질 수준과 관련이 있음을 밝혔습니다. 반대로 miR{19}}억제는 Bcl{20}} 수준을 증가시켰습니다[45]. 이 연구는 miR-181c가 Six-2 발현의 발현과 세포 증식을 부정적으로 조절한다는 것을 입증한 Lv et al.의 결과를 확인했습니다.신장LP 17-DG 자손[25]의 발달.
Xiang et al. 증가된 miR{0}} 발현은신장암이 증식하여 G2/M기가 짧아집니다. 또한 Xiang et al. miR-144의 과발현은 mTOR 유전자와 단백질 발현을 억제하는 것으로 밝혀졌습니다[46]. Nijland et al. mTOR 신호 전달의 증가가 영양 제한을 받은 산모의 배아에서 네프론 수를 결정하는 데 중요하다는 것을 입증했습니다[47]. 라파마이신 복합체 1(mTORC1)의 포유동물 표적은 배아 발달에 필수적입니다. 그러나 이 복합체가 생리적 조건과 환경적 스트레스에서 성장과 자가포식 사이의 균형을 조절하는 방법은 아직 알려지지 않았습니다[48]. 따라서 mTOR 신호전달은 임신 중 LP 섭취에 노출된 동물의 세포 반응에 관여할 수 있습니다. autophagy의 인식, 유도 및 종료; 세포 내 영양소 가용성에 대한 응답으로 [46]. 가설적으로, 심각한 단백질 제한 동안 miR{8}}p의 감소된 발현은 증가된 mTOR 발현과 관련될 수 있으며, {{ 11}}DG LP 자손 Chen et al. miR{12}}을 Bcl{13}}을 통한 세포 노화의 새로운 조절자로 정의했습니다[49]. Panet al. miR{15}} 저발현은 간 세포에서 증가된 세포 증식과 상관관계가 있다고 보고했습니다[50]. 이 연구는 단백질 제한 동물의 CM에서 세포 증식의 감소와 Ki{17}}에 대해 양성으로 표지된 세포의 상당한 감소를 보여주었습니다. 더욱이, 신발생 영역의 감소와 LP 자손의 증식이 관찰되었으며, 이는 Menendez-Castro et al.의 결과와 일치했습니다. 8.4% 단백질 제한 자손에서 [51, 52]. 따라서 17-DG LP 캡에서 감소된 miR-127-3p 발현과 함께 증가된 Ki-67 및 Bcl{26}} mRNA 발현은 분아 증식.
Sun et al. miR{0}}a{1}}p의 과발현은 세포 주기를 제어할 뿐만 아니라 낭포성 세포 증식을 감소시키고 세포자멸사를 유도함을 보여주었습니다[53]. 이 연구에서 miR-199a-5p의 발현은 17-DG LP는 세포 증식 마커인 Ki-67 및 Map2k2의 전사 증가를 동반합니다. LP 17-DG metanephros에서 감소된 Ki{9}} 반응성과 관련이 있습니다. 따라서, 임신 영양 결핍은 전사 후 메커니즘을 통해 분화를 촉진합니다. 특히, 우리의 결과는 배아 줄기 세포 분화 동안 줄기 세포 다능성을 유지하는 EMT 유도제인 아연-손가락 E 상자 결합 호메오박스 1(ZEB1)의 억제 역할을 나타냅니다. -catenin은 ZEB1 발현을 유발하는 핵 ZEB1 전사를 활성화하는 것으로 알려져 있습니다[34]. 가장 잘 연구된 경로 중 하나인 TGF 신호 전달 경로는 배아 발달 동안 EMT를 유도할 수 있습니다. 배아 발달에는 여러 TGF 유사 리간드가 필요합니다. 그러나 EMT에 대한 모든 TGF 매개 효과가 ZEB1/2에 의존하는 것은 아니며, 녹아웃 세포는 중간엽 유전자 fibronectin 및 N-cadherin의 발현을 유도할 수 있습니다. 그러나 E-cadherin은 더 이상 하향 조절되지 않으며 액틴 섬유도 형성됩니다[54]. Karner et al. 동안 보고했다신장개발, Wnt9b/-카테닌
UB와 CM 모두에서 발현되는 신호 전달 경로는 네프론 전구 세포 재생 및 분화에 모두 필요하며, 이는 배발생 동안 네프론 형성에 필수적입니다[55]. 진화적으로 보존된 Wnt9b/-카테닌 경로는 다세포 유기체에서 기관, 조직 및 손상 복구를 개발하는 데 중요한 역할을 합니다. 연구에 따르면 c-Myc는 α-카테닌의 전사 표적으로, α-카테닌의 증식과 분화를 조절합니다.신장관상 상피[56]. 연구 기간 동안 유전자 및 단백질 수준에서 -카테닌의 발현이 증가했습니다.신장17-DG LP 태아의 발달. Panet al. Myc는 -catenin과 협력하여 네프론 전구 세포의 재생을 촉진한다고 보고했습니다[10]. 여기에서 연령 일치 NP 자손과 비교하여 LP는 c-Myc 발현이 더 낮았습니다. 따라서 이러한 동물은 증식과 생존에 필요한 재생 가능한 세포의 예비량이 더 적을 수 있으며 LP 모델에서 더 적은 수의 네프론을 반영할 수 있습니다. 더구나,
Wnt/-카테닌 및 Notch 신호 경로는 Six-2 발현 조절을 조정할 수 있으며 네프론 전구 세포에서 Six{2}} 발현 하향 조절에 관여합니다. 연구에 따르면 Six-2 발현과 CM 전구 세포를 미분화 상태로 유지하려면 낮은 수준의 -카테닌이 필요할 수 있습니다. 또한 카테닌 수치가 높아지면 네프론 전구 세포의 운명이 결정됩니다[57, 58]. 따라서, 우리는 감소된 cMyc 및 Notch 신호 전달과 함께 α-카테닌 발현 증가, 17-DG LP 자손에서 Six-2 발현 28% 감소, 초기 CM 세포 분화 및 줄기 세포 감소와 상관관계가 있다고 가정합니다. 성인기의 네프론 수. 또한, 우리의 데이터는 LP 자손 MM 세포에서 Let{12}}a{13}}p 및 -catenin 발현 증가와 Notch 신호 감소가 c-Myc, Six{16}}, 및 Ki{17}} 발현으로 인해 전구 세포의 자가 재생이 감소합니다. 남아있는 CM 전구 세포의 고갈은 네프론 수의 감소와 동맥 고혈압의 발병으로 이어집니다.신장성인기의 장애(그림 10). Boivin et al.의 결과와 일치하게, 우리의 결과는 증가된 CM-카테닌이 UB 성장과 신생식을 방해한다는 것을 나타냅니다[59]. 연구에 따르면 UB 성장의 중요한 조절자인 성장 인자 신경교 유래 신경영양 인자(GDNF)가 c-Ret 티로신 키나제 수용체와 Gfra1 공동 수용체를 통해 신호를 보내는 것으로 나타났습니다[60, 61]. 17-DG LP 자손에서 상당한
c-Ret 수용체 코딩 mRNA의 증가는 이론적으로 UB 성장의 증가로 이어질 것입니다. 그러나 이 연구에서 GDNF 발현은 변하지 않았으며, 이는 cRet mRNA의 증가에도 불구하고 UB 분지가 감소되었음을 시사합니다. 이전에 우리는 임신성 단백질 제한 14.5일 후 요관 새싹 가지의 28.3% 감소를 관찰했으며[4], 이는 GDNF의 변화가 없음에도 불구하고 MM 세포의 Six{7}} 표지의 28% 감소와 관련될 수 있습니다. 전사. -catenin은 아마도 c-ret 수용체와 상호작용하고 UB 세포의 핵으로 이동하여 상피 세포에서 TGF -1 발현을 촉진하고 UB 분지를 억제하며 CM 전구 세포의 조기 분화를 유발합니다({{11} }DG LP 자손 [62–64]. 따라서 GDNF는 요관 봉오리에 대한 중간엽 신호를 매개하는 데 필수적이지 않을 수 있습니다. 그러나 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았습니다. 실제로, 우리는 17-DG LP 자손의 MM이 Let{15}} miRNA 발현의 특정 증가를 나타내어신장발달, 이에 의해 신발생의 발달 타이밍에서 이들 유전자의 조절 역할을 확인한다[65].
초기 인슐린 유사 성장 인자(IGF) 연구에서 태아 성장에서 IGF-1 및 -2의 주된 역할은 풍부하지만 대부분 간접적인 증거에 의해 설명되었습니다. IGF는 배양된 태아 세포와 착상 전 배아에서 증식 및 분화 인자로 작용하는 것으로 밝혀졌습니다. 또한, IGF는 배양된 태아 세포 및 체외 이식편에서 분비되는 것으로 밝혀졌습니다[66]. IGF를 포함한 성장 인자는 부분적 또는 전체 상피-중간엽 전이를 일으킬 수 있습니다. IGF 경로의 활성화는 ZEB1 발현을 유도함으로써 EMT의 상향 조절을 초래한다[67]. 여러 후보 성장 요인이 관련되어 있지만신장발달, 그들이 신 생성에 관여하는지 여부는 알려져 있지 않습니다. 다른 시기에 다른 성장 인자가 필요할 수 있습니다. 이러한 맥락에서 일부 성장 요인은 중복될 수 있습니다. 배아 발달 동안 EMT와 MET의 순차적 라운드는 특수화된 세포 유형을 차별화하고 3차원 구조를 생성하는 데 필요합니다. 이 연구에서 중간엽-상피 상호전환성은 세포 가소성을 유지하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 배아에 대한 LP 조건에서 고도로 유도 가능한 시스템의 존재를 시사합니다. Let{2}} miRNA 계열의 발현은 다양한 태아 조직에서 광범위하게 연구되었습니다. Let{3}} miRNA 발현의 증가는 증식 감소 및 MM 세포 분화의 조기 증가, 결과적으로 네프론 수 감소와 관련이 있습니다[27, 15, 68-71]. Higher Let{8}} 발현은 설치류에서 대뇌 배아 발생의 마지막 단계 동안 고등 유기체에서 입증되었습니다[72, 73]. Nagalakshmi et al. Let{11}} miRNA 발현이 UB 상피 세포 운명을 전구체에서 분화된 상태로 변화시키는 것으로 밝혀졌습니다[71]. 대조적으로, Yermalovich et al. RNA 결합 단백질인 Lin28b의 과발현이 억제성 Let{15}} miRNA와 관련이 있음을 보여주었습니다. lin28과 Let{17}}은 무척추 동물의 개체 발생 시기 조절자로 알려져 있지만 포유류 기관 발달에서 이들의 역할은 이해되지 않습니다[65]. 이 연구에서 LP 태아에서 Let{19}}a{20}}p miRNA 발현의 증가는 감소된 CM 세포 증식과 관련되어 NP 그룹에 비해 신생합성을 손상시킬 수 있습니다. 따라서 우리는 17-DG LP에서 Lin28b의 일시적인 감소된 발현을 통해 CM 세포 증식 억제 및 증가된 Let{21}} miRNA에 의한 신생식의 조기 중단이 직간접적으로 발생할 수 있다고 가정합니다. 이 효과는신장17-DG LP의 발달은 이 유전자가 신생 동안의 발달 시기를 조절한다는 것을 확인시켜줍니다. 이 연구에서 Let{1}}a{2}}p miRNA 발현의 증가는 c-Myc 발현의 감소와 일치합니다. Myc는 증식, 성장, 세포 사멸 및 세포 분화에 관여합니다.신장기관 형성 [74-76]. LP 17-DG 자손에서 MM c-Myc 유전자 발현이 감소되었고 CM c-Myc 면역반응 영역은 NP 자손에 비해 14% 더 작았습니다. 동시에 CM 세포 수의 14% 감소는 NP 자손에 비해 LP의 Ki{8}} 면역 반응성을 48% 감소시키는 것으로 관찰되었습니다. 일관되게 연구에 따르면 c-Myc는 UB 분기의 마지막 단계와 CM 전구 세포 증식을 자극하는 데 중요한 역할을 합니다[74].
CISTANCHE는 신장/신장 감염을 개선할 것입니다
줄기 세포의 수준을 감소시켜 미분화 상태로 유지합니다. 그러나 이 연구에서 CM에서 Let{0}}a{1}}p miRNA의 강력한 발현은 c-Myc 발현을 하향 조절하여 LP 17-DG에서 전구 세포 증식과 초기 세포 분화를 감소시켰습니다. 자손(그림 10). 에 대한 연구신장의 c-Myc 형질전환 마우스에서 감소된 줄기 세포 증식과 관련된 c-Myc 및 S-ix{3}} 면역양성 CM 세포의 동시 감소가 밝혀졌습니다[74]. 이 연구는 6개의-2 양성 세포가 현저하게(28%) 감소하는 것을 보여줍니다.신장NP 자손에 비해 17-DG LP 자손의 CM에서 관찰된 네프론 수의 감소와 같은 줄기 세포 마커. 2009년 Fogelgren et al. 여섯-2 유전자 발현이 감소된 네프론 수, 고혈압 및 만성 질환과 관련이 있을 때 태아 발생 동안 감소됨을 입증했습니다.신부전[77]. 따라서, CM 전구 세포에서 감소된 Six{1}} 유전자 발현은 동안 신호 유도 분화의 억제를 나타냅니다.신장17-DG LP 자손의 발달. 그럼에도 불구하고 중복성은 주의해서 사용해야 합니다. 신생의 미묘한 결함은 더 자세한 분석을 통해 또는 다른 조건에서 분명해질 수 있습니다. IGF1 mRNA 수준은 후신 발달의 초기 기간 동안 가장 높았고, 전사체는 MM 전체에서 검출되는 반면, 그 수준은 추가 발달 동안 감소했습니다. 그러나 동안신장배발생, 네프론 촉진 성장 인자(IGF1)와 억제 성장 인자(TGF -1) 사이의 섬세한 균형이 UB 분지를 조절합니다.
결론
여러 저자들이 신생합성을 연구했지만[34, 37, 78], 네프론 수를 결정하는 메커니즘에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 이 연구는 많은 MM 전구 세포 miRNA, mRNA 및 단백질이 17-DG LP 자손에서 변경되어 증식 감소 및 초기 세포 분화로 이어진다는 것을 보여줍니다(그림 11). 네프론 전구 세포 재생과 분화 사이의 이러한 섬세한 균형은 다음을 위해 필수적입니다.신장충분한 수의 네프론을 달성하지 못하는 것이 만성 질환의 위험 요소이기 때문에 발달신장무질서.
