희귀 Rs35667974 IFIH1 유전자 다형성과 자가 면역 질환의 연관성은 RNA 후성 유전학의 사례입니까?
Jul 13, 2023
시각화 - AA, AP 및 EEE, 감독 - EEE 및 자금 조달 - EEE. 모든 저자는 원고의 출판된 버전을 읽고 이에 동의했습니다. 추상적인
헬리카제 C 도메인 함유 단백질 1(IFIH1) 유전자로 유도된 인터페론은 흑색종 분화 관련 5(MDA5)로 알려진 세포질 RNA 헬리카제를 암호화하며, RIG-1- 유사 RNA 헬리카제는 바이러스 RNA를 인식하고 선천적인 바이러스 RNA 인식을 통한 면역. 이중 가닥(ds) RNA에 결합하면 MDA5는 dsRNA의 길이를 따라 필라멘트 어셈블리를 형성하고 분자 서명을 활용하여 dsRNA 길이와 메틸화에 따라 자기와 비자기를 구별합니다. 그것의 미스센스 변이체 rs35667974는 1형 당뇨병, 건선 및 건선성 관절염을 예방하지만 강직성 척추염, 크론병 및 궤양성 대장염의 위험 증가와 관련이 있는 것으로 밝혀졌습니다. 이 변종의 복잡한 역할에 대한 통찰력을 얻기 위해 분자 역학 시뮬레이션을 사용하여 dsRNA와 복잡한 MDA5의 구조 분석을 수행했습니다.
우리의 데이터는 rs35667974 변이체의 Ile923Val 돌연변이가 천연 dsRNA에 대한 결합에 크게 영향을 미치지 않지만 2'-O 우리딘 메틸화의 존재 하에서 불안정화 효과를 나타냄을 시사합니다. 따라서, dsRNA에서 2'-O-메틸화의 존재는 전체 MDA 촉매 활성의 선택적 감소를 유도하는 감지 신호를 도입합니다. 이 연구는 변형된 MDA5 표현형의 촉매 활성을 선택적으로 감소시키는 것으로 보고된 자가 면역 유전자좌 IFIH1의 공유 rs35667974 변이체의 역할에 대한 평가를 나타내며, 결과적으로 사이토카인 및 케모카인 신호 전달에 대한 부정적인 피드백과 자가 면역에 대한 선택적 보호를 감소시킵니다. .
helicase C 도메인은 DNA 이중 나선 구조를 풀 수 있는 중요한 효소 단백질입니다. 세포 복제, 수리 및 전사 과정에서 DNA가 올바른 복제, 편집 및 전달을 완료하도록 도울 수 있으며 세포의 정상적인 기능에 대한 핵심 중 하나입니다. 동시에 면역은 인체의 매우 중요한 방어 메커니즘으로 박테리아 및 바이러스와 같은 병원균으로부터 우리를 효과적으로 보호할 수 있습니다.
연구에 따르면 헬리카제 C 도메인은 면역에 중요한 역할을 합니다. 먼저 helicase C 도메인은 세포 DNA의 정상적인 복제, 복구 및 전사를 도와 유전자의 안정성과 코딩 효율을 보장하여 인체의 면역성을 향상시킬 수 있습니다. 둘째, 헬리카제 C 도메인은 세포에 의한 단백질 이질성 분자의 인식을 촉진하고 면역 체계의 신호 전달을 조절하여 신체의 방어 기능을 지원할 수 있습니다. 위의 두 가지 방법 모두 면역 유지 및 증진 촉진에 긍정적인 역할을 하였다.
또한, 헬리카제 C 도메인과 면역과의 관계에 대한 심층 연구는 암 및 면역 관련 질병 치료를 위한 신약 개발에 중요한 영감을 제공합니다. 헬리카제 C 도메인을 표적으로 하는 약물 개발 및 유전자 치료는 암 및 기타 면역 관련 질병에 대한 신체의 저항력을 향상시키고 환자가 관련 질병의 치료 및 회복에 더 잘 대처할 수 있도록 도울 수 있습니다.
요약하면, 헬리카제 C 도메인과 면역의 관계는 매우 밀접하며, 유전자 안정성 확보, 세포 면역 촉진, 신체 방어 지원에 중요한 역할을 합니다. 관련 연구 및 치료 방법을 통해 인간의 면역을 더 잘 유지 및 강화하고 더 건강하고 더 나은 삶을 만들 수 있기를 바랍니다. 이런 관점에서 우리는 개인의 면역력을 높여야 합니다. 미트 페이스트에는 비타민 C, 비타민 C, 카로티노이드 등과 같은 다양한 항산화 물질이 풍부하기 때문에 Cistanche는 면역력 향상에 상당한 효과가 있습니다. 이러한 성분은 자유 라디칼을 제거하고 산화 스트레스를 줄일 수 있습니다. 면역 체계의 저항력을 자극하고 개선합니다.
키워드
단일 염기 다형성(SNP) · 분자 모델 · 헬리카제 C 도메인 1(IFIH1)로 유도된 인터페론 · 흑색종 분화 관련 5(MDA5) · RNA 메틸화.
소개
인구의 약 5%에 영향을 미치는 자가면역 질환과 관련된 유전자 및 메커니즘은 여전히 애매하지만 축적된 데이터는 다양한 자가면역 질환이 공통의 유전적 배경을 공유할 수 있음을 강력하게 시사하므로 다양한 자가면역 질환이 공유하는 변이의 존재를 지적합니다. (Zhernakova 외. 2009). 이 유전 정보를 질병으로 이어지는 생물학적으로 의미 있는 메커니즘으로 풀어내려는 시도는 원인 유전자를 식별하는 것을 의미합니다. 질병을 유발하는 변이체를 식별하는 것은 어렵지만 질병 예측, 예방 및 개입을 위한 효과적인 방법을 확립하려는 시도에서 필요한 작업입니다(Biros et al. 2005).
다양한 유형의 RNA 분자는 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA(tRNA), 리보솜 RNA(rRNA), 마이크로RNA(miRNA) 및 긴 비암호화 RNA(lncRNA)를 비롯한 여러 생물학적 과정의 조절에 관여합니다. RNA 분자는 수많은(150개 이상) 화학적 변형을 포함합니다(Machnicka et al. 2013; Boccaletto et al. 2018). 이러한 변형은 구조, 안정성 및 상호 작용과 같은 RNA 대사의 모든 단계와 기능적으로 연결되어 있으며 바이러스 복제 및 항바이러스 면역 반응 조절과 같은 여러 생물학적 과정에서 중요한 역할을 합니다(Machnicka et al. 2013). 그 중 리보스 메틸화는 RNA에서 발견되는 가장 보편적인 변형 중 하나입니다. 2'-O-메틸우리딘은 Archaea, Bacteria 및 Eukaryota의 rRNA, snRNA, snoRNA 및 tRNA에서 발견됩니다(Aučynaitė et al. 2018). 리보스-2'-O메틸화는 뉴클레오티드의 소수성을 증가시키고 뉴클레아제의 작용으로부터 보호합니다(Yildirim et al. 2014).
축적된 증거는 바이러스 RNA(2'OMe-RNA)의 2'-O-메틸화가 숙주 세포에서 세포 선천성 면역 반응의 회피에 중요한 역할을 한다는 것을 나타냅니다(Dimitrova et al. 2019). Züst와 동료들은 바이러스 RNA의 2'OMe가 인터페론(IFN) 매개 항바이러스 반응의 회피에 기여하여 바이러스 복제를 촉진한다는 것을 보여주었습니다(Züst et al. 2011). 또한 Vitali와 Scadden은 IU-dsDNA가 MDA5 IFN 자극 경로를 억제한다고 제안했습니다(Vitali and Scadden 2010).
헬리카제 C 도메인 1(IFIH1) 유전자로 유도된 인터페론은 MDA5(흑색종 분화 관련 단백질 5)로도 알려진 세포질 RNA 헬리카제를 암호화하며 선천 면역에서 항바이러스 기능을 수행하는 RIG-I 유사 수용체(RLR)입니다. 바이러스 RNA를 검출함으로써 MDA5는 일반적으로 피코나바이러스 복제 중에 형성되고 바이러스 감염에 대한 면역 반응을 매개하는 0.5–1kb RNA 이중 줄기 구조를 인식합니다(Nejentsev et al. 2009; Crow 2011). MDA5는 picornavirus의 복제 중에 생성된 긴 바이러스 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 감지하면 I형 인터페론 신호 전달 경로를 활성화합니다. 연구에 따르면 MDA5는 dsRNA의 길이를 따라 필라멘트를 형성하고 ATP 의존 필라멘트 역학을 활용하여 dsRNA 길이에 따라 자기와 비자기를 구별합니다(Toro et al. 2015). MDA5는 사이토카인과 케모카인의 국소 생산을 통해 세포와 선천/적응 면역 시스템 간의 누화 조절에 관여하는 것으로 나타났습니다.
MDA5 발현 및/또는 활동의 변화는 바이러스 복제의 부산물인 dsRNA에 대한 세포 반응을 유발할 수 있습니다(Colli et al. 2010). 또한 플라멘트 형성 관련 잔기의 돌연변이는 필라멘트 형성 및 MDA5- 의존적 신호의 손실을 초래하지만, 신호를 적당히 향상시키는 한 쌍의 돌연변이를 제외하고는 것으로 나타났습니다. 이러한 결과는 ATP 독립적인 메커니즘, 즉 보다 긴밀한 RNA 결합 및/또는 보다 안정적인 단백질-단백질 상호 작용이 시험관 내에서 관찰된 MDA5 필라멘트 형성의 안정성과 세포에서 더 높은 신호 활성에 원인이 될 수 있음을 시사합니다(Sohn 및 허 2016).
Smythet al. (2006) 및 Nejentsev 외. (2009)은 1형 당뇨병(T1D)으로부터 보호를 부여하는 IFIH1 유전자의 희귀 대립유전자를 설명했습니다. 위치 #923에서 보존된 이소류신(코돈[ATT])이 발린(코돈[GTT])으로 변경되는 이 rs35667974 IFIH1 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)은 소수 대립유전자 빈도(MAF)가 C {{ 9}}.010031(264690의 총 샘플에서 2655 개체) TOPMED(Taliun et al. 2021) 및 C = 0.016267(205514의 총 샘플에서 3343 개체) ALFA(Phan et al. 외 2020; Sherry 외 2001). 표 1에는 ALFA 프로젝트 데이터(Phan et al. 2020; Sherry et al. 2001)를 기반으로 한 여러 대륙 지역의 다형성 빈도에 대한 인간 생물 지리학이 제시되어 있습니다. 후속 연구에서 이 희귀한 대립유전자가 T1D, 건선(PS)(Li et al. 2010) 및 건선성 관절염(PsA)(Budu-Aggrey et al. 2017)에 동일한 효과가 있음을 확인했습니다. 반대로, 이 SNP는 발달 강직성 척추염(AS)(Ellinghaus et al. 2016), 크론병(CD)(Ellinghaus et al. 2016; Budu-Aggrey et al. 2017)의 감수성에 대한 위험 인자로 연관되었습니다. ) 및 궤양성 대장염(UC)(Ellinghaus et al. 2016; Budu-Aggrey et al. 2017).
Chistiakovet al. (2010)은 MDA5의 기능 상실 돌연변이 E627X 및 I923V가 1형 당뇨병 환자의 말초 혈액 단핵 세포에서 낮은 폴리(I:C)로 유도된 인터페론 생산과 연관되어 있으므로 T1D를 보호한다는 것을 보여주었습니다. 또한 MDA5 분자에서 I923V 아미노산 치환은 dsRNA의 결합에 기여하는 H927 잔기 부근에 존재한다고 명시되어 있습니다(Yoneyama and Fujita 2008). 그러나 MDA 변이체 I923V는 dsRNA에 결합하는 정상적인 능력을 가지고 있지만 촉매 활성이 2.5-배 감소된 것으로 나타났습니다(Shigemoto et al. 2009). 따라서 이 다형성은 이 세포질 RNA 감지 헬리카제의 뉴클레오티드 결합 특성에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 보이지만 여전히 알려지지 않은 메커니즘에 의해 기능을 변경합니다.
T1D에서 IFHI1 다형성과 엔테로바이러스 감염 발생 사이의 관계와 T1D 환자에서 MDA5 I923V 변이체와 엔테로바이러스 RNA의 빈도 사이의 연관성이 발견되었습니다(Looney et al. 2015). 또한, MDA5- 및 MAVSknockout 마우스에 대한 최근 연구는 Coxsackie B 바이러스에 대한 유형 1 인터페론 반응을 매개하는 이들 단백질의 중요한 역할을 보여주었습니다(Wang et al. 2010). Mengovirus 리더 단백질은 이 인자의 활성화에 필요한 IRF3의 이합체화를 차단함으로써 IFN-의 발현을 방지하는 것으로 나타났습니다(Hato et al. 2007). 이 관찰은 숙주 항바이러스 반응에서 IFIH1 기능을 방해하는 변이체가 T1D로부터의 보호를 부여하기 때문에 양성 선택이 아니라 음성 선택임을 시사합니다(Crow 2011).
Chow et al. (2018)은 RIG-I 유사 수용체를 광범위하게 분석한 반면 Brisse 및 Ly(2019)는 MDA5 및 관련 RIG-I의 진화 및 종분화를 광범위하게 검토했습니다. RNA-결합 및 ATP-결합 부위 또는 필라멘트 계면 내 또는 근처의 변경된 잔기의 위치는 관찰된 돌연변이가 IFIH1과 dsRNA 사이 또는 IFIH1 필라멘트의 분자를 감소시키거나 ATP 가수분해 효율을 감소시켜 필라멘트 분해 속도를 감소시킵니다(Rice et al. 2014).
이 작업은 IFIH1 유전자 단백질 산물 MDA5에서 Ile923Val 아미노산 치환을 암호화하는 기능 표현형을 억제하는 것으로 보고된 자가면역 유전자좌 IFIH1의 공유 rs35667974 변이체의 잠재적 역할에 대한 구조적 연구를 나타냅니다. 후자는 자가면역으로부터 보호하는 사이토카인 및 케모카인의 국소 발현 제어에 영향을 미치는 여러 질병 사이에서 공유되는 생물학적으로 그럴듯한 인과 후보 유전자입니다(Colli et al. 2010). 이 작업은 Ile923Val 대체가 인간 MDA5의 촉매 활성을 감소시키는 알려지지 않은 정지 메커니즘을 탐색하는 것을 목표로 합니다. 이 연구에서 우리는 염증 메커니즘의 개시에서 천연 및 희귀 변종 Ile923Val 사이의 dsRNA와 MDA5의 상호 작용의 차이를 조사했습니다. 따라서 우리는 uracil 2'-O가 메틸화되었는지 여부에 따라 Ile923 또는 Val923이 존재하는 수성 환경에서 인간 MDA5/dsRNA 복합체의 동적 거동을 조사하는 것을 목표로 했습니다. 희귀한 공유 유전적 감수성 또는 보호 유전자좌에 대한 이러한 구조적 분석은 자가면역 질환의 병리생리학에 대한 우리의 이해에 대한 통찰력을 제공할 수 있으며 연구 결과는 연구 중인 질병의 더 나은 관리에 영향을 미칠 수 있습니다.
재료 및 방법
서열 검색, 계통수 구성 및 양성 선택 분석
Homo sapiens의 단백질 서열(서열 ID: NP_071451.2)은 UniProt 데이터베이스(The UniProt Consortium 2021)에서 검색되었습니다. 종 전체에서 동족체를 찾기 위해 Blastp(단백질-단백질 BLAST)를 사용하여 RefSeq 및 NR 단백질 데이터베이스(및 PDB 및 UniProt)에서 Mega BLAST(National Center for Biotechnology Information, NCBI, Bethesda, MD, USA)로 BLAST 검색을 수행했습니다. 기본 매개변수(Altschul et al. 1997). 인간 MDA5 단백질에 대한 1000개의 상동체가 초기에 선택되었고 인간 I923V 치환 주위의 서열을 포함하는 C-말단 도메인에 초점을 맞춘 종간 선택을 사용하여 다른 종에서 이러한 변이를 확인했습니다. Clustal Omega, 다중 서열 정렬 프로그램(Clustal-O)(Sievers et al. 2011) 및 T-Cofee 다중 서열 정렬 서버(Notredame et al. 2000; Di Tommaso et al. 2011)를 사용하여 단백질 서열 정렬을 수행했습니다. Unipro UGENE 플랫폼 생물 정보학 소프트웨어(Okonechnikov et al. 2012)는 다중 정렬을 선택적으로 시각화합니다.
진화 분석은 종 전체에 걸쳐 심하게 보존된 단백질 서열의 위치를 식별하는 데 사용되며 구조적 중요성을 나타냅니다(Andreou et al. 2018). 계통발생수는 Maximum Likelihood 방법(Nei and Kumar 2000)과 Tamura–Nei 모델(Tamura and Nei 1993)을 사용하여 500개의 부트스트랩 복제(Felsenstein 1985)를 사용하여 구성되었습니다. 휴리스틱 검색을 위한 초기 트리는 Tamura-Nei 모델을 사용하여 추정된 쌍별 거리의 행렬에 Neighbor-Join 및 BioNJ 알고리즘을 적용한 다음 로그 우도 값이 우수한 토폴로지를 선택하여 자동으로 얻었습니다. 계통발생학적 분석은 인간 IFIH1 유전자의 52개의 상동 뉴클레오티드 서열(39개의 오르토로그 및 13개의 파라로그)을 포함하였다. 포함된 코돈 위치는 1st + 2nd + 3rd + Noncoding이었습니다. 최종 데이터 세트에는 총 3729개의 위치가 있습니다. MEGA11 소프트웨어 패키지를 사용하여 진화 분석을 수행했습니다(Tamura et al. 2021).
IFIH1 유전자가 적응적으로 진화했는지 여부를 감지하기 위해 PAML v4.9j 소프트웨어 패키지의 codeml 프로그램을 사용했습니다(Yang 2007). 뉴클레오타이드 서열 및 상응하는 단백질 서열 정렬 파일은 적절한 CODEML 입력 뉴클레오타이드 정렬 파일을 형성하기 위해 PAL2NAL(Suyama et al. 2006)에 제출되었습니다. ortholog MDA5 유전자에 대한 양성 선택 분석은 사이트 및 분기 사이트 모델을 사용하여 수행되었습니다(Yang et al. 2005; Yang and Bielawski 2000). 비동의/동의 대체율 비율(ω=dN/dS)은 아미노산 수준에서 선택적 압력을 측정합니다. dN/dS(ω) 값의 크기는 선택 유형을 나타냅니다. ω<1 for negative selection, ω=1 for neutral selection, and ω>양성 선택의 경우 1(Yang et al. 2005). CODEML에서 사이트 모델(M0, M1, M2, M3, M7 및 M8)과 분기 사이트 모델(Clades A 및 C)을 선택하여 양성 선택 분석을 수행했습니다(Bielawski and Yang 2004; Yang and Nielsen 2002). 사이트 모델에서 세 쌍의 모델(M0/M3, M2/M1 및 M7/M8)을 비교하여 양성 선택을 테스트하기 위해 우도비 테스트(LRT)를 사용했습니다. 전체 길이 서열 및 C-말단 도메인(CTD) 서열 모두에 대해 분석을 수행하였다.
구조 분석 및 분자 역학 시뮬레이션
ATP(PDB ID: 6GKM)(Yu et al. 2018)(Berman et al. 2000)의 존재 하에서 hMDA5-dsRNA 필라멘트의 저온 전자 현미경(cryo-EM) 구조는 분자 동역학을 위한 모델 시스템으로 사용되었습니다. MD) 시뮬레이션. 모든 단백질 잔기(307-1020)가 분해되었고, dsRNA(double-stranded RNA)의 14개 염기쌍과 조정된 아연은 유지된 반면 누락된 잔기는 SWISS-MODEL 서버를 사용하여 모델링되었습니다(Waterhouse et al. 2018). 역장 매개변수와 수소 원자는 AMBER 18의 XLEaP 모듈을 사용하여 추가되었습니다(Case et al. 2005). AMBER force field f14SB(Maier et al. 2015) 및 f99OL3(Zgarbová et al. 2011)은 수정된 뉴클레오사이드에 대한 modrna08(Aduri et al. 2007) 매개변수와 함께 단백질 및 RNA에 각각 사용되었습니다. I923V 돌연변이는 I923의 Cδ 메틸 그룹을 수동으로 제거하여 MDA5에 도입한 반면 U12의 변형된 리보스는 modrna08 라이브러리 잔기 MRU를 사용하여 2'-O에서 메틸화되었습니다. 아연 이온은 4개의 시스테인 잔기 907, 910, 962 및 964와 결합되어 사면체 배위 구(Zn-S 결합 길이 2.35Å, 50kcal·mol-1·Å-2 힘 상수 및 S–Zn–S 각도 109.5도, 25kcal·mol–1·rad–2).
이러한 방식으로 MD 시뮬레이션을 위한 4개의 시스템을 준비했습니다. V923)-dsRNA(2'OMe). 모든 시스템은 미리 평형화된 TIP3P 물 분자의 잘린 팔면체 용매 상자에서 용매화되었으며, 복합체 주위에 최소 버퍼는 10 Å이고 시스템의 전하 중화를 얻기 위해 필요한 수의 카운터 이온을 추가했습니다. MD 시뮬레이션은 AMBER 18에서 GPU 가속 버전의 PMEMD(Salomon-Ferrer et al. 2013) 모듈과 2fs의 시간 간격으로 수행되었습니다. 온도는 충돌 빈도가 1.0ps-1인 Langevin 온도 조절 장치를 사용하여 조절되었으며 압력은 압력 완화 시간이 1.0ps인 Berendsen 바로스탯을 사용하여 조절되었습니다. SHAKE는 10-6Å의 공차로 수소 원자를 포함하는 결합을 제한하는 데 사용되었지만 비 결합 상호 작용은 10Å의 직접 공간 한계로 계산되었습니다.
에너지 최소화는 처음에 1{{20}},000 단계에 대해 100 kcal·mol–1·Å–2 힘 상수의 위치 제한으로 수행되었습니다. MDA5-dsRNA의 비수소 원자에서. 그런 다음 용질의 비수소 원자에 대한 구속을 유지하면서 NVT 및 NPT 앙상블(각각 100ps 및 400ps)의 짧은 시뮬레이션을 통해 용매를 300K 및 1atm에서 평형화했습니다. 그 후, 에너지 최소화를 10,000 단계 동안 수행했지만, MDA5의 C 원자와 dsRNA의 인산염 백본에서만 10 kcal·mol–1·Å–2의 위치 제한을 두었습니다. 3 sub에서는 1ns 동안 점진적으로 이완(10.0, 1.0, 0.1 kcal·mol–1·Å–2)한 다음 일정한 압력 하에서 9ns의 구속되지 않은 평형 상태를 유지했습니다. 이러한 초기 10ns의 평형화(분석에 사용되지 않음) 후, NPT 앙상블에서 100ns의 생산 시뮬레이션이 각 시스템에 대해 300K 및 1atm에서 수행되었으며, CPPTRAJ를 사용한 분석을 위해 5.0ps마다 시스템의 스냅샷을 저장했습니다. AMBER 18의 모듈(Roe and Cheatham 2013). 3D 모델을 묘사하는 모든 그림은 PyMOL 분자 그래픽 시스템(v.2.3 오픈 소스 빌드)을 사용하여 생성되었습니다.
결과
MDA5의 Ile923Val 치환의 계통발생학적 분석
MDA5 및 관련 RIG-I의 진화 및 종분화는 (Brisse and Ly 2019)에 의해 광범위하게 검토됩니다. 여기서 IFIH1 진화는 특정 다형성에 대한 MDA5 시퀀스의 보존 요소를 정의하는 데 사용되었습니다. 진화 분석은 RD/CTD 도메인에서 상이한 종의 MDA5(조사된 1000개의 서열 중 984개가 hMDA #923의 등가 위치에 이소류신을 가짐)의 무거운 서열 보존을 밝혀냈고, 이는 구조적/기능적 중요성을 나타냅니다. 인간 유전자의 엑손 14에 있는 다형성 rs35667974는 hMDA5에서 Ile에서 Val로 위치 923에서 보존된 아미노산 돌연변이를 일으킵니다. 그러나 MDA5의 RD/CTD 도메인과 isoforms X1의 밀접하게 동종인 RS/GY 도메인에서 종 전체에 걸쳐 이러한 변화의 생존 가능성을 나타내는 발린(그림 1)이 동일한 위치를 차지하는 또 다른 16개의 먼 종이 있습니다. X3 및 DHX58 헬리카제(그림 2). 또한, hMDA #923 위치 주변 영역의 서열 정렬(MDA CTD 상호작용 루프)은 먼 종 사이에서 보통에서 고도로 보존된 서열을 나타내며 종 전체에 걸쳐 해당 영역의 기능적 중요성을 나타냅니다.
포지티브 선택 감지
IFIH1 유전자가 적응적으로 진화했는지 여부를 확인하기 위해 사이트 모델과 분기 사이트 모델을 사용하여 전체 유전자 및 CTD 도메인의 오솔로그에 대한 양성 선택 분석을 수행했습니다. 사이트 모델에서 CTD 도메인에 대해 양성 선택 사이트가 확인되지 않았습니다(표 2). M0은 일정한 진화 속도(ω=dN/dS=0.2)를 의미합니다(표 2). RNA 상호 작용 영역과 CTD 도메인에는 없지만 전체 유전자에 대해 M 2- 및 M 8- 사이트 모델 방법을 사용하여 양성 선택을 거친 일부 사이트가 확인되었습니다 (Suppl. Table 1). 사이트 모델에서 ω(dN/dS)는<1 which indicates a highly conserved gene (Table 2, Suppl. Table 1). In the branch-site model, the human branch (as well as the primate's branch) was used as the foreground clade, the ω value was low, and no sites with posterior probability greater than 0.85 were identified (Suppl. Table 2).
특히 CTD 도메인에 대한 분기 사이트 모델 C(Suppl. Table 3)의 경우 사이트의 33%가 범주 ω0=0에서 진화하고 있습니다. 036. 이 카테고리에서 진화하는 사이트는 가지 유형을 구분하지 않기 때문에 두 가지 유형 모두 이 카테고리의 사이트에 대해 동일한 ω 값을 갖습니다. 또한 사이트의 55%가 ω2 범주로 진화하고 있습니다. 그러나 이들은 분기 유형(ω20=0.25 및 ω21=0)에 따라 조건부인 ω 값을 가집니다. 또한 39개의 직교 MDA5 유전자(Suppl. Table 4)에 대한 분기 사이트 모델 C의 경우 사이트의 33%가 범주 ω0=0에서 진화하고 있습니다. 027. 한편, 사이트의 41%는 카테고리 ω2로 진화하고 있습니다. 그러나 이들은 분기 유형(ω20=0.25 및 ω21=15.32)에 따라 조건부인 ω 값을 가집니다.
구조 분석
수행된 진화 분석은 Val이 다른 종에서도 MDA5 서열 위치에 존재하기 때문에 Ile923Val 대체가 인간 종에서 고유한 변이가 아님을 입증합니다. MDA5는 바이러스 RNA에 대한 뚜렷한 특이성을 통해 항바이러스 면역에서 핵심 역할을 하는 바이러스 이중 가닥 RNA(dsRNA) 수용체입니다(Wu et al. 2013). 바이러스 mRNA의 2'-O-메틸화가 선천적 면역 반응에 중요하다는 것이 밝혀졌으며, 따라서 2'-O-메틸화가 자기 mRNA와 비자기 mRNA의 구별을 위한 분자 표지라고 제안되었습니다. (Zust 외. 2011). Missense IFIH1 변형 rs35667974에서 Ile923Val 치환의 잠재적인 역할을 조사하기 위해 ATP(PDB ID: 6GKM)의 존재 하에서 MDA5-dsRNA 필라멘트의 저온 전자 현미경(cryo-EM) 구조를 분석했습니다(Yu et al. 2018). 위치 923은 dsRNA와 직접 상호 작용하는 루프 921–927에 있습니다(그림 3A). 특히, Ile923은 우리딘 U12의 2'-OΗ로부터 4.8Å에 위치하며, 인접한 His927과 우라실 염기 사이의 수소 결합을 통해 이들의 상호작용이 안정화된다. rs35667974 변이체에서 Val에 의한 Ile923의 치환은 우리딘 U12의 2'-ΟΗ와의 상호작용을 최소화하기보다는 임의의 입체적 충돌을 도입할 것으로 예상되지 않는다(도 3B). RNA가 U12의 리보스에서 메틸화되는 경우, Ile923이 있는 천연 MDA5 변이체는 3.6Å에서 U12의 2'-OMe 그룹과 유리한 반 데르 발스 접촉을 나타내는 반면(그림 3C) rs35667974 변이체의 Val923은 5.0Å에 위치(그림 3D). 이러한 차이는 Ile923Val 대체 자체의 주요 효과를 암시할 수 없습니다. 그러나 미묘한 구조적 변화는 종종 시스템의 구조적 동역학의 중단을 통해 중요한 기능적 변화로 이어집니다.
분자 역학 계산
네이티브 및 2'-O-메틸화된 dsRNA와의 상호작용에서 MDA5의 I923V 돌연변이의 효과를 조사하기 위해 100-ns 시간 척도에서 4개 시스템의 분자 동역학 시뮬레이션을 사용했습니다. 시스템의 동역학은 각 단백질 잔기의 평균 제곱근 변동(RMSF) 및 U12와 H927의 수소 결합 거리를 사용하여 모니터링되었습니다(그림 4). 우리의 계산은 MDA5에서 I923에서 V923으로의 돌연변이가 RNA 접촉 영역(잔기 923-934) 및 천연 dsRNA와의 복합체의 단백질간 상호작용 루프(950-955) 내의 역학에 약간의 교란을 초래했음을 시사합니다(그림 4C). . 이 관찰은 U12에서 2'-O-메틸화의 경우에도 유사했지만, MDA5 V923 돌연변이체의 카르복시-말단 영역의 전반적인 동역학에서 더 현저한 효과가 관찰되었다(도 4D).
이제 인접한 H927 잔기와 우라실 염기의 주요 수소 결합 상호 작용을 고려하면 MD 시뮬레이션은 2'-O에서의 메틸화가 기본 MDA5에 영향을 미치지 않는다는 것을 제안합니다 (그림 4E). 그러나, V923 돌연변이는 천연 dsRNA에서 H927의 수소 결합에 영향을 미치지 않지만 2'-O-메틸화의 존재 하에서 불안정화 효과를 나타냈다(도 4F). 종합하면, 우리의 MD 시뮬레이션은 천연 dsRNA와의 상호작용에서 MDA5의 I923V 돌연변이의 효과가 미미하지만, 우라실이 2'-O-메틸화될 때 MDA5/RNA 복합체의 역학 및 안정성에 미치는 영향이 더 중요하다는 것을 시사합니다. .
논의
이 연구는 자가면역 유전자좌 IFIH1의 공유 rs35667974 변이체의 역할에 대한 진화적 및 구조적 조사를 나타내며, MDA5에 대한 수정된 기능성 표현형을 초래하는 것으로 보고되었습니다(Downes et al. 2010). 양성 선택 분석을 수행하기 위한 진화 부위 및 분기 부위 모델의 적용은 rs35667974 다형성이 상주하는 RNA 상호작용 부위에 양성 선택 부위가 없음을 나타냅니다. 분기 사이트 모델은 특정 사이트가 CTD 도메인에서 긍정적인 선택을 거쳤음을 나타내지 않습니다.
이것은 인간 집단에서도 Ile923Val 변이체의 출현 빈도가 매우 낮은 것과 일치합니다(표 1). 그럼에도 불구하고 유럽 인구는 다른 인구와 비교하여 C 대립 유전자의 빈도가 한 단계 차이가 있습니다. 작은 표본 크기를 간과하지 않고, 연구 중인 다형성의 지리적 분포는 유럽 인구에서 출발점으로 나타나는 다형성이 최근 몇 년 동안 변화한 생활 조건과 영양 때문일 수 있음을 보여줍니다. 검사된 SNP의 역할에 대한 구조적 조사는 dsRNA-MDA5(천연 및 돌연변이) 복합체의 구조를 조사함으로써 수행되었다.
dsRNA-MDA5 복합체 형성 수준에서 Ile923Val 돌연변이의 도입은 단백질 C-말단 도메인(CTD)과 dsRNA의 한 가닥 리보스 당 옆에 소수성 공동의 도입으로 dsRNA의 상호작용에 영향을 미칩니다. . 우리는 한 가닥의 phosphoribosyl 사슬에서 methylated RNA의 경우, 야생형에는 영향을 미치지 않으면서 추가 동적 효과가 돌연변이의 상호 작용에 영향을 미칠 수 있음을 보여주었습니다. 이것은 실험적 연구(Looney et al. 2015; Brisse and Ly 2019)와 일치하며 MDA5-dsDNA 상호작용 지점 부근에서 확인된 Ile923Val 다형성의 효과가 천연 dsRNA 결합 특성에 영향을 미치지 않지만 2.5-촉매 활성의 배 감소(Shigemoto et al. 2009). 또한, 분자 역학 연구는 MDA 필라멘트 형성에서 dsRNA 상호작용 및 단백질간 상호작용에 관여하는 MDA5 루프 941-959 및 970-977의 이동성 및 안정성과 관련하여 돌연변이체에서 메틸화의 중요한 역할을 보여주었다. 이러한 효과는 I형 인터페론 유전자(IFN1: IFN 및 IFN )의 발현을 추가로 활성화하는 MDA5 필라멘트 어셈블리, MDA5-MAVS 결합 및 MAVS 필라멘트 어셈블리를 방해할 수 있습니다. 결과적으로 T1D 및 PsA의 경우 MDA5 단백질 활성 수준이 감소하여 IFN 생성이 감소하여 자가 면역으로부터 보호됩니다. 이러한 관찰은 MDA5와 MAVS의 상호작용에 영향을 미치고 IFN 생산 감소에 영향을 미칠 것으로 예상되는 여러 IFIH1 변이체가 질병의 위험을 감소시킬 수 있는 반면 정상적인 MDA5 기능은 이와 관련되어 있음을 시사합니다(Shigemoto et al. 2009).
이는 바이러스 RNA의 경우와 마찬가지로 RNA로 확인된 돌연변이인 self-dsRNA 메틸화가 일부 자가면역질환에서 보호 효과를 도입하는 데 중요한 선택/활성화 인자라는 결론에 이르게 한다. 본 연구의 결과는 앞서 언급한 질병의 발달에서 IFIH1 유전자좌의 rs35667974 SNP의 생물학적 중요성에 대한 지식을 확장하고 다중 자가면역 질환에 의한 공유 유전자 연구의 중요성을 강조합니다. 그러나 PCR-RFLP, sequencing, genotyping chip 등을 이용한 SNP와 자가면역질환의 유전적 연관성에 대한 집단 연구에서는 RNA methylation의 경우를 고려하지 않는다. 따라서 상호작용하는 dsRNA의 메틸화 상태와 대립유전자 MDA5에 미치는 영향을 아는 것이 중요합니다. 바이러스 dsRNA 인식(Wu et al. 2013) 및 자기 mRNA와 비자기 mRNA의 구별(Züst et al. 2011)의 경우에서와 같이 상호 작용하는 MDA5에서 메틸 그룹의 손실은 돌연변이 Ile923Val MDA5는 필라멘트 형성 및 유형 I 인터페론의 유도에 영향을 줄 수 있습니다.
참고로 Plenge et al. (2013)은 이전에 약제학적 개입을 위한 추정 치료 표적을 나타내는 원인 질환 유전자의 희귀 변이체의 가능성에 대해 논의했습니다. 이를 위해 원인 변이체의 생물학적 기능은 유전적 발견을 새로운 치료 표적과 연결하려는 모든 시도에서 알려져야 합니다. 따라서 각 단백질의 3차원 구조에서 원인 변이체의 위치를 파악하고 자가면역 질환을 유발하는 병인 경로에서 구조적/기능적 관점에서 그 역할을 조사하는 것이 더 나은 관리 및 치료를 위해 중추적으로 중요할 것으로 보입니다. 환자. 관련 SNP의 발견을 넘어 질병의 분자 메커니즘과 경로를 밝히기 위해 원인 변이체에 대한 더 깊은 이해로 이동해야 할 절실한 필요성이 남아 있습니다. ribose-2'-Ο-methylated self-dsRNA가 MDA5에 결합하는 것과 이것이 MDA5 피브릴 어셈블리에 미치는 영향을 조사하기 위해서는 추가 구조 기능 분석이 필요합니다. I형 인터페론의 유도에서 바이러스와 자가-mRNA를 구별하는 센서로서 mRNA의 애매한 생물학적 역할 2'-O-메틸화는 특정 자가면역병증에서 보호 센서로 확장되었을 수 있습니다.
결론
희귀한 rs35667974 IFIH1 유전자 다형성은 T1D, PS 및 PsA로부터 보호하는 반면, 대다수의 인구에 의해 운반되는 IFIH1 대립유전자는 질병에 걸리기 쉽습니다. 돌연변이 Ile923Val MDA5가 self-dsRNA, 특히 2'-O-메틸화된 것과의 상호작용에서 다르게 기능한다는 자금은 일부 경우에 메틸화된 dsRNA와 상호작용하는 변이체가 MDA5 필라멘트 형성, MAVS 상호작용 및 필라멘트 형성을 방해한다는 것을 시사합니다. IFN 신호는 숙주 항바이러스 반응에서와 같이 질병으로부터 보호하기 때문에 부정적으로 선택되었을 수 있습니다.
저자 기여
개념화 - AA, AP, EEE 및 GNG, 방법론 - AA, AP 및 EEE, 검증 - AA, AP, MIZ, GNG 및 EEE, 조사 - GNG, AA, AP 및 MIZ, 리소스 - GNG, AA, AP 및 MIZ, 데이터 큐레이션 - AA 및 AP, 작성 및 원본 초안 준비 - EEE, GNG, AA, AP 및 MZ, 원고 작성, 검토 및 편집 - AA, AP, MZ, GNG 및 EEE, 시각화 - AA, AP 및 EEE, 감독 - EEE 및 자금 조달 - EEE. 모든 저자는 원고의 출판된 버전을 읽고 이에 동의했습니다.
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