천마 추출물의 뮤린 B16F10 흑색종에서 알파 멜라닌 세포 자극 호르몬 유발 멜라닌 생성 억제 효과

배경/목표:천마(GEB)는 전통 한약재로서 한의학에서는 중풍, 중풍 등의 신경계 질환과 아토피성 피부염, 습진 등의 피부 질환에 광범위하게 사용되어 왔다. 이 연구는 쥐의 B16F10 흑색종에서 GEB 추출물이 멜라닌 생성 활성을 억제하는지 여부를 조사하기 위해 고안되었습니다.

관련 연구에 따르면, Cistanche는 "생명을 연장하는 기적의 허브"로 알려진 일반적인 허브입니다. 주성분은 시스타노사이드(cistanoside)로 항산화, 항염증, 면역기능 촉진 등 다양한 효능이 있다. cistanche와 피부 미백 사이의 메커니즘은 citanche glycosides의 항산화 효과에 있습니다. 인간 피부의 멜라닌은 티로시나제에 의해 촉매되는 티로신의 산화에 의해 생성되며, 산화 반응에는 산소의 참여가 필요하므로 체내의 산소가 없는 라디칼이 멜라닌 생성에 영향을 미치는 중요한 요인이 됩니다. Cistanche는 산화 방지제인 cistanoside를 함유하고 있으며 신체의 자유 라디칼 생성을 감소시켜 멜라닌 ​​생성을 억제할 수 있습니다.

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소개

인간의 피부색은 유전학 및 많은 요인, 주로 멜라닌의 양과 종류에 의해 영향을 받습니다. 멜라닌은 멜라닌 세포의 멜라노솜에서 생성되며, 햇빛, 스트레스, 멜라닌 자극 인자[예: 알파-멜라닌 세포 자극 호르몬(-MSH) , 산화질소 및 엔도텔린-1] [1,2]. 예를 들어, -MSH는 tyrosinase, tyrosinase-related protein(Trp)1, Trp2와 같은 멜라닌 세포 특이 효소의 강력한 유도제인 MITF(microphthalmia-associated transcription factor) 유도를 통해 멜라닌 생성을 촉진합니다[1]. 멜라닌 생성은 주로 멜라닌 생성을 위한 속도 제한 효소인 티로시나아제에 의해 조절되며, 이는 미코페놀레이트에 의한 티로신의 34-디하이드록시페닐알라닌(L-DOPA) 및 디페놀라아제에 의한 L-DOPA의 도파퀴논으로의 산화를 촉매합니다. 이는 유멜라닌과 페오멜라닌 생합성의 공통 단계입니다. 후속 단계는 유멜라닌(갈색/검은색 색소)을 생산하기 위한 2개의 추가 멜라닌 세포 특이 효소인 Trp1 및 Trp2(도파크롬 토토머라제라고도 함)와 페오멜라닌(적색/노란색 색소)을 생산하기 위한 시스테인/글루타티온 관련 비효소 단계와 관련됩니다. 안료), 각각. Hydroquinone[3,4], kojic acid[5], ascorbic acid[6], arbutin[7]과 같은 Tyrosinase inhibitor는 과색소침착 장애를 치료하는데 사용되어 왔지만 최근 인체에서 여러 가지 부작용이 보고되고 있다[1, 2]. 따라서, 부작용 없이 탈색을 유도할 수 있는 보다 안전하고 효과적인 천연 멜라닌 생성 억제제를 찾는 데 많은 관심이 쏠리고 있습니다.

엽록소가 없는 난초 식물인 Gastrodia elata Blume(GEB)는 발아와 성장/성숙을 위해 각각 공생 균류인 Mycena osmundicola와 Armillaria mellea가 필요합니다[8,9]. GEB는 신경퇴행성 질환(예: 마비, 현기증, 뇌졸중, 간질, 치매) 치료를 위한 한방 치료제로 사용되어 왔다[9,10]. 다양한 생리 활성 화합물이 GEB에서 분리되었으며, 가장 중요한 화합물은 가스트로딘, 4-하이드록시벤질 알코올, 4-하이드록시벤즈알데히드, 바닐린, 바닐릴 알코올 및 바닐산[{{6} }}]. 최근 GEB의 생리 활성 화합물이 티로시나제 활성 [13-16]에 대한 억제 효능을 갖는다고 보고되었습니다. 또한 최근 연구에서는 GEB에서 ergothioneine(Ergo)[8,11]과 diosgenin[17]을 확인했습니다. Ergo는 주로 버섯에서 발견되며[18,19], diosgenin은 야생 참마에서 발견됩니다[20]. 두 가지 모두 강력한 항산화 작용으로 2010년 항노화 크림에 함유된 식물원료 10위권에 이름을 올렸으며[21], GEB가 약용식품뿐만 아니라 기능성 화장품으로도 활용될 수 있음을 시사한다.

동결 건조 및 증기 건조 GEB의 조성[22], 화학 성분[11,12,23], 항산화제[12], 항혈소판 및 항혈전[24] 효과에 대한 보고가 있지만 거의 GEB 추출물이 B16F10 흑색종에서 멜라닌 합성 및 관련 효소에 대한 억제 효과에 대해 알려져 있다. GEB는 생체 활성 화합물과 항산화 특성으로 인해 신경 장애 및 피부 문제에 대한 전통적인 치료제로 사용되어 왔기 때문에 쥐의 B16F10 흑색종에서 멜라닌 함량과 티로시나아제 활성, 전사 인자 및 조절 효소의 분자 수준을 분석했습니다.

재료 및 방법

천마(GEB) 추출물의 제조

세포 배양

세포 생존율 분석

B16F10 세포를 24-웰 플레이트에 4 × 104 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 100% 컨플루언트 세포는 200 nM -MSH(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 처리 후 0-25 mg/mL의 GEB 추출물로 24시간 동안 전처리하였다. 배지를 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT; Amresco, Solon, OH, USA)로 교체했습니다. ) 염료 용액[인산염 완충 식염수(PBS) 중 5 mg/mL]을 37도에서 3시간 동안. 상청액을 따라내고 포르마잔 염을 500 μL 이소프로판올에 용해시켰다. 분광광도계(Gen5.2; Biotek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

멜라닌 함량 분석

B16F10 세포는 200 nM -MSH를 24시간 처리하거나 처리하지 않은 후 0-5 mg/mL GEB 추출물 또는 400 ug/mL 알부틴(양성 대조군; Sigma-Aldrich)으로 72시간 동안 처리하였다. 세포를 1X PBS로 2회 세척한 후 RIPA(radioimmunoprecipitation assay) 용해 완충액(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)에서 용해하고 14000 rpm에서 10분 동안 25도에서 원심분리했습니다. 펠릿(대략 105개 세포)을 10% 디메틸 설폭사이드를 포함하는 1mL의 1N NaOH에 80도에서 2시간 동안 용해시켰다. 상청액의 흡광도는 470 nm에서 측정되었다. 샘플의 멜라닌 농도는 합성 멜라닌(Sigma-Aldrich) 표준 곡선에서 파생되었습니다. Pierce® BCA 방법(Thermo Scientific)을 사용하여 각 샘플을 총 세포 단백질 함량으로 정규화했습니다.

티로시나제 활성 측정

B16F10 세포는 24시간 동안 200 nM -MSH 유무에 관계없이 0-5 mg/mL GEB 추출물 또는 400 ug/mL 알부틴(양성 대조군)으로 72시간 동안 처리하였다. 세포를 1X PBS로 2회 세척한 후 RIPA 용해 완충액(Thermo Scientific)에서 용해하고 15000 rpm에서 20분 동안 4도에서 원심분리했습니다. 상등액(100 μL)을 96-웰 플레이트에 넣고 100 μL의 5 mM L-DOPA와 혼합하고 37도에서 2시간 동안 배양하였다. 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. Pierce® BCA 방법(Thermo Scientific)을 사용하여 각 샘플을 총 세포 단백질 함량으로 정규화했습니다.

실시간 중합효소연쇄반응 분석(real time-PCR)

B16F10 세포는 24시간 동안 200 nM -MSH 유무에 관계없이 0-5 mg/mL GEB 추출물 또는 400 ug/mL 알부틴(양성 대조군)으로 72시간 동안 처리하였다. Trizol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)과 RNA 추출 키트(RNase Mini kit, Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 세포의 총 RNA를 분리하였다. 총 RNA(2 ug)는 역전사 마스터 프리믹스(ELPIS, Daejeon, Korea)를 사용하여 역전사하였다. 실시간 PCR(LightCycler 96; Roche, Indianapolis, IN, USA)은 다음 프라이머를 사용하여 수행되었습니다. 티로시나아제 전방 5'-ATAGGTGCATTGGCTTCTGG-3', 후방 5'-CCAACGATCCCATTTTTCTT-3'; Trp1 앞으로 5'-GAGTGACATCCTGTGCTCA-3', 뒤로 5'-CGATACCCTGGGAACACTTT-3'; Trp2 앞으로 5'-GCATCTGTGGAAGGGTTGTT-3', 뒤로 5'-ACTCCTTCCTGAATGGGACC-3'; 글리세르알데히드 3-인산 탈수소효소(GAPDH) 전방 5'-TCAATGAAGGGGTCGTTGAT-3', 후방 5'-CGTCCCGTAGACAAAATGGT-3'. 발현 수준은 GAPDH의 수준으로 정규화되었다.

웨스턴 블롯 분석

통계 분석

결과

Gastrodia elata Blume (GEB)가 B16F10 세포의 세포 생존력에 미치는 영향

GEB 추출물의 잠재적인 독성을 조사하기 위해 먼저 200nM -MSH를 처리하거나 처리하지 않은 후 24시간 동안 다양한 농도(0-25mg/mL)의 GEB 추출물과 함께 B16F10 세포를 배양하여 GEB 세포 독성을 평가했습니다. 시간. -MSH 자극과 무관하게 세포 생존력은 낮은 GEB 농도(0.5-5 mg/mL)에 의해 억제되지 않은 반면, 높은 농도(10-25 mg/mL)는 독성을 유의하게 유도했습니다(그림 1). GEB 10 및 25mg/mL에서 세포 생존율은 미처리 대조군의 각각 85.9% 및 68.7%였습니다. -MSH 자극 후 GEB의 10 및 25mg/mL에서 세포 생존율은 처리되지 않은 대조군의 각각 89.9% 및 65.3%였습니다. 따라서 추가 실험에서는 0-5mg/mL의 농도를 사용했습니다.

Gastrodia elata Blume (GEB)가 B16F10 세포에서 멜라닌 합성 및 티로시나제 활성에 미치는 영향

GEB 추출물의 멜라닌 생성 활성을 평가하기 위해 -MSH 미처리 및 -MSH 처리 B16F10 세포 모두에서 멜라닌 함량을 측정했습니다. 세포를 24시간 동안 -MSH 유무에 관계없이 전처리한 후 0-5 mg/mL 또는 400 ug/mL 알부틴 용량의 GEB 추출물로 72시간 동안 처리했습니다. GEB 처리는 -MSH 처리군과 모든 -MSH 비처리군에서 고용량(2-5mg/mL)에서 용량 의존적으로 세포 멜라닌 함량을 유의하게 감소시켰다. -MSH 단독은 대조군에 비해 멜라닌 함량을 180% 증가시켰고, GEB 처리는 -MSH로 유도된 과색소침착 상태에서 -MSH 미처리군에 비해 용량 의존적으로 멜라닌 합성을 현저하게 억제하였다(도 2).

티로시나아제는 멜라닌 합성의 속도 제한 효소이기 때문에 GEB 추출물이 B16F10 세포의 세포 티로시나아제 활성에 미치는 억제 효과를 확인했습니다. -MSH는 B16F10 세포에서 티로시나아제 활성을 171.2%까지 유도했습니다. -MSH 처리와 상관없이 GEB 추출물은 tyrosinase 활성을 유의하게 억제하였다. 알부틴은 티로시나제 경로[7]를 통한 멜라닌 합성 억제제로 잘 알려져 있으며, -MSH-미처리 그룹과 -MSH-처리 그룹 모두에서 미처리 대조군에 비해 35-40% 크게 억제되었습니다(그림 3). . 2 및 5 mg/mL에서 GEB 추출물의 멜라닌 함량 및 티로시나아제 활성은 400 ug/mL 알부틴의 것과 유사하여 GEB가 양성 대조군 수준으로 용량 의존적 항멜라닌 생성 활성을 나타내고 이러한 멜라닌 생성 억제가 GEB 추출물에 의한 감소는 세포 티로시나제 활성 감소와 관련이 있습니다(그림 3).

Gastrodia elata Blume (GEB)가 B16F10 세포에서 MITF, tyrosinase, Trp1, Trp2의 mRNA 수준과 단백질 발현에 미치는 영향

GEB 추출물에 의한 멜라닌 합성 억제가 멜라닌 생성 관련 유전자 발현과 관련이 있는지 확인하기 위해 실시간 PCR을 수행하여 MITF, tyrosinase, Trp1 및 Trp2의 mRNA 수준을 조사했습니다. 이러한 모든 유전자의 mRNA 수준은 GEB 추출물에 의해 -MSH 미처리군과 -MSH 처리군 모두에서 용량 의존적으로 감소하는 경향이 있었지만, -MSH 미처리 세포에서는 무시할만한 수준이었다. MITF, tyrosinase, Trp1 및 Trp2의 분자 수준은 낮은 GEB 농도(0.5-1 mg/mL)에서 억제되었고 높은 농도(2-5 mg /mL) -MSH-미처리 세포에서. -MSH는 이들 유전자의 mRNA 수준을 현저하게 유도했지만 GEB 추출물은 이를 감소시켰다. -MSH 처리된 세포에서도 낮은 용량의 GEB 추출물은 MITF, 티로시나제, Trp1 및 Trp2 mRNA 수준을 감소시키는 경향이 있는 반면, 높은 용량의 GEB 추출물은 이러한 모든 유전자의 mRNA 수준을 상당히 억제했습니다. 더 높은 용량에서 GEB 추출물의 억제 수준은 화장품에서 잘 알려진 피부 미백 성분인 알부틴과 유사했습니다(그림 4).

또한 웨스턴 블롯 분석을 통해 이 전사 인자와 멜라닌 생성 효소의 단백질 발현을 평가했습니다. -MSH 처리는 이러한 모든 유전자의 단백질 발현 및 mRNA 수준을 유의하게 유도했으며, 이는 용량 의존적 방식으로 회복되었습니다. GEB 추출물의 저용량은 -MSH로 유도된 MITF, 티로시나제, Trp1 및 Trp2의 단백질 발현을 감소시키는 경향이 있는 반면, 고용량은 -MSH로 처리된 B16F10 세포에서 용량 의존적으로 이러한 모든 마커를 유의하게 억제했습니다. 고용량에서 GEB 추출물의 억제 수준은 알부틴만큼 효과적이었습니다(그림 5).

논의

이 연구에서 우리는 GEB 추출물이 쥐의 B16F10 흑색종 세포에서 멜라닌 생성에 대한 억제 활성과 MITF, tyrosinase, Trp1 및 Trp2와 같은 관련 효소의 활성 및 분자 발현을 가지고 있음을 발견했습니다. 0.5-5 mg/mL 용량의 GEB 추출물은 용량 의존적으로 멜라닌 생성 관련 마커를 억제했습니다. 저용량(0.5-1 mg/mL)의 GEB 추출물은 멜라닌 생성, 티로시나제 활성, mRNA 수준, MITF, 티로시나제, Trp1 및 Trp2의 단백질 발현을 감소시키는 경향이 있는 반면 고용량({{12} } mg/mL)의 GEB 추출물은 -MSH-미처리 및 -MSH-처리 B16F10 모두에서 용량 의존적 방식으로 이러한 모든 마커 세포를 상당히 억제했습니다. 높은 농도에서 GEB 추출물의 이러한 억제 효과는 400 ug/mL 알부틴의 효과와 유사했습니다.

멜라닌은 멜라노솜에서 L-티로신으로 형성되며 피부, 머리카락, 눈의 특징적인 색상을 결정합니다[1]. 멜라닌은 자외선(UV)과 스트레스로부터 보호하는 역할을 하지만, 멜라닌 색소의 과잉 생산과 축적은 포유류에서 과색소침착과 주근깨, 검버섯, 기미와 같은 여러 피부 문제를 초래합니다[25]. 따라서, 멜라닌 생성 억제는 피부 탈색 및 미백의 의약 및 미용 치료에 대한 우려 사항이었습니다. 멜라노코르틴-1 수용체(MC1R)에 대한 -MSH의 결합은 사이클릭 아데노신 모노포스페이트(cAMP)를 증가시키고 이어서 MITF를 활성화합니다. MIFT는 구조적으로 40-45% 유사한 동일성을 공유하는 티로시나제, Trp1 및 Trp2를 포함한 멜라닌 생성 효소의 발현을 효과적으로 상향 조절합니다[1,2]. 무엇보다도 티로시나제 억제는 피부 색소침착 저하를 달성하기 위한 가장 일반적인 접근 방식입니다. 이 효소는 색소침착의 속도 제한 단계를 촉매하기 때문입니다. Trp1과 Trp2는 멜라닌의 결과적인 생합성에 관여합니다[1,2].

Lee et al. [26] 화장품용 식물 추출물 100종을 tyrosinase 및 DOPA auto-oxidation 억제 활성을 측정하여 스크리닝한 결과 Gastrodia elata, Chaenomeles speciosa, Dryopteris crassirrhizoma, Glycyrrhizaglabra, Morusalba, Myristicafragrans, Rheum palmatum, Sophora 등 많은 식물 추출물이 japonica는 버섯의 tyrosinase 활성을 억제하였다. Chenet al. [2] 또한 78종의 약용 식물을 선별하여 GEB의 뿌리 줄기가 티로시나제 활성을 억제할 수 있는 잠재력을 가지고 있음을 발견했습니다. GEB는 신경퇴행성 질환을 치료하기 위한 한방 치료제로 사용되어 왔지만, 이러한 스크리닝 연구에서 GEB를 티로시나제 억제제로 사용할 가능성이 높다.

최근 연구[9]에서는 다양한 크로마토그래피 기술을 사용하여 64개의 GEB 구성 요소를 보고했습니다. 그중 가장 중요한 페놀 화합물은 가스트로딘[4-(-d-glucopyranosyloxy) benzyl alcohol], 4-hydroxy benzyl alcohol(4-HBA), 4-hydroxy- 벤즈알데히드, 바닐린(4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde), 바닐릴 알코올(4-(hydroxymethyl)-2-methoxyphenyl) 및 바닐산(4-hydroxy{{14 }}메톡시벤조산) [8-12]. 최근 GEB에서 새로운 천연 화합물이 발견되었습니다. bis (4- hydroxyphenyl) sulfide [2], Ergo [8] 및 diosgenin [17]. 하이드로퀴논의 구조와 GEB의 주요 페놀 화합물은 매우 유사합니다[27]. 히드로퀴논의 수산기(-OH)는 4-HBA[27]에서 히드록시메틸기(-CH2OH)로 치환되고 4-hydroxybenzaldehyde에서 카르보닐기(-CHO)로 치환됩니다. 메톡시기(-OCH3)가 하이드로퀴논에 첨가되어 각각 바닐릴 알코올을 형성하고 4-하이드록시벤즈알데히드에 첨가되어 바닐린을 형성합니다. 바닐산은 산화된 형태의 바닐린입니다.

최근 연구에 따르면 대부분의 이러한 화합물은 B16[14,28] 및 HM3KO 흑색종 세포[13], 정상 인간 포피 섬유아세포[29] 및 생체 내 제브라피시 모델[2,29]에서 버섯 티로시나제 및 멜라닌 생성에 대한 억제 활성을 발휘한다고 보고되었습니다. 예를 들어, 부탄올 추출 GEB에서 분리된 페놀 분획[14]은 티로시나제, Trp1 및 Trp2의 활성과 이들 효소의 mRNA 및 단백질 발현을 감소시켜 멜라닌 ​​생성에 억제 효과를 발휘했습니다. Gastrodin[15]과 4-HBA[16]는 B16 흑색종 세포에서 tyrosinase 활성을 억제하여 멜라닌 생성을 억제했습니다. gastrodin과 4-HBA의 수산기는 주로 tyrosinase 활성 부위의 히스티딘 잔기와 상호작용하여 tyrosinase 활성을 억제합니다[30]. 4-HBA의 페놀성 OH의 산소는 친핵성 공격에 의해 티로시나아제의 촉매 활성에 영향을 미칩니다[31]. 바닐산과 바닐릴 알코올의 하이드록시 및 메톡시 그룹은 티로시나아제의 디페네놀라제 활성의 억제제로 작용하며[32] 특히 바닐릴 알코올의 CH2OH가 -COOH(바닐산)로 전환되어 티로시나아제 억제가 현저하게 증가합니다[32]. ]. Origanum vulgare에서 분리한 바닐산은 -MSH로 자극된 B16F10 세포에서 세포 티로시나아제 활성, DOPA 산화효소 및 멜라닌 함량을 감소시켰을 뿐만 아니라 MC1R, MITF, Trp1 및 Trp2의 발현을 하향 조절했습니다. 바닐린은 티로시나제 활성 억제를 나타내지 않았습니다[29]. 최근 GEB에서 분리된 천연물인 bis(4-hydroxy benzyl)sulfide는 비스({{ 전산 분자 모델링을 통한 티로시나아제의 활성 부위에 구리 이온이 있는 33}}히드록시 벤질) 황화물[2]. 이러한 결과는 GEB의 다양한 페놀성 화합물이 티로시나제의 활성 부위에 있는 구리 이온 및/또는 히스티딘 잔기와 상호작용하여 티로시나제 억제제로 작용할 수 있음을 시사합니다.

에르고와 디오스게닌은 2010년 안티에이징 크림의 10대 식물성 성분 중 하나로 선정되었다[21]. Ergo는 최근 GEB에서 발견된 천연 수용성 티올 아미노산[18,19]입니다[8]. 생리적 pH에서 Ergo는 주로 티올(-SH) 형태가 아닌 티온(= S) 형태로 존재합니다[19]. 그것의 느린 분해, 이황화물 형성에 대한 저항성 및 자동 산화는 글루타티온보다 더 안정적입니다[18,19]. Ergo에서 황으로 치환된 이미다졸 고리의 존재는 용량 의존적으로 버섯 티로시나제 활성을 억제했습니다[33]. 또 다른 화합물인 야생 참마(Dioscorea villosa) 추출물의 diosgenin은 탈색 효과가 있으므로 기미, 흑색 피부염 및 일광흑자에 사용할 수 있습니다[34]. 흑색종 세포에 대한 연구에서 탈색 효과가 세포의 포스파티딜이노시톨- 4,5-비스포스페이트3-키나아제 경로의 활성화와 관련이 있다는 사실이 밝혀졌으며, 이는 디오스게닌이 효과적인 억제제일 수 있음을 시사합니다. 과색소침착의 [34]. 또한 항콜라게나제 활성을 유도하여 항염증 및 항노화 특성을 갖는다[35].

멜라닌 생성의 조절과 관련된 적어도 세 가지 가능한 신호 경로가 있습니다. cAMP 의존성, Wnt 및 세포외 신호 조절 키나아제 신호 전달 경로[1]. 이러한 모든 신호 경로는 MITF 발현 및/또는 활성을 통해 멜라닌 생성 관련 효소, 즉 티로시나제, Trp1 및 Trp2를 조절합니다[1]. GEB에 의한 멜라닌 생성 억제에 이러한 신호 경로가 관여할 가능성은 앞으로 계속 연구될 것입니다.

이해 상충

참조

자세한 정보: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501