인간 내장 및 피부 레슈마니아증에 대한 교차 면역을 활용하는 새로운 다가 다중 하위 단위 펩티드 백신의 In Silico 설계: 면역정보학 기반 접근 방식
Sep 20, 2023
추상적인
맥락 레슈마니아증은 많은 열대 및 아열대 국가에 풍토병이 있는 20종 이상의 병원성 레슈마니아 종에 의해 발생하는 매개체 매개 감염성 질환 그룹입니다. 약물 내성 균주의 출현, 항리슈만편모충 약물의 부작용, 예방 백신 전략의 부재로 인해 민감한 인구 집단이 위협을 받고 있습니다. 최근 많은 연구자 그룹이 역백신학 분야를 활용하여 백신을 개발했으며 주로 내장 또는 피부 레슈마니아증에 대한 면역 유도에 중점을 두고 있습니다.
행동 양식이 현재 작업에는 UniProt 데이터베이스에서 실험적으로 검증된 12개의 리슈마니아 항원 단백질 서열을 검색한 다음 ANTIGENpro 및 Vaxijen 2.0 서버를 사용하여 항원성 프로파일링을 수행하는 작업이 포함됩니다. 이에 대한 MHC 결합 에피토프는 NetCTL 1.2 및 SYFPEITHI 서버를 모두 사용하여 예측한 반면, B 세포에 대한 에피토프는 ABCpred 및 BepiPred 2.0 서버를 사용하여 계산했습니다. 상당히 높은 점수를 갖는 스크리닝된 에피토프는 적절한 링커 및 천연 보조제를 포함하는 백신 구성체를 설계하는 데 활용되었습니다. 합성 펩타이드의 2차 및 3차 구조는 조건부 무작위 필드, 얕은 신경망 및 반복 구조 조립 시뮬레이션을 통한 프로파일-프로파일 스레딩 정렬에 의해 각각 결정되었습니다. 3-D 백신 모델은 CASP10- 테스트를 거친 개선 사항과 MolProbity 웹 서버를 통해 검증되었습니다. 최고의 백신-TLR 복합체를 분석하기 위해 분자 도킹 및 다중 규모 일반 모드 분석 시뮬레이션을 수행했습니다. 마지막으로, 전산 면역 시뮬레이션 결과는 유망한 세포 및 체액 면역 반응을 보여주었으며, 이는 조작된 키메라 펩타이드가 내장 및 피부 레슈마니아증에 대한 잠재적인 광범위한 스펙트럼 백신임을 시사합니다.
남성의 면역체계 강화를 위한 시스탄체의 효능
키워드 레슈마니아증 · 역백신학 · TLR · 다중 에피토프 백신 · 분자 역학 시뮬레이션 · 상동성 모델링
소개
레슈마니아증은 이형 세포내 기생 원생동물인 레슈마니아 속의 다양한 구성원에 의해 발생하는 기생충 질병의 일종입니다[1]. 레슈마니아증은 전 세계적으로 열대 및 아열대 국가의 낮은 사회경제적 지위에 있는 대부분의 인구에게 영향을 미칩니다[2]. 벡터 매개 질병으로, 감염된 암컷 플레보토민 모래파리를 물면 기생충이 전염됩니다(WHO, 2019). 세계보건기구(WHO)의 최신 보고서에 따르면 매년 700명 000~100만 명의 새로운 사례와 약 26~000~65명 000명의 사망이 발생합니다(WHO, 2019). 동아프리카에서는 내장 레슈마니아증이 자주 발생합니다. 동부 지중해 지역은 전 세계 피부 레슈마니아증 사례의 70%를 차지합니다(WHO, 2019). 2017년 WHO에 보고된 신규 사례 22,145건 중 20,792건(94%)이 브라질, 에티오피아, 인도, 케냐, 소말리아, 남수단, 수단 등 7개국에서 발생했습니다(WHO, 2017). 우려되는 상황으로 인해 우리나라에서도 질병을 통제하고 근절하기 위한 조치가 강조되어야 합니다. 리슈마니아증에는 다양한 임상 증상이 있으며, 이 질병에는 내장(칼라자르라고도 알려져 있으며 이 질병의 가장 심각한 형태), 피부(가장 흔함), 피부 점막(WHO, 2019)의 세 가지 기본 형태가 있습니다. . 피부 레슈마니아증(CL)의 일부 사례에서 자가 치료의 증거와 그에 따른 재감염에 대한 면역력은 일정 기간 동안 레슈마니아증을 제어할 수 있는 실행 가능한 방법으로 백신 접종의 가능한 범위를 추론합니다[3]. 그러나 현재까지 인간 레슈마니아증에 대해 허가된 백신은 없습니다. 몇 가지 잠재적인 후보 백신이 임상 시험에 진출했지만, 많은 백신이 아직 초기 연구 개발 단계에 있습니다[4]. 펩타이드 백신의 생성은 이 분야에서 가장 중요하고 유망한 연구 분야입니다. 살아있는 기생충이나 약독화된 기생충 또는 그 하위 단위 기반 백신과 달리 합성 펩타이드는 잠재적으로 유해한 물질이 없고, 항원 복잡성이 낮고, 안정성이 좋으며, 확장 비용이 저렴하다는 등 여러 가지 장점을 가지고 있습니다[1, 5]. 새로운 백신을 개발하려면 면역학, 분자생물학, 화학공학에 대한 더 깊은 통찰력이 필요합니다. 따라서 이 모든 분야의 과학자들은 안전하고 효과적인 백신을 설계하고 생산하기 위해 협력하고 있습니다[6]. 레슈마니아증에 대한 이상적인 백신은 오래 지속되는 면역력과 균형 잡힌 TH{35}} 및 TH{36}} 매개 면역 반응을 이끌어내야 합니다[4, 7]. 이러한 새로운 후보 백신을 설계하기 위한 면역정보학 기반 접근 방식은 주로 컴퓨터 도구를 사용하여 구조적으로 안정적이고 면역원성이 있는 다중 하위 단위 펩타이드 백신을 짧은 시간 내에 예측하는 새로운 전략입니다. 실험 동물 모델이나 기타 in silico 분석을 포함하는 이전 면역학 연구에서 질병에 대한 면역성을 부여하기 위해 필수적인 면역원성 특징을 갖는 것으로 주로 밝혀진 단백질이 가능한 가장 좋은 에피토프 후보였습니다[1, 8-10]. 연구 중인 단백질 중 LACK(리슈마니아 활성화 C-키나제 항원) 단백질은 레슈마니아 종 전반에 걸쳐 고도로 보존된 단백질이며 인간 레슈마니아증에 대한 실행 가능한 백신 후보로 간주됩니다[11]. 이는 민감한 BAL b/c 마우스에서 면역 반응의 주요 표적임이 입증되었습니다[12]. KMP-11(운동질체 막 단백질-11)은 모든 운동질체 원생동물에 존재하며 또한 쥐 모델에서 IL{50}} 수준을 증가시켜 면역원성을 나타내는 잠재적인 백신 후보로 간주됩니다. [13]. Leishmanolysin 또는 GP63은 기생충과 숙주 대식세포 수용체의 직접적인 상호작용에 관여하는 독성 인자로 가정되는 표면 단백질분해효소입니다[14]. 막 단백질 LCR1과 GP46도 IFN-감마 생산을 증가시키는 것으로 밝혀져 레슈마니아 감염에 대한 일반적인 백신 개발에 도움이 되는 것으로 간주됩니다[5, 15]. 열 충격 단백질(HSP)은 적응 면역의 MHC-I 및 MHCII 경로 모두를 유도하는 데 고도로 면역원성을 갖고 감염성 레슈마니아증에 대한 백신 개발에 적절한 역할을 하는 것으로 생각되는 고도로 보존된 분자입니다[16]. 리슈만편모충 친수성 아실화 표면 단백질-B(HASP-B)는 감염성 기생충에서만 발현되며, 이는 기생충 독성의 역할을 암시하므로 잠재적인 백신 후보가 될 수 있습니다[17]. Kinetoplastid parafagellarrod(PFR) 단백질은 또한 제한된 진화 분포, 고차 조직 및 높은 면역원성으로 인해 치료 및 예방에 중요합니다. 마찬가지로 시스테인 프로테아제와 프로테오포스포글리칸도 포유류 숙주의 기생충에 대한 필수 병독성 인자로 작용하며 레슈마니아증에 대한 매력적인 약물 표적입니다[19-21]. 더욱이, 베타-튜불린 단백질은 이전에 Leishmania의 T 세포 자극 항원으로 특성화되었지만 백신 후보로서의 효능은 아직 시도되지 않았습니다 [22]. L. donovani의 베타-튜불린은 또한 내장 레슈마니아증에 대한 잠재적인 약물 표적으로 간주됩니다[23]. 마지막으로, L. braziliensis의 번역 인자 단백질 eIF5A는 다른 재조합 단백질과 함께 백신으로 투여할 때 동물에서 레슈마니아증에 대한 이종 보호를 유도하는 것으로 나타났습니다. 백신을 접종한 동물에서 기생충 특이적 사이토카인의 분비를 증가시킵니다. eIF5A 단백질은 모든 진핵생물에서도 보존됩니다[24]. 이전에는 Khatoon et al. L. donovani의 분비 단백질을 탐색하여 내장 레슈마니아증(VL)에 대한 다중 하위 단위 펩티드 백신을 설계하는 면역정보 기반 접근 방식을 설명했습니다[6]. 여기에서 우리는 기생충의 다양한 감염성 종에 걸쳐 다양한 레슈마니아 항원을 선택했습니다. 동시에, 이러한 모든 단백질은 면역 반응을 유발하여 보호 면역을 유발하는 것으로 이미 확인되었습니다(체외 동물 연구 또는 컴퓨터 도구 활용). 선택된 단백질 서열은 레슈마니아 메이저(Leishmania major), 레슈마니아 멕시카나(Leishmania Mexicana), 레슈마니아 도노바니(Leishmania donovani), 레슈마니아 차가시(Leishmania chagasi), 리슈마니아 아마존(Leishmania amazons) 등 5가지 병원성 종 중 하나에 속하며, 그중 L. donovani는 내장 레슈마니아증(VL)을 일으키는 주요 기생충입니다. 다른 것들은 주로 피부(CL) 또는 점막피부 레슈마니아증(MCL)을 유발하는 원인이 됩니다. 서로 다른 레슈마니아 종에 걸쳐 이렇게 다양한 유형의 보존된 면역원성 단백질을 선택하는 근거는 일반적으로 인간에게 영향을 미치는 두 가지 레슈마니아증 형태(VL 및 CL)에 대해 광범위한 교차 면역성을 부여하는 일반 펩티드 백신을 설계하는 것이었습니다. .
시스탄체 허브의 기능은 무엇입니까? - 안티-염증성
재료 및 방법
레슈마니아 항원 단백질 서열의 선택 및 검색
12개의 레슈마니아 특이적 항원 단백질의 전체 아미노산 서열은 Uniprot(Universal Protein Resource) 데이터베이스(https://www.uniprot.org/uniprot/)에서 FASTA 형식(21일에 액세스)으로 검색되었습니다.{{16} }2022년 3월). 앞서 언급한 바와 같이, 이러한 모든 단백질은 동물 모델이나 전산 in silico 예측 방법을 포함하는 이전 면역학 연구에서 발견된 바와 같이 면역원성이고 고도로 보존되었으며 잠재적인 백신 후보로 보고되었습니다. 선택된 단백질의 항원성은 10배로 검증된 SVM 기반 2단계 분류기를 이용하여 입력 단백질 서열의 항원성을 계산하는 ANTIGENpro 서버(http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/)를 사용하여 계산되었습니다. 교차 검증 접근법 [25]. 그런 다음 전통적인 분비 단백질과 비분비 단백질(막횡단)을 구별하기 위해 SignalP 4.1 서버(SignalP - 4.1 - Services - DTU Health Tech)를 사용하여 단백질에 신호 펩티드 분석을 실시했습니다. 이 방법은 여러 인공 신경망의 조합을 기반으로 절단 부위 예측과 신호 펩타이드/비신호 펩타이드 예측을 통합합니다[26]. 다음으로 모든 단백질에 대한 위치 예측은 심층 신경망을 사용하여 서열 정보만 활용하여 단백질 세포내 위치를 예측하는 템플릿 없는 알고리즘인 DeepLoc(DeepLoc—1.0—Services—DTU Health Tech)을 사용하여 수행되어 좋은 정확도를 달성했습니다[27]. 다음으로 SignalP 4.1 서버에서 얻은 모든 기능성 단백질 서열을 사용하여 B 및 T 세포 수용체에 의해 인식될 항원 결정기(에피토프)의 존재를 예측했습니다. 이는 설계된 백신 구성물에 면역 우세 T 세포 및 B 세포 에피토프만 포함되어 체액성 및 세포 매개 면역 메커니즘 경로를 모두 포함하는 효율적인 면역 반응을 유도할 수 있도록 하기 위해 수행되었습니다.
세포독성 T 림프구(CTL) 에피토프 예측
세포독성 T 림프구(CTL) 에피토프의 예측은 이상적인 펩타이드를 설계하는 데 필수적인 측면입니다[28]. 자유롭게 액세스할 수 있는 웹 서버, 즉 NetCTL1.2(https://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL)를 사용하여 선택된 모든 단백질에 대한 CTL 에피토프를 예측했습니다. 이 방법은 펩타이드 MHC 클래스 I 결합, 프로테아좀 C 말단 절단 및 TAP 수송 효율의 예측을 통합하며, 이는 모두 CTL 결합 에피토프 시퀀스가 보유해야 하는 필수 기능입니다. 서버는 12개의 MHC 클래스 I 수퍼타입으로 제한된 CTL 에피토프의 예측을 허용하며, 그 중 A1 수퍼타입만 현재 연구에 사용되었습니다. MHC 클래스 I 결합 및 프로테아솜 절단은 인공 신경망을 사용하여 수행됩니다. TAP 전송 효율은 가중치 행렬을 사용하여 예측됩니다[29]. 결합 점수가 더 높은 서열은 강력한 CTL 에피토프로 간주됩니다. NetCTL 1.2 외에도 공개적으로 사용 가능한 또 다른 웹 서버 기반 접근 방식인 SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)도 CTL 에피토프 예측에 사용되었습니다. 선택된 모든 레슈마니아 단백질. 예측은 발표된 모티프를 기반으로 하며 앵커 및 보조 앵커 위치의 아미노산과 기타 빈번한 아미노산을 고려합니다[30]. 이 서버에서 제공하는 MHC 유형 목록에서 HLA-A*01, HLA-A*02:01 및 HLA-A*03이 예측을 위해 선택되었습니다. NetCTL 1.2 서버에서 제공한 결과와의 균일한 비교를 위해 에피토프 검색은 비이름 시퀀스에 대해 지정되었습니다. NetCTL 1.2와 SYFPEITHI 서버 모두에서 호환 가능한 더 높은 점수로 예측한 각 단백질(있는 경우)의 공통 에피토프만 최종 백신 구성으로 선택되었습니다.
헬퍼 T 림프구(HTL) 에피토프 예측
헬퍼 T 림프구는 모든 유형의 적응 면역 반응에 필요하기 때문에 가장 중요한 면역 세포입니다. 따라서 HTL 에피토프(주로 Th{0}} 유형)의 예측은 효과적인 펩타이드 백신을 설계하는 데 필수적인 요소가 됩니다. 본 연구에서는 15-mer HTL 예측을 위해 IEDB(Immuno Epitope Datan base and Analysis) 서버(http://tools.iedb.org/mhcii/)의 MHC-II 바인딩 분석 도구를 사용했습니다. 3개의 인간 대립유전자 세트, 즉 HLA-DRB1*01:01, HLADRB1*01:02 및 HLA-DRB1*01:03에 대한 에피토프. 백신이 인간 레슈마니아증에 대해 설계되었으므로 에피토프의 MHC-II 결합 친화도를 보다 현실적으로 평가하기 위해 인간 HLA 대립유전자를 선택했습니다. 예상 출력은 조합 라이브러리 및 SMM 정렬에 대해 IC50nM 단위로 제공됩니다. 따라서 숫자가 낮을수록 선호도가 높다는 의미입니다. IEDB 권장 예측 방법은 낮은 조정 순위가 적합한 MHC-II 결합제를 나타내며 따라서 강력한 HTL 에피토프로 정의될 수 있는 이 접근 방식에 사용되었습니다.
사이토카인 유도 HT 에피토프의 식별 및 선택
사이토카인은 면역 체계의 적절한 기능을 위해 매우 중요합니다. IL-2, IL-4, IL-6 및 인터페론과 같은 사이토카인 배터리는 CTL 매개 및 체액성 면역 반응을 모두 유도할 수 있습니다[31]. 따라서 사이토카인 생산을 유발할 수 있는 HTL 에피토프는 면역 예방 백신 설계에 바람직합니다. 이러한 관점에서 IFNepitope 서버(http://crdd.osdd.net/raghava/ifnepitope/)는 사이토카인 유도 능력이 있는 HTL 에피토프를 식별하는 데 사용되었습니다. IFNepitope는 CD4+ T 세포에서 분비되는 IFN-gamma를 유도할 수 있는 단백질 서열로부터 펩타이드를 예측하는 것을 목표로 하는 온라인 예측 서버입니다. 웹 서버는 IFN 감마 유도 및 비 유도 MHC 클래스 II 바인더로 구성된 데이터 세트를 기반으로 개발되었습니다[32]. MHC-II 결합 친화도가 더 높은(낮은 조정 순위) IEDB 서버에 의해 예측된 HTL 에피토프는 IFNepitope 서버에 의한 사이토카인 생산 능력을 확인하기 위한 입력으로 제공되었습니다. 이렇게 식별된 에피토프는 IL4pred 서버(IFNepitope(iiitd.edu.in) 및 IL10Pred 서버(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/il10pred/predict3)를 통해 다음 수준의 분석을 거쳤습니다. .php) 선택된 HTL 에피토프가 각각 IL-4 및 IL-10의 분비를 유발하는지 확인하기 위해 그들은 또한 아미노산 잔기의 위치 보존과 에피토프의 아미노산 조성을 고려합니다. 보다 정확한 예측을 위한 펩타이드[33, 34] 세 서버 모두에서 양성일 것으로 예측된 MHC-II 결합 HTL 에피토프를 최종 백신 구성체에 포함시키기 위해 선택했습니다. 다양한 사이토카인(IFN-감마, IL-4 및 IL-10)과 관련된 강렬한 반응으로 인해 면역이 가속화되고 오래 지속됩니다.
에피토프 보존 분석
Epitope conservation analysis becomes essential to check whether the chosen epitope(s) is conserved across different species of Leishmania proteins. Designing a subunit vaccine consisting of conserved epitopes offers a promising scope for broad-spectrum protective immunity against leishmaniasis. Conservation analysis for each of the selected CTL and HTL epitopes was done by using the IEDB "Epitope Conservation Analysis" tool available within the IEDB portal (http://tools.iedb.org/conservancy/). This tool calculates the degree of conservation of the target epitope (e) within a set of homologous protein sequences (P) as the fraction of {p} that matched the aligned e above the chosen identity level while considering that the target epitope is sequential [35]. Firstly, the corresponding source proteins from which the CTL and HTL epitopes were finally selected were subjected to a BLAST search, for which we used the Uniprot BLAST tool (https://www.uniprot.org/blast/). From the BLAST result, the aligned protein sequences (belonging to the genus Leishmania) that showed significantly high similarity with the query sequence (>40%) were selected. Such sequences were compiled to constitute an epitope-specific dataset, and the same was provided as the input set of proteins (P) to be used for conservation analysis by the tool. Next, the sequences for selected CTL and HTL epitopes were screened individually against their respective datasets that revealed the relative conservation of the epitopes across a set of related Leishmania proteins. The threshold identity level was set at>100%(기본값).
다중 에피토프 백신 서열 설계
면역정보학적 분석에 기초하여, 선택된 CTL 및 HTL 에피토프 서열을 통합하여 서브유닛 백신의 1차 서열을 구축하였다. 이들 에피토프는 각각 AAY 및 GPGPG 링커에 의해 함께 연결되었습니다[28, 31]. 백신 구조물의 효율적인 기능에 필요한 개별 에피토프의 적절한 분리를 위해 링커가 삽입됩니다[28, 36]. 둘째, 면역반응을 강화하기 위해서는 서브유닛 백신에 적절한 보조제를 첨가하는 것이 중요하다[31]. 적합한 보조제의 선택은 인간 실험을 위한 백신을 설계하는 데 있어 매우 중요합니다. 다양한 면역 세포에서 생산되는 IL-12는 리슈마니아증에 대한 세포 매개 면역을 발달시키는 데 필수적이며, 리슈마니아증에 대한 백신의 보조제로서 IL-12의 잠재력이 쥐 모델에서 보고되었습니다[3, 37, 38]. 이 IL-12은 백신 설계를 위한 면역보조제로 선정되었으며, EAAK 링커를 사용하여 백신 구조물의 N 말단에 동일한 서열을 포함시켰다[28, 31]. 인간 IL-12 알파 사슬의 서열은 Uniprot 데이터베이스(www.uniprot.org; Accession No. P29459)에서 검색되었습니다. 마지막으로, N 말단에서 C 말단으로 이동하는 순서로 아주반트, 링커, CTL 에피토프 및 HTL 에피토프(에피토프 내 AAY 및 GPGPG 링커 포함)를 갖는 펩티드 백신 구조물을 얻었다.
구조적 및 선형 B 세포 에피토프 예측
체액성 면역은 활성화된 B 세포에 의한 특정 항체의 합성 및 분비를 포함하며, 이는 B 림프구 표면에 존재하는 B 세포 수용체에 의해 인식되는 항원 결정자의 존재를 필요로 합니다. 이상적인 면역 보호 펩타이드 백신은 B 세포와 상호 작용하여 자극하기 위해 이러한 구성 요소를 가져야 합니다. 따라서 설계된 백신의 1차 서열에서 B 세포 에피토프의 정확한 예측을 위해 두 개의 서버, 즉 ABCpred 및 BepiPred 2.0가 적용되었습니다. ABCpred 서버(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abbcpred/ABC_submission.html)는 인공 신경망(ANN) 기반 접근 방식으로, 다음을 사용하여 주어진 항원 서열에서 B 세포 에피토프를 예측합니다. 고정 길이 매개변수. 이 방법에 사용된 훈련 데이터세트에는 B 세포 에피토프 데이터베이스(BCIPEP)의 B 세포 에피토프가 포함되어 있습니다. 서버는 순환 신경망을 사용하여 65.93% 정확도로 에피토프를 예측할 수 있습니다[39]. 최종 백신 구성체의 1차 서열은 일반 형식의 입력으로 제공되었으며, 창 길이가 16개 아미노산 잔기인 0.51의 임계값을 포함한 ABCpred 서버 기본 매개변수가 사용되었습니다. 예측. 반면, BepiPred 2.0 서버(BepiPred—2.0—Services—DTU Health Tech)는 에피토프에 대해 훈련된 랜덤 포레스트 알고리즘을 통해 입력 시퀀스에서 순차적 B 세포 에피토프를 예측하고 결정 구조로부터 비에피토프 아미노산을 결정한 후 순차적 예측 평활화를 수행합니다[40]. 백신의 1차 서열은 FASTA 형식으로 입력으로 제공되었습니다. 두 개의 서로 다른 알고리즘을 기반으로 B 세포 에피토프를 예측하는 두 개의 서로 다른 서버를 적용하면 예측이 더욱 현실화됩니다. B 세포 수용체와 항체에 의해 인식되는 대부분의 항원 결정자는 불연속적입니다. 즉, 면역원의 1차 구조에서 멀리 떨어져 있는 아미노산 잔기를 포함하지만 단백질이 접히는 동안 서로 인접하게 됩니다[41]. 검증된 백신의 3차 구조에서 이러한 불연속 B 세포 에피토프의 예측은 IEDB 포털 내에 통합된 ElliPro 서버(http://tools.iedb.org/ellip ro/)를 활용하여 수행되었습니다. ElliPro는 수정된 Thronton 방법을 구현하고 C 원자가 아닌 각 잔류물의 질량 중심을 고려하는 자유롭게 액세스할 수 있는 웹 도구입니다. 그렇게 하면 각 에피토프를 에피토프 잔기에 대한 평균을 낸 PI(돌출 지수)로 정의된 할당된 점수와 관련됩니다. 불연속 에피토프는 각각의 PI 값을 기준으로 결정되고 잔류물의 질량 중심(R) 사이의 거리를 기준으로 클러스터링됩니다. R 값이 클수록 예측되는 더 중요한 불연속 에피토프와 상관관계가 있습니다[42]. 동시에 ElliPro를 사용하면 입력 단백질 모델의 선형 B 세포 에피토프도 예측하고 시각화할 수 있습니다. 백신의 정제된 3D 모델에서 선형 및 불연속 B 세포 에피토프를 모두 검출하면 성공적인 백신 설계 전략이 보장됩니다.
백신 구조의 항원성, 알레르기성 및 독성에 대한 프로파일링
항원성은 면역예방백신의 필수 기준이다. 설계된 백신 구성체가 B 및 T 세포 수용체와 상호작용하여 장기간 지속되는 면역 반응을 유도하는지 확인하기 위해 ANTIGENpro 및 VaxiJen 2.0 서버를 사용하여 동일물의 항원성을 평가했습니다. ANTIGENpro(http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/) 서버는 단백질 마이크로어레이 데이터 세트만 사용하여 훈련할 때 알려진 보호 항원의 82%를 올바르게 분류합니다. 결합된 데이터 세트의 정확도는 항원성 펩타이드를 훨씬 더 잘 인식할 수 있는 10배 교차 검증 실험을 통해 76%로 추정됩니다. 이는 SVM 기반 2단계 분류기를 포함한 2단계 아키텍처에서 실행됩니다. 새로운 입력 단백질 서열의 경우 두 번째 단계 SVM 예측기에 의해 계산된 확률은 최종 ANTIGENpro 예측 점수입니다[25]. VaxiJen2.0 (http://www.dog-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html)는 다음을 기반으로 하는 정렬 없는 접근 방식으로 단백질 서열의 항원성을 평가하는 공개적으로 액세스 가능한 또 다른 웹 서버입니다. 자동 교차 공분산(ACC) 변환을 통해 단백질 서열을 주요 아미노산 특성의 균일한 벡터로 변환하고 서열 정렬을 참조하지 않고 단백질의 다양한 물리화학적 특성만을 기반으로 항원 분류를 허용합니다[43]. 둘째, 백신 구조가 개인에게 알레르기 반응을 유발할 수 있는 가능성을 배제하기 위해 AlgPred(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/algpr ed/submission.html) 서버를 사용하여 알레르기 성을 결정하십시오. 서버 도구는 IgE 에피토프 매핑, MEME/MAST 모티프, 디펩티드 구성 기반 SVM 방법, BLAST ARP 등 다양한 접근 방식을 제공하며, 모두 정확한 예측에 활용됩니다. 더 높은 예측 정밀도를 위해 임계값은 0.4(기본값)로 설정되었습니다. 또한, 자유롭게 접근할 수 있는 웹 서버 기반 도구인 AllerTop v.2.{{20}} (https://www.dog-pharmfac.net/AllerTOP/index.html)도 적용되었습니다. 백신 구조의 비알레르기 특성을 확인하기 위해. 이 방법은 단백질 서열을 균일하고 동일한 길이의 벡터로 변환하는 자기공분산(ACC) 변환을 기반으로 합니다. 이는 길이가 다른 펩타이드의 정량적 구조-활성 관계(QSAR) 연구에 적용되었으며, 단백질은 k-최근접 이웃 알고리즘에 의해 분류됩니다[44]. 독성이 있는 경우 ToxinPred(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxicpred/prote in.php) 서버를 활용하여 예측했습니다. 이 예측 도구는 SwissProt 및 TrEMBL에서 얻은 다양한 독성 및 무독성 펩타이드 데이터 세트에 대해 훈련된 기계 학습 기술과 정량적 방법을 기반으로 작동합니다[45]. 독성 프로파일링은 인간 실험을 위한 백신 및 기타 면역치료 펩타이드의 안전성을 평가하는 데 중요합니다. 분석은 모티브 기반 방법의 경우 E 값 임계값 10.0, SVM 임계값 0.1에서 SVM(TrEMBL)+모티프 기반 접근 방식을 선택하여 수행되었습니다.
물리화학적 특성 평가
키메라 펩타이드의 물리적, 화학적 특징을 기술하는 것은 백신으로 투여될 때 적절한 면역 반응을 유도할 수 있어야 하기 때문에 매우 중요합니다. ExPASY(Expert Protein Analysis System) 포털(https://web.expasy.org/program/)에서 사용할 수 있는 ProtParam 서버를 사용하여 분자량, 이론적 pI, 불안정성 지수, 지방족 지수, 생체 내 및 시험관 내 반감기, 소수성 총평균(GRAVY) 등.
백신 펩타이드의 2차 구조 예측
PSIPRED 서버(//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) 및 RaptorX 속성 서버(//raptorx.uchicago.edu/StructurePropertyPred/)를 적용하여 설계된 백신 구성의 2차 구조 요소를 예측했습니다. 예측/) 둘 다 자유롭게 액세스할 수 있는 온라인 단백질 구조 분석 서버입니다. 백신 펩타이드의 1차 서열이 입력으로 제공되었습니다. PSIPRED는 PSI-BLAST에 의해 생성된 위치별 채점 행렬(PSSM)을 기반으로 기능하는 두 개의 피드포워드 신경망을 활용하여 입력 단백질 서열의 2차 구조를 예측합니다[46]. 여기에는 PSI-BLAST에 의한 백신 구성과 상동적인 서열 식별과 PSSM 생성이 포함됩니다. PSIPRED 3.2 이상 버전은 이 접근 방식을 매우 정확하고 정확하게 만드는 엄격한 3중 교차 검증 방법으로 평가한 결과 Q3 평균 점수 81.6%를 달성한 것으로 나타났습니다. RaptorX 속성 웹 서버는 2차 구조, 용매 접근성 및 무질서한 영역과 같은 다양한 기능을 동시에 예측하기 위해 DeepCNF(심층 컨벌루션 신경장)라는 최신 기계 학습 기술을 사용합니다. DeepCNF는 조건부 무작위 필드(CRF)와 얕은 신경망을 결합한 통합 접근 방식으로, 심층 계층 구조를 통해 복잡한 시퀀스-구조 관계를 모델링하고 3-클래스 2차 구조에 대해 약 84% Q3 정확도를 얻을 수 있습니다[47] .
3차 구조 예측
최종 백신 펩타이드의 3차 구조는 온라인 웹서버 I-TASSER(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)를 이용하여 예측하였다. I-TASSER는 프로파일-프로파일 스레딩 정렬(PPA) 및 반복적 구조 조립 시뮬레이션과 원자 수준 구조 개선을 기반으로 하는 계층적 단백질 구조 모델링 접근 방식입니다. 이는 구조 템플릿 식별, 반복 구조 어셈블리 및 구조 기반 기능 주석의 세 단계로 작동합니다. 글로벌 및 로컬 정확도 추정이 포함된 최상위 구조 모델은 예측 모델의 품질과 상관관계가 있는 대표 C 점수 및 TM 점수와 함께 반환됩니다. I-TASSER 프로그램은 단백질 구조 및 기능의 자동화된 예측을 위해 CASP에서 입증된 가장 성공적인 방법 중 하나를 나타냅니다[48, 49].
백신 3차 구조의 개선
단백질 구조의 기존 계산 모델링만으로는 예측 모델의 신뢰성과 정확성을 보장하지 않습니다. 왜냐하면 이러한 모델링 전략은 사용 가능한 템플릿 구조와 입력(대상)의 가능성 정도에 크게 좌우되기 때문입니다. 따라서 템플릿 기반 모델의 정확도를 넘어 품질을 향상시키는 것이 필요하다고 생각되었으며, 이는 전체 단백질 구조를 미세화함으로써 달성할 수 있었습니다. 이러한 관점에서 C-점수가 가장 높은 I-TASSER 서버의 3차원 모델 출력은 GalaxyRefne 서버(http://galaxy.seoklab.org/cgi-bin/submit.cgi?type{)에 의해 추가로 개선되었습니다. {4}} 구체화). 이는 단백질 측쇄를 먼저 재구성한 다음 측쇄 재패킹 및 전체 구조 완화를 분자 역학 시뮬레이션을 통해 수행하는 CASP10- 테스트를 거친 정제 접근 방식입니다. 이는 표적 단백질의 국소 및 전체 3차 구조 모두의 정확한 개선으로 이어집니다[50].
cistanche 보충 혜택 - 안티 -염증성
백신 3차 구조 검증
예측된 3D 모델에서 발생할 수 있는 잠재적인 오류를 발견하려면 백신의 정제된 3차 구조를 검증해야 했습니다. GalaxyRefne 서버에서 얻은 정제된 모델을 a.pdb 형식의 입력 구조로 제공했습니다. 게다가, Ramachandran 플롯은 단백질 구조 검증을 위한 중요한 구성 요소로 간주되는 아미노산 측쇄의 phi(ψ) 및 psi(ψ) 2면체 각도의 에너지적으로 허용되거나 허용되지 않는 영역을 시각화하기 위한 또 다른 매우 유용한 접근 방식입니다. 따라서 Python 기반 MolProbity 스타일 Phenix 검증[51]을 기반으로 특정 백신 모델에 대한 Ramachandran 플롯을 생성하는 MolProbity 서버[메인 페이지 - MolProbity(duke.edu)]가 사용되었습니다. 우리는 모델의 서로 다른 원자 사이의 비결합 상호 작용 통계를 분석하고 오류 함수 값과 {{ 6}}잔여 슬라이딩 [52]. 표준 ProSA 프로그램을 기반으로 한 대화형 웹 기반 플랫폼인 ProSA 웹 서버(https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php)가 이러한 목적으로 사용되었습니다[53]. 이 단계는 모델링된 구조를 보다 정교하고 정확하게 검증하기 위해 수행되었습니다.
백신 펩타이드의 이황화 공학
이황화 결합은 구조적 엔트로피를 낮추고 변성 상태의 자유 에너지를 증가시킴으로써 단백질 안정성에 기여합니다. 새로운 이황화 결합의 도입은 접힌 천연 단백질의 열안정성을 향상시키는 중요한 생명공학 도구로 간주되어 왔습니다. Disulfide by Design 2(DbD 2) v 2.12 서버는 이황화 결합을 도입하여 설계된 백신의 전반적인 구조적 안정성을 향상시키는 데 사용되었습니다. 이 방법은 기본 기하학을 활용하고 각 잠재적 이황화물에 대한 에너지 값을 계산하여 후보 이황화 결합의 순위를 매기는 수단을 제공합니다. 최대 안정성을 부여하는 이황화 결합은 chi3 값, 결합 에너지 및 B 인자가 높은 후보였습니다[54]. 펩타이드의 유연한 영역은 앞에서 언급한 매개변수를 기반으로 선택되었으며, 선택한 쌍의 잔기 사이에 이황화 연결을 형성하여 상응하는 안정화 돌연변이가 생성되었습니다.
면역 수용체(인간 TLR-2, 4, 5, 8 및 마우스 TLR-9)를 포함하는 백신 구조물의 분자 도킹
TLR(Toll-like Receptor)은 병원체 관련 분자 패턴(PAMP)을 인식하고 감염에 대한 선천적 면역 반응을 불러일으키는 세포 면역 반응의 주요 특성입니다. Leishmania 구성요소를 사용한 TLR-2의 직접적인 활성화가 이후에 보고되었습니다[55]. 다른 관련 실험 연구에서, TLR-4의 부족으로 인해 기생충 성장이 증가하고 L. 주요 감염으로 인한 피부 병변의 치유가 지연되었으며, 이는 Leishmania에 대한 면역 유도에서 TLR{5}}의 그럴듯한 역할을 나타냅니다. ]. 한편, TLR-2, 4, 9는 L. braziliensis 및 L. amazonensis에 의해 유발되는 CL의 면역병리학적 스펙트럼에 관여하는 것으로 밝혀졌다[57]. TLR-9은 또한 인간의 VL 발병에서 수지상 세포 활성화의 핵심 역할로 평가되었습니다[58]. 리슈마니아 유래 성분 중 일부는 이 분야에서 수행된 대부분의 연구에서 TLR-2, 4 및 9를 활성화하는 것으로 나타났습니다. 이러한 관찰은 레슈마니아에 대한 보호 면역을 유발하는 데 다양한 TLR이 관여한다는 사실을 강조합니다. 따라서 TLR과 설계된 백신 구성체 사이의 상호 작용은 레슈마니아 감염에 대한 효과적인 면역을 유도하는 데 필요한 것으로 간주되었습니다. 이는 PatchDock 서버[PatchDock 서버(tau.ac.il)를 사용하여 인간 TLR-2, 4, 5, 8 및 마우스 TLR-9과 다중 에피토프 백신 펩타이드의 분자 도킹을 수행하여 확인되었습니다. )]. PatchDock 알고리즘은 분자 모양 표현, 표면 패치 매칭, 필터링 및 채점이라는 세 가지 주요 단계로 구성됩니다. 이는 주로 수용체와 리간드 사이의 분자 모양 상보성에 따라 작동하는 기하학 기반 분자 도킹 알고리즘입니다. 보완적인 패치가 일치하고 후보 변환이 생성됩니다. 이러한 각 변환은 원자 탈용매화 에너지와 기하학적 피트[59, 60]를 모두 고려하는 채점 함수를 할당하여 추가로 순위가 매겨집니다. 우리 연구에서는 인간 TLR-2(PDB id: 6NIG), TLR-4(PDB id: 4G8A), TLR-5(PDB id: 3J0A), 및 TLR-8(PDB id: 4QC0) 및 마우스 TLR-9(PDB id: 3WPF)을 수용체로 선택하고 별도의 PDB 파일을 Protein DataBank(www .rcsb.org). 백신 펩타이드의 정제된 3D 모델은 모든 도킹 시뮬레이션의 리간드로 사용되었습니다. PatchDock 서버는 기본 매개변수(클러스터링 RMSD: 4.0)로 설정되었습니다. 우리는 가능한 결합 회전 알고리즘을 기반으로 Cluspro 서버를 사용하여 최상의 도킹 모델을 추가로 분석하고 PyMOL 소프트웨어를 사용하여 결합을 평가했습니다[61].
백신 단백질 발현을 위한 코돈 최적화, mRNA 구조 예측 및 in silico 클로닝
숙주에 의한 코돈 사용이 최종 백신 구성체에 대한 원래 서열이 선별된 천연 숙주의 코돈 사용과 크게 다를 때 숙주 유기체에서 외래 유전자의 최대 발현을 달성하기 위해 코돈의 최적화가 필요합니다. (http://www.jcat.de/)에서 공개적으로 이용 가능한 JCat(Java Codon Adaptation Tool)을 입력으로 최종 백신 구조의 1차 서열을 제공함으로써 역번역 및 코돈 최적화에 사용했습니다. 코돈 사용빈도는 가장 서열이 서열화된 원핵 유기체인 E. coli K12에 최적화되었습니다[6]. rho 독립적 전사 종결자, 원핵 리보솜 결합 부위 및 원치 않는 제한 절단 부위를 방지하기 위해 도구에서 제공하는 세 가지 추가 옵션이 선택되었습니다. JCat 도구로 계산한 코돈 적응 지수(CAI)와 GC 함량은 최적화가 얼마나 좋은지 나타냅니다. 더 나은 최적화는 백신 단백질의 더 높은 발현을 보장합니다. 또한, 클로닝을 용이하게 하기 위해 XhoI 및 NdeI 효소에 대한 제한 부위를 JCat 도구에서 제공하는 최적화된 cDNA 서열에 통합했습니다. 그런 다음 SnapGene 도구의 제한 클로닝 모듈을 사용하여 변형된 서열(제한 부위 포함)을 E. coli pET 28-a(+) 플라스미드 벡터에 삽입했습니다[6, 31, 62, 63]. SnapGene 소프트웨어는 웹사이트(https://www.snapgene.com/)에서 구할 수 있습니다. 게다가, 우리는 또한 다음에 의해 인코딩된 mRNA의 2차 구조 예측을 위해 mfold 웹 서버(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Foldi ng-Form)를 사용했습니다. 키메라 펩타이드의 유전자. JCat 도구에서 얻은 역번역된 최적화 시퀀스가 입력으로 제공되었습니다. mfold 프로그램은 특정 염기쌍을 포함하는 폴딩에 대한 최소 자유 에너지, ΔG 및 최소 자유 에너지를 예측하는 핵심 알고리즘을 기반으로 합니다. 폴딩 에너지의 정확한 예측을 위해 다양한 폴딩 제약 조건도 적용됩니다. RNA 접힘의 접힘 에너지는 37도로 고정되는 반면, 이온 조건은 [Na+]= 1 M 및 [Mg++]=0 [64]로 고정됩니다.
C‑immsim 기반 면역 시뮬레이션
C-immsim(https://kraken.iac.rm.cnr.it/C-IMMSIM/index.php?page=1)은 에이전트 기반 클래스를 활용하는 서버 기반 면역반응 예측 도구이며, 그 예측은 신경망에 의존합니다. 이는 체액성 면역 반응과 세포 매개성 면역 반응을 모두 예측할 수 있습니다. C-immsim은 Celda Seiden 모델, 비트 스트링 다클론 격자 모델 및 Simpson 지수를 활용하여 활성 세포, 휴면 세포, 기억 세포 및 그 수명에 대한 예측을 특성화합니다. 염증 반응을 평가하기 위해 주어진 반응의 사이토카인 프로필을 예측하는 데 도움이 됩니다.
시스탄체추출분말
분자동역학 시뮬레이션
iMOD(iMod Server 홈페이지(csic.es) 서버를 이용하여 제안된 백신으로 우리의 최고 복합체인 TLR의 안정성을 평가하기 위해 분자동역학 시뮬레이션을 수행하였다. 이 웹 기반 서버는 향상된 정상 모드 분석(NMA)을 사용한다. 단백질 유연성 및 안정성과 같은 생체분자의 다양한 동적 특성을 원자내 힘장을 통해 특성화하기 위해 본 연구에서는 주쇄 변형, B 인자, 고유값, 공분산 인자 및 탄성 네트워크 모델을 분석했습니다. in silico 접근법으로 얻은 단백질-단백질 복합체 평가를 위한 표준 NMA 매개변수로 사용됩니다[66-69].
결과
레슈마니아 항원 단백질 서열의 선택 및 검색
The amino acid sequences of twelve Leishmania proteins were retrieved from the Uniprot database in FASTA format and subjected to further analysis for the purpose of designing a multi-subunit peptide vaccine against leishmaniasis. These proteins were selected based on previous studies that reported them as potential vaccine candidates as evaluated in experimental animal models or in silico prediction tools. Antigenicity analysis by the ANTIGENpro server showed all the chosen proteins as potential antigens with varying degrees of antigenicity, keeping with the information obtained from literature mining. However, ten among the twelve proteins were presented with relatively higher prediction scores (>0.51), 이는 백신 설계에 대한 더 높은 효능을 반영합니다(표 1). SignalP 1.4 서버에 의한 신호 펩타이드 절단 부위의 예측을 기반으로 단백질을 분비성 및 비분비성으로 구별했습니다. 선택된 레슈마니아 단백질 중 2개, 즉. L. mexicana 시스테인 프로테이나제 A(Uniprot id: P25775) 및 L. amazoensis 표면 당단백질 GP-46/M2(Uniprot id: P21978)는 신호 펩타이드를 함유하는 것으로 밝혀졌으며, 따라서 분비 단백질로 예측됩니다. 나머지 10개의 레슈마니아 항원은 비분비 특성을 나타내는 신호 펩타이드를 갖고 있지 않은 것으로 밝혀졌습니다. 국소화 분석은 L. mexicana의 단백질 시스테인 프로테이나제 A(Uniprot id: P25775)가 리소좀/액포에 국한되고, L. mexicana의 단백질 leishmanolysin C1 및 proteophosphoglican(Uniprot id: P43150 및 Q9TW13, 각각)이 막 단백질이 될 것으로 예측했습니다. , L. donovani(Uniprot id: Q9BIJ5)의 보호 항원이 핵에 존재하고 L. major(Uniprot id: P12076)의 열 충격 70 관련 단백질 1이 미토콘드리아에 위치합니다. 다른 모든 단백질은 세포질로 예측되었습니다 (표 1). 이에 추가로, 인간 IL-12의 알파 사슬의 아미노산 서열도 Uniprot 데이터베이스(Uniprot id: P29459)에서 얻어 최종 백신 구성체에서 보조제로 사용되었다.
CTL 및 HTL 에피토프 예측
조사 중인 모든 단백질 중에서 NetCTL 1.2 및 SYFPEITHI 서버에 의해 총 59개의 공통 비숫자 CTL 에피토프가 공동으로 식별되었습니다. 예측된 CTL 에피토프 각각에는 해당 서버에서 계산된 특정 점수가 할당되었습니다. 이러한 공통 9-mer CTL 모티프 중 26개만이 점수가 높기 때문에 선택되었습니다(MHC I 결합 친화도가 더 높음을 나타냄). 호환 가능한 더 높은 점수를 가진 두 서버에서 공통적으로 식별된 이러한 26개의 CTL 에피토프는 최종 백신 구성에 포함되었습니다(보충 표 S1). 마찬가지로, IEDB MHCII 결합 분석 도구는 세 가지 인간 HLA 대립유전자 세트(HLA-DRB1*01:01, HLA-DRB1*01:02 및 HLADRB1*)에 대해 선택된 모든 단백질의 15-mer HTL 에피토프를 예측했습니다. 01:03). 이들 대립유전자 각각에 대해 가장 낮은 조정 순위를 갖는 예측된 HTL 에피토프는 보충 표 S2에 기록되어 있습니다. 이 풀에서 총 9개의 서열이 이들 HTL 에피토프를 3개의 HLA 대립유전자에 대한 가장 강력한 MHC-II 결합제로 만드는 낮은 조정 순위(표 2)를 기준으로 선택되었습니다. 선택된 HTL 에피토프는 사이토카인 생산 능력을 예측하기 위해 추가 컴퓨터 분석을 거쳤습니다.
풀 사이즈 테이블
사이토카인 유도 능력이 있는 HTL 에피토프 스크리닝
선택된 9개의 HTL 에피토프(표 2) 모두 IFNepitope 서버를 사용하여 인터페론을 생산하는 능력에 대해 평가되었습니다. 서버는 L. major의 파라파겔라 막대 단백질 2C의 FRRLYKTLGQLVYKK, L. mexicana의 프로테오포스포글리칸의 DNGAYLGMEPSSVAA, 및 L. mexicana는 1 미만의 점수로 "양성"입니다.0 (표 3). IL4pred 서버와 IL10pred 서버를 각각 사용하여 이들 세 가지 펩타이드의 IL{8}} 및 IL{9}} 생성 능력을 추가로 확인했습니다. 두 서버 모두 SVM 분류기를 활용하고 예측을 위해 아미노산 조성, 디펩티드 조성, 아미노산 성향 및 물리화학적 특성과 같은 다양한 SVM 입력 매개변수를 고려합니다[32, 33]. 각 서버는 이러한 3개의 15-mer IFN- -생성 에피토프가 IL-4 및 IL-10에 대한 유도자일 것이라고 예측했습니다(보충 표 S3). 따라서 이들 3개의 MHC-II 결합 15-mer HTL 에피토프는 사이토카인 IFN-, IL-4 및 IL{{24) 생성을 유도하는 능력을 고려하여 최종적으로 백신 구성을 위해 선택되었습니다. }} 이로써 강화된 면역 반응을 중재합니다.
에피토프 보존 분석
IEDB 서버 내에서 이용 가능한 IEDB 모듈 "항원에 걸친 보존"은 최종 백신 구성물에 통합될 선택된 CTL 및 HTL 에피토프의 보존 정도를 찾는 데 사용되었습니다. 26개의 CTL 에피토프와 3개의 HTL 에피토프 각각을 Uniprot BLAST로 얻은 특정 상동 단백질 서열 세트에 대해 개별적으로 스크리닝했습니다. BLAST 결과는 다양한 레슈마니아 종과 기타 관련 기생충 원생동물, 주로 Trypanosoma에서 선택된 단백질이 높은 수준으로 보존되었음을 보여주었습니다. 모든 HTL 에피토프는 분석에 사용된 관련 레슈마니아 단백질 세트 전체에서 고도로 보존된 것으로 나타났습니다(100%). 선택된 CTL 에피토프의 보존 범위는 0에서 100%까지 다양했습니다(보충 표 S4). 최종 백신 구조물에 이러한 보존된 CTL 및 HTL 에피토프를 통합하면 일반적으로 인간을 감염시키는 여러 종의 병원성 레슈마니아에 대한 광범위한 교차 면역이 보장됩니다.
풀 사이즈 테이블
표 3 IFNepitope 서버는 인터페론 생산이 가능한 MHC II 유도 에피토프를 예측했습니다.
다중 에피토프 백신 서열의 구축
항원성, MHC 결합 친화성 및 사이토카인 유도 능력을 기준으로 선택된 26개의 CTL 에피토프와 3개의 HTL 에피토프의 서열을 병합하여 다중 서브유닛 펩타이드 백신의 1차 서열을 구축하였다. 개별 CTL 및 HTL 에피토프는 각각 AAY 및 GPGPG 링커를 사용하여 융합되었으며, 생성된 백신 펩타이드의 전체 길이는 369개 아미노산이었다. 인간 IL-12(Uniprot ID: P29459)의 219개 아미노산 장 알파 사슬인 보조제를 EAAK 링커에 의해 설계된 펩타이드의 N 말단에 추가했습니다. 천연 보조제로서 IL-12을 첨가하면 이미 동물 연구에서 검증된 바와 같이 면역 반응을 가속화하여 백신의 효과를 향상시킬 것으로 예상되었습니다[3, 37]. 또한, 재조합 DNA 기술을 통해 생산된 단백질의 식별 및 정제를 용이하게 하기 위해 6XHis 태그도 펩타이드의 C 말단에 추가되었습니다. 링커, 면역증강제, 히스티딘 태그를 첨가한 후 최종 백신 펩타이드의 길이는 598개의 아미노산 잔기로 확인되었다(그림 1).
선형, 연속, 불연속 B 세포 에피토프 예측
보다 효과적인 예측을 위해 두 개의 다른 서버, 즉 ABCpred 및 BepiPred 2.0를 사용하여 설계된 백신의 1차 서열에 항원 결정기의 존재를 식별했습니다. ABCpred 서버는 훈련된 순환 신경망을 사용하여 B 세포 에피토프를 예측하고 결합 점수에 따라 순위가 매겨진 16-머 펩타이드로 후보 서열을 나타냅니다(보충 표 S5). 펩타이드의 점수가 높을수록 에피토프일 확률이 높다는 것을 의미합니다. 설계된 백신 펩타이드에는 기본 임계값 0.51에서 예측 점수가 0.90 이상인 7개의 중첩되지 않는 16-mer 펩타이드가 있는 것으로 밝혀졌습니다.51 이는 B 세포에 결합하고 자극하는 매우 높은 효능을 반영합니다. 다른 서버인 BepiPred 2.0는 입력 서열의 각 아미노산 잔기가 B 세포 에피토프의 일부일 확률을 예측하고 출력을 오렌지색 그라데이션으로 그림으로 표현합니다. 개연성. B 세포 에피토프에 속하는 예측 잔기는 "E"로 표시됩니다. 서버는 펩타이드의 380-53{{20}} 위치의 잔기 스트레치 내에서 높은 확률로 선형 B 세포 에피토프로 많은 수의 잔기를 식별했습니다(그림 2). 에피토프 임계값은 0.5(기본값)로 설정되었습니다. 따라서, 두 개의 독립적인 서버에 의한 B 세포 수용체에 대한 항원 결정인자의 식별은 펩타이드가 백신으로 투여될 때 B 세포에 의한 항체 생산을 자극하여 리슈마니아 감염으로부터 개인을 보호할 수 있다는 사실을 확립했습니다. Ellipro 소송(IEDB 포털에서 이용 가능)은 펩타이드 백신의 정제된 3차 구조에서 8개의 불연속 B 세포 에피토프에 위치한 총 323개의 아미노산 잔기를 예측했으며 점수 범위는 0.509~0.802입니다. 그 중 가장 큰 구조적 에피토프는 107개의 아미노산 잔기를 포함하고 있으며 예측 점수는 0.772입니다. 분석에는 서버의 기본 매개변수가 사용되었습니다. Ellipro는 또한 0.535-0.885의 점수 범위 내에서 총 324개의 잔기를 갖는 12개의 선형 B 세포 에피토프를 예측했습니다(보충 표 S6 및 보충 이미지 M1).
백신 구조물의 항원성, 알레르기성 및 독성 프로파일링
최종 백신 서열(보조제 포함)의 항원성은 ANTIGENpro 및 VaxiJen 2.0 서버에 의해 평가되었습니다. ANTIGENpro 서버는 항원성 점수가 0.745396인 가능한 항원으로 동일한 것을 예측했습니다. VaxiJen 2.0 서버는 백신 펩타이드를 표적 유기체가 있을 때 임계값 {{1{14}}}}.5에서 0.5325 점수로 가능한 항원으로 평가했습니다. 기생충으로 선정되었습니다 (표 4). 그러나 아주반트가 없는 원래의 백신 서열을 VaxiJen 2.0로 분석한 결과 기생충 모델에서 점수 0.5768로 유력 항원으로 예측되었습니다. 원래 시퀀스의 ANTIGENpro 예측 점수는 0.714582였습니다. 따라서, 구축된 백신 서열(아쥬반트 유무에 관계없이) 모두 본질적으로 항원성인 것으로 밝혀졌으며, 이는 추가된 아쥬반트가 없더라도 백신의 펩타이드 성분 자체가 항원성이라는 사실을 뒷받침합니다(표 4). 알레르기성에 관한 한 최종 백신 서열은 AlgPred에 의해 0.4의 임계값에서 0.4018의 예측 점수로 비알레르기 유발 물질인 것으로 밝혀졌습니다. 또한, 단백질 서열에는 실험적으로 입증된 IgE 에피토프가 포함되어 있지 않은 것으로 밝혀졌으며, 알레르겐 대표 펩타이드(ARP)에 대한 BLAST 결과에서도 히트가 발견되지 않았는데, 이는 백신의 비알레르기 특성을 나타냅니다. AllerTOP v.2.0 서버는 또한 단백질을 가능한 비알레르기 항원으로 정의했습니다. ToxinPred 서버에 의한 독성 분석은 SVM(TrEMBL)+모티프 기반 접근 방식이 SVM 임계값 0.1에서 채택되고 모티프 기반의 E 값 컷오프가 10.0으로 설정된 경우 펩타이드가 무독성일 것으로 예측했습니다. 따라서 생성된 백신 서열은 가능한 항원, 비알레르기 항원, 무독성으로 예측되었으며, 이는 모두 이상적인 다중 하위 단위 펩타이드 백신의 중요한 기준입니다.
그림 1 AAY(파란색) 링커를 사용하여 EAAK(보라색)와 26 CTL(주황색)과 연결된 N 말단 천연 면역보강제(녹색)로 가능한 백신 구성을 나타내는 총 598개 아미노산 서열을 포함하는 설계된 다중 에피토프 펩타이드 백신의 도식적 묘사 , 3HTL(노란색)은 GPGPG(빨간색) 링커로 연결됩니다. 정화 목적으로 C 터미널에서 6-His 태그로 끝납니다.
그림 2. Bepipred 2.0 서버에 의해 예측된 B 세포 에피토프. 1개부터 590개까지의 아미노산 서열의 다양한 지점에서의 신장은 기본 역치 수준보다 높은 잠재적인 에피토프로 예측되었습니다. E로 표시된 첫 번째 줄은 예측된 에피토프 위치를 나타냅니다.
물리화학적 매개변수 평가
최종 백신 구조물의 물리화학적 매개변수는 주어진 서열에 존재하는 아미노산 잔기를 기반으로 Protparam 서버에 의해 계산되었습니다. 설계된 펩티드의 분자량(MW)은 65.68 kDa로 계산되었으며, 이는 면역원성 반응을 유도하는 데 적합합니다. 이론적 pI(등전점)는 5.98로 계산되었으며, 이는 펩타이드가 사실상 약산성임을 나타냅니다. 펩타이드 내 양전하를 띤 잔기와 음전하를 띤 잔기의 총 수는 각각 48개와 55개였습니다. 반감기는 시험관 내 포유류 망상적혈구에서는 30시간, 효모에서는 20시간 이상, 생체 내 E. coli에서는 10시간 이상으로 계산되었습니다. 포유동물 세포(인간 포함)에서 30시간 동안 단백질의 지속성은 바람직한 면역 반응을 이끌어내기에 충분했는데, 그 이유는 메커니즘이 면역 세포에 의한 단백질의 처리 및 제시를 필요로 하기 때문입니다. 지방족 지수(지방족 측쇄가 차지하는 상대적 부피)는 78.34로 예측되었으며, 이는 지방족 지수가 구형 단백질의 열안정성 증가에 기여하는 긍정적인 요인으로 간주될 수 있으므로 단백질이 사실상 열안정성을 나타냄을 나타냅니다. 불안정 지수는 47.10으로 계산되었습니다. 백신 구조물의 예측된 총 평균 수병증(GRAVY) 값은 -0.140인 것으로 예측되었으며; 음수 값은 이를 친수성으로 정의하고 물 분자와 상호 작용합니다 [28, 70-72]. 결론적으로, 면역정보학적 분석은 설계된 펩티드 구조물이 항원성, 열안정성, 포유동물 세포에 지속성 및 친수성을 갖는 것으로 예측했습니다. 이러한 모든 요소는 가능한 백신 후보로서 구성의 효율성에 영향을 미칩니다.
2차 구조 예측
PSIPRED 서버에 의한 592개 잔기의 긴 키메라 펩타이드에 대한 2차 구조 예측은 다음 그림 3에 도시된 바와 같이 45.77% 알파 나선, 4.89% 베타 시트 및 49.32% 코일의 존재를 나타냅니다. 또한 RaptorX 구조 예측 서버는 펩타이드에 대한 관련 용매 접근성을 분석했는데, 잔류물의 36%는 노출될 것으로 예측되었고, 28%는 중간 매립으로 예측되었으며, 잔류물의 35%는 매몰로 예측되어 단백질이 전체적으로 공정한 접촉을 가질 것임을 나타냅니다. 물(용매)로. RaptorX 서버에서는 단 32개의 잔기(펩타이드의 5%)만이 단백질의 무질서한 도메인에 있을 것으로 예측했습니다.
3차 구조 예측
I-TASSER web server was utilized for the prediction of the 3-D structure of the designed vaccine. The server predicted five models for the said peptide on the basis of multiple threading alignments using ten different templates, among which the template with PDB id 7e2cl showed the best alignment with an TM score of 0.931 and an RMSD value of 2.75. The top-ranked model exhibiting the highest confidence score (C-score) of−1.11 and an estimated RMSD of 10.3±4.6 Å (Fig. 4a) was selected for further refinement. A higher C-score indicates a higher level of confidence with which the server predicts the tertiary structure of the target protein based on the predictions obtained from modeling simulations [46, 66]. The C-score has a strong correlation with the overall quality of the tertiary structure, and it has been used widely for quantitative estimation of the RMSD and TM scores of predicted models in comparison with the native models; further, the estimated TM score of the chosen model was found to be 0.58±0.14 which is another strong indicator of good modeling strategy since a TM score of>0.5는 접힌 부분이 올바른 모델을 나타냅니다. TM 점수는 동일한 SCOP/CATH 접힘 계열의 다른 동일한 단백질과 예측 모델의 구조적 유사성을 측정하기 위한 서열 길이 독립적 매개변수입니다[47].
표 4 항원이 있거나 없는 ANTIGENpro 서버 및 Vaxijen2.0 서버에서 계산된 항원성 결과
그림 3 PSIPRED 서버에 의한 선형 백신 서열에 대한 2차 구조 예측
그림 4 3차 구조 예측 및 개선 3-I-TASSER 서버가 예측한 백신 구조의 D 모델링. b GalaxyRefne 서버를 통한 조잡한 3-D 모델 개선
백신 3D 모델의 개선 및 검증
펩타이드 백신의 "조" 3차 모델은 GalaxyReone 서버를 통해 처리하여 순차적으로 정제되었습니다. GalaxyRefne은 5개의 모델을 산출했는데, 그 중 모델 1이 GDT-HA(0.8826)와 같은 관련 매개변수를 평가 및 비교한 후 가장 좋은 것으로 나타났습니다. RMSD(0.608); MolProbity(2.398); 충돌 점수(21.1); 불량한 로타머(0.6); 나머지 모델과 함께 Rama가 선호하는 지역 (88.8) (그림 4b). MolProbity 서버에서 생성된 Ramachandran 플롯은 정제된 3-D 모델이 선호하는 영역에 88.8% 잔기, 허용된 영역에 98.6% 잔기, 그리고 단지 0.013%의 이상값을 가지고 있음을 보여주었습니다. 대조적으로, 초기 원유 모델은 선호하는 영역, 허용되는 영역 및 특이치 영역에서 각각 77.1%, 94.2% 및 0.057% 잔기를 갖는 것으로 나타났습니다. 이러한 결과는 정제된 3차 모델의 품질이 크게 향상되었음을 명확하게 결론지었습니다. 개선된 모델의 추가 검증을 위해 ERRATA 서버도 활용되었습니다. ERRATA 서버는 전체 품질 계수 43.542로 모델을 분석했는데, 이는 실제로 95% 거부 한계 미만으로 떨어지는 입력 단백질 모델의 비율을 나타냅니다. 따라서 우리는 백신 구조에 대한 상당히 정제되고 검증된 3차 구조를 성공적으로 얻었습니다. MolProbity 서버와 ERRAT 서버에서 얻은 플롯과 함께 정제된 백신의 3차 구조가 그림 5에 표시되어 있습니다. ProSA 웹 서버는 Z 점수 -1.08(보조 이미지 M2)을 나타냈는데, 여기서 음성 값은 모델이 X선 회절이나 NMR에 의해 구조가 결정된 유사한 크기를 가진 유사한 단백질의 점수 범위를 벗어났음을 나타냅니다[51].
백신 펩타이드의 이황화 공학
Disulfide by Design 2.12 서버는 이황화 결합 형성 가능성이 있는 부위인 45쌍의 아미노산 잔기를 반환했습니다. 우리는 높은 결합 에너지와 Chi3 값을 기반으로 백신 단백질의 유연한 루프 영역에 위치할 수 있는 가장 중요한 4개의 후보 잔기 쌍을 식별했습니다(보충 표 S7). 이러한 잔기는 THR58-PHE61(chi3:+126.18), LEU{10}}ALA234(chi3:+125.92), THR323-GLU359(chi3) :+121.54) 및 TYR472-ARG504(chi3: + 125.75)를 최종 백신 단백질의 정제된 3차 모델에서 시스테인으로 대체하여 열안정성을 향상시켰다. 펩타이드(그림 6). 그러나 B 인자의 정확성은 단백질 결정학에서 분자의 열 운동에 의한 중성자 산란이나 X선의 감쇠로 제한됩니다. 따라서 우리는 이 컴퓨터 지원 정제 백신 모델에 대해 B 인자에 비해 높은 결합 에너지와 Chi3 값을 엄격하게 선택했습니다[73, 74].
백신 펩타이드와 TLR의 도킹 상호 작용 분석
키메라 펩타이드와 면역 수용체(인간 TLRs{0}, 4, 5, 8 및 마우스 TLR-9)와의 상호작용은 결합이 이루어지는 PatchDock 서버를 사용하여 도킹 분석을 수행하여 연구되었습니다. 다양한 TLR(수용체)과 백신(리간드)의 친화성을 평가했습니다. 각 도킹에 대해 PatchDock이 생성한 상위 10개 모델이 고려되었으며, 그 중에서 각 사례에 대해 가장 높은 도킹 점수를 갖는 최고 순위 모델이 선택되었습니다. 점수는 수용체와 리간드 사이의 모양과 정전기적 보체 특성을 나타냅니다. 인간 TLR-2(PDB id: 6NIG)의 경우 점수 18,714, 표면적 3963.10 및 원자 접촉 에너지(ACE) 217.99의 경우 최고의 상보성이 발견되었습니다(그림 7a). . 백신은 또한 도킹 점수 18,258로 TLR-5(PDB id: 3J0A) 및 TLR-9(PDB id: 3WPF)과의 효율적인 결합을 나타냈습니다. 표면적 2879.80 및 ACE -666.94 및 도킹 점수 18,164; 표면적은 각각 4090.70 및 ACE는 495.74입니다. 다른 TLR과의 도킹은 PatchDock에서 생성된 낮은 도킹 점수, TLR-4(PDB id: 4G8A)의 경우 16,708, TLR-8(PDB id: 4QC0)의 경우 17,800에 반영된 것처럼 더 약한 결합 친화도를 보여주었습니다. 따라서, 우리의 백신 구성체는 다양한 결합 친화력을 갖는 다양한 면역 수용체와 결합할 수 있었습니다. 이는 레슈마니아 감염을 예방하기 위한 적절하고 강화된 면역력을 유도한다는 점에서 효과적인 백신에 매우 바람직할 것입니다. 또한 FireDock 웹 도구는 최소 글로벌 에너지 -19.01, Van Der Waals 협회(-25.74), 원자 접촉으로 동일하게 정제된 최고의 복합체(TLR-2 백신 복합체)의 개선 및 재점수를 위해 사용되었습니다. 에너지(-0.03) 및 결합 자유 에너지(-24.26). 이러한 결과는 백신 펩타이드가 인간 TLR-2과 가장 효율적으로 상호작용하여 레슈마니아 기생충에 대한 현저한 면역 반응을 초래할 수 있는 합리적으로 안정적인 복합체를 형성한다는 사실을 확증합니다. 이 외에도 TLR-2과 백신 간의 도킹을 추가로 조사합니다. Cluspro 웹 서버를 사용하여 5D 회전 FFT 및 CAPRI(예측 상호 작용의 중요 평가)를 기반으로 최상위 모델(그림 7b)이 선택되었으며, 균형 가중치 점수는 1192.5로 42개 구성원의 가장 큰 클러스터 크기를 갖습니다. 표 5에는 안정적인 수용체-리간드 복합체를 형성하는 그림 7b의 10개 상호 작용 아미노산 잔기 목록이 포함되어 있습니다.
그림 5는 GalaxyRefne 모델에 대한 Ramachandran 플롯입니다. b ERRAT 서버는 단백질 구조의 품질 평가를 예측했습니다.
그림 6 설계에 따른 이황화물 2.0는 최종 백신 구조의 열 안정성을 향상시키기 위해 잠재적인 이황화 결합 형성 4개(화살표로 표시)를 예측했습니다.
백신 단백질 발현을 위한 코돈 최적화 및 인실리코 클로닝
코돈 편향 문제를 극복하기 위한 시도로, 백신 펩타이드의 입력 아미노산 서열을 최적화된 CAI 값 1을 갖는 역번역된 cDNA 서열의 형태로 반환하는 코돈 최적화에 JCat 도구를 활용했습니다. 이 값은 허용된 CAI 값 범위 0.8–1.0 [28] 내에서 숙주 유기체인 E. coli K12에서 유전자의 높은 발현 속도를 보장합니다. CAI 값이 높을수록 외래 유전자의 발현율이 좋아진다. 또한, 개선된 서열의 GC 함량은 51.85%로 확인되었으며, 이는 우수한 코돈 최적화를 나타냅니다. 더 나은 유전자 발현을 위해서는 35-70% GC 함량이 필요합니다[63]. 효소 XhoI 및 NdeI에 대한 제한 부위는 서열의 5/ 및 3/ 말단에 생성된 후 변형된 서열을 pET28 a(+) 벡터에 삽입했습니다. 빨간색으로 표시된 복제된 삽입물은 벡터의 지정된 제한 사이트 사이에 있습니다. 6개의 히스티딘 잔기가 클로닝된 서열의 양쪽 끝에 위치하여 재조합 백신 단백질 생산 후 정제 과정을 용이하게 합니다[6, 31]. 유전자 단편이 삽입된 최종 플라스미드 벡터 구조물의 크기는 약 7kb였다(도 8). mfold 웹 서버는 mRNA의 총 50개 접힘 형태를 예측했으며, 그 중 가장 낮은 에너지 점수(ΔG{20}} -492.50)로 인해 상단 구조가 선택되었습니다. 이 특정한 접힌 형태는 형태의 안정성을 나타내는 최소 자유 에너지를 갖는 단일 외부 루프와 4개의 스택을 포함할 것으로 예측되었습니다. 루프는 21개의 단일 가닥 염기와 2개의 닫힌 나선으로 형성되었습니다. 에너지 도트 플롯은 최적 에너지(δG)를 494.4kcal/mol로 계산했습니다. 필드에 있는 서로 다른 색상의 점은 서버에서 계산된 δG를 고려하여 mRNA에 존재하는 특정 염기쌍의 에너지 등급이 서로 다름을 나타냅니다[64]. 플롯에 따르면 대부분의 염기쌍의 자유 에너지는 -487.5 범위 내에 있습니다.<δg <="−485.8" kcal/mol="" range="" (supplementary="" image="" m3).="" conclusively,="" a="" thermodynamically="" favored="" and="" energetically="" stable="" secondary="" structure="" of="" the="" mrna="" was="" predicted="" (supplementary="" image="" m4).="" all="" the="" folding="" constraints="" were="" set="" at="" their="" default="" values,="" and="" the="" rna="" was="" considered="" to="" be="" linear="" in="">
풀 사이즈 테이블
면역 시뮬레이션
C-immsim 웹 서버를 사용한 In silico 면역 시뮬레이션에서는 초기 주사 투여 후 2일 이내에 항원 수가 최대 6.9×105/ml에 도달하고 4일째부터 항원 수준이 0으로 떨어졌습니다. 이러한 항원 수의 증가는 초기 감염 기간 동안 IgM IgG 수준과 IgM 수준 단독의 농도가 현저하게 증가하고 임의 규모로 감염 주기 약 12일 이내에 최고 수준에 도달하는 것과 상관관계가 있습니다. IgG1+IgG2 수준과 IgG1의 다른 하위 유형은 2차 면역 반응의 결과로 현저하게 증가합니다(그림 9a). 사이토카인 프로필은 INF-와 같은 염증 매개체가 12일째에 최대 4×106 ng/ml 수준에 도달하는 반면, 다른 사이토카인 수준은 매우 낮게 유지되는 것을 보여줍니다(그림 9b). 활성 및 휴지기 세포독성 T 림프구의 존재로 시사되는 세포 매개 면역학적 반응은 초기 주입 후 2~3일 후에 증가하며, 증식성 기억 보조 T 세포의 존재도 두드러졌습니다(그림 9c 및 d). 1차 용량 투여 1주 후 기억 B 세포의 생성과 함께 전체 B 세포 집단도 2~3일 이내에 증가합니다(그림 9e).
그림 8 pET28 a(+) 벡터를 사용한 리슈마니아 백신 발현 시스템, 빨간색 영역은 NdeI 및 XhoI 제한 부위 옆에 삽입된 백신의 핵산 서열을 나타냅니다.
분자동역학 시뮬레이션 해석
TLR2-백신 복합체에 의해 달성된 최고의 도킹 점수는 NMA 지원 분자 역학 시뮬레이션을 통해 추가로 분석되었습니다. 주 체인의 변형성은 높은 힌지로 표현되며(그림 10a), 이는 높은 변형성을 의미합니다. B 인자(그림 10b)는 NMA에 의해 계산되었으며, 이는 원자 변위 매개변수를 기반으로 한 단백질 유연성을 나타냅니다[73]. 고유값(그림 10c)은 구조를 변형하는 데 필요한 에너지를 나타냅니다. TLR-2 백신 복합체는 약 7.778×10−7의 고유값을 나타냅니다. 분산(그림 10d)은 고유값과 반비례합니다. 공분산 행렬(그림 10e)은 잔기 쌍이 상관 관계(빨간색), 상관 관계가 없음(흰색) 또는 반상관(파란색)인지 여부를 보여줍니다. 탄성 네트워크 모델(그림 10f)은 해당 원자 쌍 사이의 스프링을 계산합니다. 그래프의 점은 스프링의 강성 또는 유연성을 나타내는 색상 그라데이션으로 표시되며, 어두운 색상은 더 단단한 스프링을 반영합니다. 따라서, 분자 역학 시뮬레이션 결과는 우리가 제안한 펩타이드 백신이 안정적이라는 것을 시사했습니다.
논의
레슈마니아증은 인도를 비롯한 개발도상국의 빈곤 지역에 사는 사람들에게 주로 영향을 미치는 가장 소홀히 여겨지는 열대성 질병 중 하나로 간주됩니다[2]. WHO 보고에 따르면 인도에는 CL과 VL이라는 두 가지 형태의 질병이 모두 발병하고 있습니다. L. tropica 및 L. major에 의해 발생하는 CL은 인도 북서부 주, 펀자브, 라자스탄을 중심으로 발생합니다(https://www.who.int/leishmaniasis/burden/Leishmaniasis_India/en/) ). 더욱이, 전 세계적으로 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 전염병의 발생이 증가함에 따라 레슈마니아증은 AIDS 환자에게 다시 떠오르는 기회 감염 병원체로 등장하여 상황을 더욱 끔찍하게 만들고 있습니다[22, 38]. 현재 연구에서 우리는 일반적인 병원성 기생충 종으로부터 이종 보호를 제공할 수 있는 레슈마니아증에 대한 새로운 다가 일반 백신을 설계하는 것을 목표로 했습니다. 우리는 인간에게 VL 및 CL 감염을 일으키는 기생충의 5가지 병원성 계통을 포함하는 12개의 리슈마니아 특이적 단백질을 선택했습니다. 이들 단백질은 독성 및 면역원성에서의 역할과 다양한 면역학 연구에서 백신 후보로서의 잠재력에 대해 이미 평가되었습니다[1, 8-10, 75]. 따라서 다양한 병원성 레슈마니아 종의 잘 특성화되고 고도로 보존된 면역원성 단백질을 통합하여 인실리코로 설계된 백신 구성체는 모든 형태의 인간 레슈마니아증(주로 VL 및 CL)에 대해 교차 면역성을 제공할 수 있으며, 따라서 다음 용도로 사용될 수 있습니다. 인간의 레슈마니아 감염을 예방하기 위한 일반적인 예방접종 프로그램입니다. 선택된 단백질은 잠재적인 CTL 및 HTL 에피토프의 존재에 대해 일차적으로 스크리닝되었습니다. T 세포 에피토프의 검출은 T 세포가 내인성 또는 외인성 경로에 의해 처리되고 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 분자와 복합체를 형성한 후 항원 제시 세포에 의해 T 세포 수용체에 제시될 때만 항원을 인식할 수 있기 때문에 중요합니다. APC). MHC-I은 CD8+CTL에 특이적인 반면, MHC-II는 CD4+HTL 수용체에 특이적으로 결합합니다. CTL 에피토프에 대한 식별은 두 개의 독립적인 서버를 동시에 사용하여 엄격하게 수행되었습니다. MHC 결합 친화도가 상당히 높은 두 서버에서 예측한 에피토프만 최종적으로 백신 펩타이드에 포함되었습니다. 확인된 HTL 에피토프는 세 개의 웹 서버를 활용하여 사이토카인 유도 능력에 대해 추가로 평가되었습니다. 다양한 사이토카인, 즉 IFN-, IL{{20}} 및 IL-10의 생성을 자극할 수 있는 것들이 키메라 펩타이드 백신 설계를 위해 선택되었습니다. 이는 숙주에서 이러한 기생충 특이적 사이토카인 모두의 생산을 촉진할 것입니다. 이는 Kedzierski와 동료들이 백신이 보호 면역 반응을 유도할 수 있는지와 IL의 경우 적절한 면역이 유도되지 않는지 여부를 결정하기 위해 IL-10의 분비가 IFN-의 분비만큼 중요하다고 제안했기 때문에 가장 중요합니다. -10 수준은 비례적으로 상승하지 않습니다 [8, 75]. 다음으로 AAY 및 GPGPG 링커를 사용하여 독점적인 CTL 및 HTL 에피토프를 융합하여 키메라 펩타이드를 구성했습니다. AAY 및 GPGPG 링커는 접합 면역원성을 최소화하고 MHC-II에 의해 선택된 에피토프의 처리 및 제시를 용이하게 하기 때문에 다중 에피토프 백신 설계에 유용한 것으로 이전에 보고되었습니다[6, 28, 71]. 인간 IL-12의 보조 알파 사슬은 EAAK 링커를 통해 생성된 펩타이드의 N 말단에 연결되었다. IL-12는 이전 면역원성 연구에서 문서화된 바와 같이 동물 모델에서 레슈마니아 백신에 대한 가장 효과적인 면역보조제 중 하나이기 때문에 면역보강제로 선택되었습니다[3, 37, 71]. 백신은 인간 투여용이므로 합성 TLR 작용제 대신 인간 IL{38}}을 천연 보조제로 통합하면 부작용을 일으키지 않고 면역력을 높일 수 있을 것으로 예상됩니다. 백신의 일반적인 보조제로서 IL{39}}의 역할은 단백질 및 다당류 백신 항체 반응을 모두 강화하고 IgG 삼출을 허용하는 적절한 국소 염증을 유도하여 면역 반응을 높이는 효능으로 인해 강조됩니다[72]. EAAK 링커는 백신 도메인 간 상호작용을 제한하여 융합 펩타이드의 발현율을 높이고 융합 펩타이드의 생물학적 기능을 촉진하기 위해 첨가되었다[76, 77]. 면역정보학적 분석에 따르면 우리의 백신 구성물에는 면역예방 용도로 만들어진 백신에 매우 바람직한 선형 B 세포 에피토프가 많이 있는 것으로 나타났습니다. 다시 한 번 더 정확한 예측을 위해 두 가지 도구를 사용했습니다. 두 서버 모두 백신 시퀀스에서 충분한 B 세포 에피토프를 예측했습니다. 설계된 백신은 알레르기 유발 물질이 없고, 독성이 없으며, 적절한 면역 반응을 촉발할 만큼 충분히 면역원성이 있는 것으로 예측되었습니다. 후속 물리화학적 분석에서 백신 펩타이드는 지방족 지수(78.34)가 상당히 높은 약산성(pI 5.98)인 것으로 밝혀졌으며, 이는 열에 안정한 특성을 시사합니다. 음의 GRAVY 값(-0.14)은 펩타이드가 친수성임을 나타내며 이는 백신으로서의 효능에 더욱 기여합니다. 백신의 2차 구조 요소는 단백질 2차 구조 예측을 위해 가장 정확하고 널리 사용되는 계산 방법 중 하나인 PSIPRED v 4.0 서버에 의해 결정되었습니다. 또한, 설계된 펩타이드의 3D 구조는 백신의 역학, 생체 활성 및 상호 작용을 연구하는 데 가장 중요한 단백질의 중요한 잔기 좌표에 대한 자세한 정보를 제공하는 I-TASSER 서버를 사용하여 예측되었습니다. 다른 리간드와 함께. 초기 3차 구조는 단백질 구조 검증 도구를 활용하여 예측 모델의 측쇄 또는 백본에서 잠재적인 오류를 찾아 수정함으로써 정제되고 검증되었습니다. Ramachandran 플롯 분석에서는 정제된 모델의 잔차 중 90% 이상이 작은 비율의 이상값으로 허용된 영역 내에 속하는 것으로 나타났으며, ERRAT 서버는 만족스러운 모델 품질을 암시하는 43.542의 품질 계수를 보여주었습니다. 검증된 3D 모델은 ElliPro 서버에 의해 적절한 수의 구조적 B 세포 에피토프를 갖는 것으로 밝혀졌으며, 이는 바람직한 B 세포 반응을 생성하고 숙주에서 특정 항체의 생성을 자극할 수 있음을 의미합니다. B 세포 활성화는 또한 면역학적 기억에 중요하며 백신 접종을 받은 개인의 장기간 면역을 담당합니다. 도킹 분석을 수행하여 백신과 면역 수용체(TLR)의 상호작용도 평가했습니다. 백신 펩타이드는 TLR-2에 대해 가장 높은 친화력을 갖는 것으로 밝혀졌고, TLR-5가 그 뒤를 이었습니다. 그러나 다른 TLR과 결합할 수 있는 정도는 더 낮았습니다. 동물 모델을 포함한 이전 연구에서 다양한 종의 레슈마니아 또는 그 항원 성분이 다양한 TLR과 상호작용하여 공격받은 숙주에서 강력한 면역 반응을 일으키는 것으로 나타났기 때문에 TLR과의 상호작용은 보호 면역을 이끌어내는 데 필수적입니다. E. coli(K12) 숙주 시스템에서 재조합 백신 단백질의 만족스러운 발현을 위한 요구 사항을 충족하기 위해 서열의 CAI 및 GC 함량을 조정하는 JCat 도구를 적용하여 코돈 최적화를 수행하여 에서 발현에 적합하게 만들었습니다. 대장균. 재조합 백신 단백질의 향상된 생산을 달성하기 위한 복제 및 과발현을 위한 시퀀스의 타당성을 보여주기 위해 플라스미드 기반 발현 벡터 pET28a(+)를 사용하여 In silico 복제도 수행되었습니다. 박테리아 숙주에서 효율적인 번역 과정에 영향을 미칠 mRNA의 접힌 형태의 안정성을 보여주기 위해 키메라 유전자 서열에 의해 암호화된 mRNA의 2차 구조에 대한 예측이 이루어졌습니다. 안정화 돌연변이는 백신 단백질에 새로운 이황화 연결을 추가하여 생성되었습니다. 왜냐하면 천연 단백질의 강도에 기여하여 추가적인 생화학적, 면역학적 및 생명공학적 탐구가 가능하도록 만들기 때문입니다.
그림 9 C-immsim 서버 기반 면역 시뮬레이션. a 총 항원 및 각 항체 생성, b 사이토카인 생산 프로필, c 및 d 보조 T 세포 생성 및 총(활성 및 휴면) 세포독성 T 림프구 수, e 백신 투여 후 B 세포 반응
그림 10 분자동역학 시뮬레이션. a 경첩으로 표시되는 주쇄 변형성, b 단백질 안정성을 나타내는 NMA 생성 B 인자, 도킹 복합체의 구조를 변형시키는 c 고유값, d 구조의 분산 및 누적(녹색)의 개별(보라색) %, e 공분산 행렬 상관 원자 쌍 사이의 (빨간색), 상관되지 않은 (흰색) 또는 반 상관 된 (파란색), f 원자 쌍 사이에 연결된 스프링을 보여주는 탄성 네트워크 모델, 더 어두운 회색은 강성 스프링을 나타내고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.
cistanche 보충 혜택 - 면역력 증가
Cistanche Enhance Immunity 제품을 보려면 여기를 클릭하십시오.
【추가 요청】 이메일:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
결론
현재 연구에서 우리는 인간을 감염시키는 일반적인 레슈마니아 기생충으로부터 이종 보호를 부여할 수 있는 인간 리슈마니아증(내장 및 피부 모두)에 대한 다가 다중 서브유닛 펩티드 백신의 인실리코 설계를 위한 역백신학 접근법을 활용했습니다. 따라서 본질적으로 넓은 스펙트럼으로 간주될 수 있습니다. 이는 현재 이용 가능한 화학요법제와 함께 보완적인 전략으로 질병을 통제하고 근절하기 위한 일반적인 예방접종 프로그램에도 사용될 수 있습니다. 또한, IL-12를 비인간화 합성 펩타이드 대신 천연 보조제로 사용했습니다. IL-12를 면역증강제로 사용하면 숙주 신체에 부작용을 일으키지 않고 백신의 면역원성을 높일 수 있습니다. 백신 펩타이드가 5종의 병원성 레슈마니아로부터 얻은 고도로 보존되고 잠재적으로 면역원성이 있는 다양한 펩타이드로 구성되어 있다면, 백신 접종을 받은 개체에서 교차 면역을 유도하는 데 도움이 되며 치료 및 예방적 이점도 있습니다. 여러 계산 도구를 활용한 다양한 엄격한 면역정보학 분석을 통해 제안된 백신이 면역원성이 있고 안정적이며 재조합 단백질로서 재현성이 있고 인간 실험에 안전한 것으로 나타났습니다. 그럼에도 불구하고, 보호적이고 오래 지속되는 면역의 적절한 유도를 보장하고 독성을 배제하기 위해 실험적 검증이 계속 수행되어야 합니다.
참고자료
1. De-Brito RCF, Cardoso JMO, Reis LES, Vieira JF, Mathias FAS, Roatt BM, Agiuar-Soares RDDO, Ruiz JC, Resende DM 외. (2018) 레슈마니아증에 대한 펩티드 백신. 프론트 이뮤놀 9:1043
2. Okwor I, Uzonna J (2016) 인간 레슈마니아증의 사회적, 경제적 부담. Am J Trop Med Hyg 94(3):489–493. https://doi. org/10.4269/ajtmh.15-0408
3. Mutiso JM, Macharia JC, Gicheru MMJ (2010) Biomed Res 24(1):16–25. https://doi.org/10.1016/S1674-8301(10)60004-8
4. Gillespie PM, Beaumier CM, Strych U, Hayward T, Hotez PJ, Bottazzi ME(2016) 레슈마니아증 백신 연구 및 백신 개발 현황. 백신 34(26):2992-2995. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2015.12.071
5. Joshi S, Rawat K, Yadav NK, Kumar V (2014) Siddiqi MI 및 Dube A (2014) 내장 레슈마니아증: 고전적 및 분자적 접근법을 통한 백신 개발의 발전. 전면 면역 5:380. https://doi.org/10.3389/fmmu.2014.00380
6. Khatoon N, Pandey RK, Prajapati VK (2017) 면역정보학 접근법을 사용하여 B 및 T 세포 다중 에피토프 하위 단위 백신을 설계하기 위한 Leishmania 분비 단백질 탐색. 과학 담당자 7:8285
7. Goto Y, Bhatia A, Raman VS, Liang H, Mohammad R, Picone AF, Vidal SEZ, Vedvick TS et al (2011) 내장 레슈마니아증에 대해 최초로 정의된 다단백질 백신 후보인 KSAC. Clin Vaccine Immunol 18(7):1118–1124. https://doi.org/10.1128/CVI. 05024-11
8. Kedzierski L(2010) 레슈마니아증 백신: 오늘날 우리는 어디에 있습니까? J Glob Infect Dis 2(2):177–185. https://doi.org/10.4103/0974- 777X.62881
9. Nagill R, Kaur S (2011) 레슈마니아증 백신 후보: 검토. Int Immunopharmacol 11(10):1464–1488. https://doi.org/10.1016/j.intimp.2011.05.008
10. Coler RN, Reed SG (2005) 레슈마니아증에 대한 2세대 백신. 트렌드 Parasitol 21(5):244–249
11. Fernández L, Carrillo E, Sánchez-Sampedro L, Sanchez C, Ibarra Meneses AV, Jimenez MA, Almeida VDA, Esteban M 외 (2018) 인간 말초 혈액 단핵구에서 Leishmania 활성화 c-키나제 항원(LACK)의 항원성 햄스터에서 pCI-neo-LACK과 약독화된 LACK 발현 백시니아 바이러스를 사용한 프라임 부스트 백신 접종의 보호 효과를 확인했습니다. Front Immunol 9:843. https://doi.org/10.3389/fmmu.2018.00843
12. Kelly BL, Stetson DB, Locksley RM (2003) 효율적인 척추동물 기생충화에는 Leishmania major LACK 항원이 필요합니다. J Exp Med 198(11):1689-1698. https://doi.org/10.1084/jem.20031 162
13. De Mendonça SC, Cysne-Finkelstein L, Matos DC (2015) 리슈만편모충의 백신 후보 및 독성 인자로서의 Kinetoplastid 막 단백질-11. 전면 면역 6:524. https://doi.org/10.3389/fmmu.2015.00524
14. Joshi PB, Kelly BL, Kamhawi S, Sacks DL, McMaster WR (2002) Leishmania major의 표적 유전자 삭제는 리슈마놀리신(GP63)을 독성 인자로 식별합니다. Mol Biochem Parasitol 120(1):33–40. https://doi.org/10.1016/s0166-6851(01)00432-7
15. McMahon-Pratt D, Rodriguez D, Rodriguez JR, Zhang Y, Manson K, Bergman C, Rivas L, Rodriguez JL 외 (1993) GP46/M-2을 발현하는 재조합 백시니아 바이러스는 레슈마니아 감염으로부터 보호합니다. 감염 면역 61(8):3351–3359
16. Holakuyee M, Mahdavi M, Zuhair MH, Abolhasani M (2012) BALB/c 마우스에서 Th2 면역 반응을 유도하는 Leishmania 주요의 열 충격 단백질 강화 전마스티고트. 이란 Biomed J 16(4):209–217. https://doi.org/10.6091/ibj.1098.2012
17. MacLean L, Price H, O'Toole P (2016) 생세포 이미징 방법을 통해 Leishmania 친수성 아실화 표면 단백질 B(HASPB) 수출 경로 탐색. 방법 Mol Biol 1459:191-203. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-3804-9_13
18. Maharana BR, Tewari AK, Singh V (2015) kinetoplastid parafagellar Rod에 대한 개요. J 기생충 Dis 39(4):589–595. https://doi.org/10.1007/s12639-014-0422-x
19. Mahmoudzadeh NH, McKerrow JH (2004) Leishmania tropica: 시스테인 프로테아제는 성장과 병원성에 필수적입니다. Exp Parasitol 106(3–4):158–163. https://doi.org/10.1016/j.exppara. 2004.03.005
20. Mundodi V, Kucknoor AS, Gedamu L (2005) 여행성 기생충 생존에서 Leishmania (Leishmania) chagasi amastigote 시스테인 프로테아제의 역할: 유전자 파괴 및 안티센스 mRNA 억제에 의한 연구. BMC Mol Biol 6:3. https://doi.org/10.1186/ 1471-2199-6-3
21. Rogers ME(2012) 모래파리 전염 및 포유류 숙주 감염에서 레슈마니아 프로테오 포스포글리칸의 역할. 전면 미생물 3:223. https://doi.org/10.3389/fmicb.2012.00223
22. Bhowmick S, Ali N (2009) 내장 레슈마니아증에서 백신 매개 보호의 상관관계를 정의하는 데 도움이 되는 새로운 레슈마니아 도노바니 항원의 식별. PLoS One 4(6):e5820. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005820
23. Assis TM, Mancini DT, Ramalho TC, da Cunha EFF (2014) Leishmania donovani - 튜불린 및 억제제에 대한 In silico 연구. J Chem. https://doi.org/10.1155/2014/492579
