Ishige Okamurae에서 분리된 Ishophloroglucin A는 -MSH에 의해 유도된 멜라닌 생성을 억제합니다: In Vitro 및 In Vivo Part 1

추상적인:Ishige Okamura(IO)에서 분리한 Diphlorethohydroxycarmalol(DPHC)은 UV-B 방사선에 대해 잠재적인 미백 효과를 나타냈습니다. 그러나 멜라닌 세포 자극 호르몬(-MSH)에 대한 IO의 구성 요소와 분자 메커니즘은 아직 조사되지 않았습니다. 따라서 본 연구에서는 갈조류 IO에서 분리한 플로로탄닌인 IPA(Ishophloroglucin A)와 그 조추출물(IOE)의 -MSH로 유도된 제브라피쉬 모델과 B16F10 흑색종 세포에서 생체 내 멜라닌 생성 억제 효과를 조사하고자 하였다. 체외에서. 플로로탄닌의 분자 도킹 연구는 그들의 억제 효과를 결정하고 멜라닌 생성과 관련된 당단백질인 티로시나제와의 상호 작용 방식을 밝히기 위해 수행되었습니다. 또한, IPA 및 IOE 처리 후 -MSH로 유도된 제브라피쉬 모델에서 형태학적 변화 및 멜라닌 함량이 감소하였다. 또한, 웨스턴 블롯팅은 IPA가 -MSH로 자극된 B16F10 세포에서 세포외 관련 단백질 발현을 상향조절한다는 것을 밝혀냈습니다. 따라서 이러한 결과는 IOE에서 분리된 IPA가 제약 및 화장품 산업에서 사용할 가능성이 있음을 시사합니다.

관련 연구에 따르면,담배"생명을 연장하는 기적의 허브"로 알려진 일반적인 허브입니다. 주요 구성 요소는시스타노사이드등의 다양한 효과가 있습니다.산화 방지제, 항 염증 및 면역 기능 촉진. cistanche와 피부 미백 사이의 메커니즘은 citanche glycosides의 항산화 효과에 있습니다.멜라닌인간 피부에서 티로시나제에 의해 촉매되는 티로신의 산화에 의해 생성됩니다. 산화 반응에는 산소의 참여가 필요하므로 체내의 산소가 없는 활성산소는 멜라닌 생성에 영향을 미치는 중요한 요인이 됩니다. Cistanche는 산화 방지제인 cistanoside를 함유하고 있으며 신체의 자유 라디칼 생성을 감소시킬 수 있습니다.멜라닌 생성 억제.

1. 소개

해조류는 플로로탄닌, 후코이단, 다당류, 단백질 등 생리활성화합물을 활용하기 때문에 기능성식품, 화장품, 제약업계에서 큰 주목을 받고 있다[1-7]. 이전 연구에 따르면, Ishige Okamurae(IO)는 티로시나제 활성에 대한 억제 효과에 대해 스크리닝되었습니다[8]. 그것의 플로로탄닌, diphlorethohydroxycarmalol(DPHC)이 시험관 내 모델에서 UV-B 방사선에 의해 유도된 항멜라닌 생성 활성에 대해 평가되었지만[8], DPHC와 멜라닌 생성 관련 단백질 사이의 상호작용을 설명하기 위한 추가 연구는 수행되지 않았습니다. 본 연구에서는 새로운 폴리페놀 화합물인 Ishophloroglucin A (IPA) [9]가 DPHC와 비교하여 분자 도킹 연구에서 tyrosinase와의 상호작용에 대해 평가되었습니다.

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분자 도킹은 상호 작용 패턴을 연구하거나 약물 설계를 위해 알려진 3차원 구조의 단백질 또는 수용체의 활성 부위 내에서 작은 분자 또는 리간드의 잠재적인 결합 모드를 예측하는 효율적인 계산 방법입니다[10-12]. 이전 연구에서는 분자 도킹 연구[13,14]를 통해 조사한 티로시나제 효소의 상호작용 부위와 에너지 값을 보고한 바 있다. 기능적으로 티로시나아제는 신호 경로에서 상대적으로 느린 반응 속도를 촉매하는 속도 제한 효소이며 특히 멜라닌 세포에 의해 합성되는 멜라노솜이라고 하는 특수 소기관에서 멜라닌 생합성에 중추적인 역할을 합니다[15]. 따라서, in silico 분자 도킹 시뮬레이션을 통해 모델링된 티로시나아제의 효소 활성은 피부 과색소침착 장애를 예방하기 위한 억제제를 조사하기 위한 표적이었습니다. 이를 바탕으로 실험 및 전산 분야에서 많은 페놀 화합물이나 금속 킬레이트 능력을 가진 억제제가 tyrosinase 억제제로 널리 연구되고 있다[16].

멜라닌은 주로 피부색을 조절하고 피부가 UV 방사선에 노출될 때 보호 색소 역할을 합니다[17]. 자외선에 노출되면 피부 각질 세포와 멜라닌 세포에서 멜라닌 세포 자극 호르몬(-MSH)이 방출되어 멜라닌 합성을 유도하고 이후 태양 방사선의 손상 효과로부터 피부를 보호합니다[18]. 그러나 자외선에 장기간 노출되면 -MSH에 의한 상당한 멜라닌 합성이 유도되어 표피에 주근깨, 흑점, 흑점 등의 피부 손상을 일으켜 DNA 광손상과 피부암을 유발한다[19]. 이후 멜라노사이트에 -MSH를 투여하여 흑색종에서 멜라닌 생성을 위한 티로시나제 활성의 상당한 변화를 유도하는 연구가 광범위하게 진행되었습니다[20].

제브라피쉬는 인간처럼 다양한 피부색을 보입니다. 이들은 인간 피부색의 유전적 기원을 이해하기 위해 사용되는 동물 모델로, 기본 모델 유기체 생물학과 인간 유전학을 연결합니다[21]. 또한, 제브라피쉬 낭배의 복부 및 측면 영역의 색소와 애벌레 단계에서의 투명도는 색소 침착 과정을 간단하게 관찰할 수 있게 하여 멜라닌 세포 발달 결함으로 인한 피부 세포 질환을 이해하기 위한 실행 가능한 모델을 개발할 수 있는 기회를 제공합니다[22- 24].

멜라닌 합성은 tyrosinase, MITF(microphthalmia-associated transcription factor), tyrosinase 관련 단백질-1(Trp-2) 및 tyrosinase 관련 단백질{{ {6}} (Trp-1) [15]. 본 연구에서는 피부 색소 침착 및 흑색 종 치료에 잠재적 인 사용을 평가하기 위해 in vivo 및 B16F10 흑색 종 세포의 in vivo 및 B16F10 흑색 종 세포에 대한 tyrosinase 활성 및 melanogenesis에서 IPA 및 IO 조 추출물 (IOE)의 억제 효과를 조사하는 것을 목표로했습니다. .

2. 결과

2.1. 분자 도킹 연구

IPA, DPHC 및 알부틴과 상용 티로시나제 효소의 결합을 시뮬레이션하기 위해 도킹 방법이 수행되었습니다[25]. 버섯 티로시나제와 IPA, DPHC 또는 알부틴의 결합 모드는 그림 1A–C에 나와 있습니다. tyrosinase-IPA 복합체(그림 1A), tyrosinase-DPHC(그림 1B) 및 tyrosinase-arbutin(그림 1C)의 3D 다이어그램에서 볼 수 있듯이 IPA, DPHC 및 arbutin이 활성 부위에 도킹되어 있지만 tyrosinase- IPA 복합체는 가장 큰 결합 표면적을 보였다. 또한, 2D 다이어그램에서 볼 수 있듯이 tyrosinase-IPA 복합체는 tyrosinase-DPHC 또는 tyrosinase-arbutin에 비해 tyrosinase의 다양한 아미노산과 더 많은 상호 작용을 보였습니다. 7개의 벤젠 고리(1번, 2번, 3번, 8번, 9번, 12번 및 16번)와 이들의 산소 원자는 Histidine60, Methionine61, Lysine157, Glutamate158, Proline160, Proline201, Arginine206 및 Valine218과 π-π 상호작용을 합니다. . 특히 16번 벤젠 고리는 활성 부위의 주요 아미노산인 히스티딘60과 히스티딘204와 결합했다. 또한 IPA의 많은 산소 원자는 Glutamate158, Proline160, Aspartate167, Methionine184, Phenylalanine197, Asparagine199, Glutamine202, Asparagine205 및 Arginine209와 수소 결합을 통해 상호 작용했습니다. 또한, 도킹 분석 결과를 바탕으로 DS 3.0의 CDOCKER 상호작용 에너지 프로그램(Figure 1D)을 이용한 총 결합 에너지 및 CDOCKER 상호작용 에너지는 다음과 같이 계산되었다. 152.154 kcal/mol, DPHC(diphlorethohydroxycarmalol): -65.5221 kcal/mol 및 알부틴: -33.6835 kcal/mol 및 티로시나아제와의 결합 에너지: Ishophloroglucin A(IPA): -546.504 kcal/mol, DPHC(diphlorethohydroxycarmalol): -407.706 kcal /mol 및 알부틴: -79.0913 kcal/mol.

2.2. 제브라피쉬 유충의 멜라닌 생성 억제제가 멜라닌 합성에 미치는 영향

이 연구의 목적은 IPA와 IOE가 in vivo에서 제브라피쉬 유충의 멜라닌 생성을 억제할 수 있는지 여부를 확인하는 것이었습니다. 우리의 이전 연구에서 IPA와 IOE는 제브라피쉬 유충에서 독성을 나타내지 않았습니다[26]. 우리는 zebrafish 유충을 zebrafish(0.05, 0.15 및 0.5 nM) 및 IOE(3, 10 및 30 µg/mL)로 처리했습니다. ) 멜라닌 함량을 결정합니다. 억제활성을 추정하기 위해 제브라피쉬 추출물의 총 멜라닌 함량을 측정하였다. 제브라피쉬 멜라닌에 대한 표현형 효과는 상온에서 현미경으로 몸의 색소 침착을 분석하여 관찰되었습니다. 표면 멜라닌은 다양한 농도의 표적 억제제에 의해 상당히 감소되었습니다(그림 2). 3 nM -MSH로 처리하면 처리되지 않은 그룹에 비해 제브라피쉬의 멜라닌 함량이 크게 증가했습니다. 가장 높은 농도의 IPA(0.5nM) 및 IOE(30μg/mL)는 총 멜라닌 함량을 각각 거의 28.56% 및 30.36% 감소시켰으며, 이는 알부틴(200μM) 처리 그룹과 유사한 효과를 나타냈습니다(그림 2A, 비).

2.3. IPA와 IOE가 B16F10 세포에서 멜라닌 합성에 미치는 영향

B16F10 세포에 대한 IPA 및 IOE의 세포독성 효과는 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,{{ 7}}디페닐테트라졸륨 브로마이드) 분석. 우리는 처음에 -MSH 자극 없이 다른 농도로 처리된 B16F10 세포에 대한 IPA 및 IOE의 세포독성 효과를 조사했습니다. IPA(0.15, 0.5, 1.5 및 5 nM)는 B16F10 세포에서 유의한 세포 독성을 나타내지 않은 반면 IOE(1, 3, 10 및 30 μg/mL)는 세포 독성을 나타내지 않았습니다(그림 3A, B). 독성이 없는 농도의 IPA 및 IOE를 추가 연구에 사용했습니다.

우리는 B16F10 세포에서 IPA 또는 IOE 처리의 멜라닌 억제 효과가 생체 내에서 -MSH 자극 없이 가역적인지 여부를 조사했습니다. 대조군에 비해 IPA(5nM) 또는 IOE(30μg/mL) 처리 시 멜라닌 함량이 크게 감소했습니다(그림 3C, D). 이러한 결과는 IPA와 IOE가 B16F10 세포에서 -MSH 자극 없이 멜라닌 합성을 억제하여 항멜라닌 생성 효과에 기여함을 시사한다.

2.4. -MSH로 자극된 B16F10 세포에서 IPA와 IOE가 Tyrosinase 활성과 멜라닌 합성에 미치는 영향

따라서 IPA(0.5, 1.5 및 5 nM) 및 IOE(3, 10 및 30 μg/mL) 용량을 B16F10 흑색종 세포와 함께 배양하여 세포 티로시나아제 활성 및 -MSH에서의 생체 활성을 측정했습니다. -매개된 멜라닌 생성.

-MSH 및 알부틴의 농도는 B16F10 세포에서 세포독성 및 멜라닌 생성 결과를 기반으로 결정되었습니다(그림 S2A-D). 생존율 데이터를 분석하여 1nM의 -MSH와 100μM의 알부틴을 추가 실험에 사용하였다.

세포 티로시나제 활성에 관해서는, IPA 1.5 nM의 억제 효과가 양성 대조군에서 묘사된 것보다 상대적으로 낮았지만, 농도는 거의 10배 차이가 났으며, 100 μM에서 알부틴의 농도가 더 높았습니다(그림 4A). IOE는 -MSH-처리군과 비교하여 상이한 농도의 효과 사이에 약간의 변동으로 티로시나제 활성을 감소시켰다(도 4B). -MSH 매개 멜라닌 생성에 관해서는 1.5 및 5 nM IPA 처리 그룹에서 멜라닌 함량의 상당한 감소가 관찰되었습니다(그림 4C). 또한 30 μg/mL IOE는 블랭크 그룹과 유사한 지점까지 색소 침착을 억제했습니다(그림4D). 이러한 결과는 IPA 및 IOE가 티로시나제 활성을 하향 조절하고 이러한 억제 효과가 B16F10 세포에서 세포성 멜라닌 합성을 감소시킬 수 있음을 시사합니다.

2.5. -MSH로 자극된 B16F10 세포에서 IPA 및 IOE가 분자 메커니즘에 미치는 영향

멜라닌 생성 억제 효과에 대한 메커니즘을 밝히기 위해 멜라닌 합성에 관여하는 신호 분자의 발현 수준에 대한 IPA 및 IOE의 영향을 결정했습니다(그림 5). ERK(세포외 신호 조절 키나아제), JNK(Jun N-말단 키나아제) 및 p38은 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK) 세포내 신호 전달 캐스케이드에 속합니다[27,28]. 도 5A, B에 제시된 바와 같이, ERK 인산화는 IPA 처리로 강화된 반면, JNK의 인산화는 IPA(1.5 및 5 nM) 또는 IOE(30 μg/mL)로 처리한 후에 약간 감소하였다. 또한, 도 5C에 제시된 바와 같이, p-p38 수준은 -MSH-자극 그룹에서 대조군에 비해 약 80%로 크게 증가하였다. 또한 IPA, IOE 또는 알부틴 처리 후 p38의 인산화가 약간 억제되었습니다. 이러한 결과는 IPA 및 IOE의 멜라닌 생성 억제 효과가 JNK 및 p38 MAPK 신호 전달 경로와 관련이 있을 수 있음을 시사합니다.

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