멜라닌 탈색을 위한 미백제로 천연 매개체를 이용한 Laccase 매개체 시스템 1부

추상적인: 본 연구에서는 멜라닌 탈색을 위한 미백제로 천연 매개체를 이용한 LMS(Laccase-Mediator System)를 개발하였다. 7개의 천연 매개체를 사용하여 합성 매개체를 대체하고 laccase의 낮은 산화환원 전위와 laccase의 활성 부위에 대한 멜라닌의 제한된 접근을 성공적으로 극복했습니다. Trametes versicolor (lacT) 및 Myceliophthora thermophila (lacM)의 laccases의 멜라닌 탈색 활성은 낮은 세포 독성을 나타내는 acetosyringone, syringaldehyde 및 acetovanillone을 포함한 천연 매개체를 사용하여 크게 향상되었습니다. 천연 매개체의 메톡시 및 케톤 그룹은 멜라닌 탈색에 중요한 역할을 합니다. 멜라닌 탈색에 대한 lacT와 lacM의 특이상수는 acetosyringone을 매개체로 사용할 때 각각 247과 334로 증가하였다. 레이스와 아세토시린곤을 사용하는 LMS는 피부 상태를 모방하는 셀룰로오스 하이드로겔 필름에 존재하는 멜라닌을 탈색할 수도 있습니다. 또한, LMS는 티로신의 산화에 의해 제조된 합성 유멜라닌 유사체뿐만 아니라 흑색종 세포에 의해 생성된 천연 멜라닌도 탈색시킬 수 있었다.

관련 연구에 따르면,담배"생명을 연장하는 기적의 허브"로 알려진 일반적인 허브입니다. 주요 구성 요소는시스타노사이드등의 다양한 효과가 있습니다.산화 방지제, 항염증, 그리고면역 기능 촉진. cistanche와피부 미백cistanche의 항산화 효과에 있습니다배당체. 멜라닌인간 피부에서 티로신의 산화에 의해 생성됩니다.티로시나제, 산화 반응에는 산소의 참여가 필요하므로 체내의 산소가 없는 라디칼은 멜라닌 생성에 영향을 미치는 중요한 요인이 됩니다. Cistanche 포함시스타노사이드, 산화 방지제이며 신체의 자유 라디칼 생성을 줄일 수 있으므로멜라닌 생성 억제.

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1. 소개

Laccases(EC 1.10.3.2, benzenediol: dioxygen oxidoreductases)는 분자 산소의 환원에 의한 라디칼 촉매 반응 메커니즘을 통해 다양한 페놀 및 비페놀 화합물의 산화를 촉매하는 다중 구리 단백질입니다[1,2]. Laccases는 염료[3,4], 의약품[5,6], 제초제[7] 및 탈리그닌화[8-10]와 같은 생분해 과정을 위한 생촉매로 사용되었습니다. Laccases는 또한 염료 전구체와 유기 화합물의 중합을 촉매하는 데 사용되었습니다[11]. 특히, 낮은 기질 특이성, 최종 전자 수용체로 산소 사용, 부산물로 물 생성, 과산화물 요구 없음(또는 생산 없음)과 같은 매력적인 특성으로 인해 생명 공학 및 환경 분야 [1,11,12].

활성 부위에 있는 4개의 구리 이온은 laccase의 촉매 활성에 관여합니다. "청색" 구리(T1 사이트)는 기판을 산화시키고 삼핵 구리 클러스터(T2/T3)는 T1 사이트에서 전자를 받아 분자 산소를 환원시킵니다[1,12,13]. 특히, T1 사이트 Cu의 산화환원 전위는 락카제의 촉매 능력을 결정하는 주요 요인으로 간주된다[14]. Laccase는 망간 퍼옥시다제 및 리그닌 퍼옥시다제와 같은 리그닌 분해성 퍼옥시다제(1V 이상)에 비해 상대적으로 낮은 산화환원 전위(0.4–0.8 V)를 가지고 있습니다. Laccases는 1.3V 이상의 산화 환원 전위로 비페놀성 기질을 직접 산화시킬 수 없습니다[13,14]. 따라서 laccase의 한계를 극복하기 위해 2,20 -azinobis(3- ethylbenzthiazoline-6-sulphonate) (ABTS), { {24}}환원 매개체로 작용하는 hydroxy benzotriazole(HOBt), violuric acid(VLA), N-hydroxy phthalimide(HPI), N-hydroxy acetanilide(NHA) 및 TEMPO가 제안되었다[15-17].

이러한 매개체는 다른 산화 경로를 통해 부피가 큰 화합물의 산화를 허용합니다. laccase-ABTS 시스템은 전자 전달(ET) 메커니즘을 통해 양이온성 ABTS 라디칼을 생성하여 기판을 산화시킵니다. HOBt, VLA, HPI 또는 NHA가 있는 LMS는 수소 원자 전달(HAT) 메커니즘을 통해 니트록실 라디칼을 생성합니다[1,12,17]. 또한 TEMPO 및 그 유사체와 같은 매개체는 이온 경로를 통해 반응하여 옥소암모늄 이온을 생성합니다[1,12,18]. 이러한 매개체의 사용은 염료 분해[3,4], 약물 분해[5,6] 및 리그닌 분해[8-10]와 같은 다양한 응용 분야에서 광범위한 화합물을 산화시킬 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 합성 매개체는 잠재적인 독성, 높은 비용 및 효소 불활성화 효과로 인해 산업 현장에서의 적용이 제한적이었습니다. 최근 천연 매개체(예: 시링알데히드, 아세토시린곤, 바닐린, 아세토바닐론, 메틸 바닐라산염, 페룰산, 시나프산, p-쿠마르산 등)로서 리그닌 유래 페놀 분자가 합성 매개체를 대체하기 위해 연구되었습니다[1,12]. . 천연 매개체의 장점은 천연 및 재생 가능한 자원에서 얻어지기 때문에 비용이 저렴하고 독성이 낮다는 것입니다[19].

멜라닌은 멜라닌 세포에 의한 티로신의 산화 중합을 통해 멜라닌 생성에 의해 생성되는 천연 색소 그룹입니다. 천연 멜라닌은 eumelanin, pheomelanin, all melanin, pheomelanin, neuromelanin의 5가지 범주로 분류할 수 있다[20]. 최근 멜라닌 또는 멜라닌 전구체를 이용한 다양한 의학적 및 전기화학적 응용이 연구되고 있다[20,21]. 인간의 피부색은 대부분 멜라닌의 존재에 의해 결정됩니다. 화장품 업계에서는 미백제의 개발을 위해 효소를 이용한 멜라닌의 직접적인 탈색이 제안되었다. 멜라닌을 탈색시키기 위해 여러 과산화효소가 연구되었습니다. Wooet al. 합성 멜라닌이 P. chrysosporium의 리그닌 퍼옥시다제에 의해 직접적으로 탈색될 수 있음을 보여주었다[22]. Keneko와 Mohoric 그룹은 또한 진균(Sporotrichum pruinose 및 Phlebia radiata)에서 분리된 망간 과산화효소에 의한 멜라닌의 효소적 탈색을 보고했습니다[23,24]. Kim et al. 망간 퍼옥시다제, 리그닌 퍼옥시다제 및 라카제를 함유하는 조 효소 혼합물이 멜라닌 색소 침착 활성을 보였다고 보고했습니다[25]. 과산화효소가 멜라닌을 탈색할 때 피부를 자극할 수 있는 보조 인자로 과산화수소(H2O2)가 필요합니다. 따라서 H2O2의 사용량을 줄이기 위해 효소 조합 시스템에 포도당 산화 효소 또는 laccase를 도입했습니다[26,27]. Laccases는 과산화수소를 사용하지 않고 멜라닌을 탈색시킬 수 있습니다. Khammuang과 Sarnthima는 Lentinus polycarpous Lév의 laccase가 ABTS, vanillin 및 vanillic acid를 매개체로 사용하여 멜라닌 탈색 활성을 보였다고 보고했습니다[28].

2. 재료 및 방법

2.1. 재료

2.2. LMS에 의한 멜라닌 탈색

포화 멜라닌 용액(1.4mg/mL)은 10mM NaOH 1.3mL에 3mg 합성 멜라닌을 용해시켜 준비했습니다. 용액을 8500 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 용해되지 않은 멜라닌을 제거하고 상등액을 0.1M 시트르산 인산완충액(pH 3, 4, 5, 5.5, 6 또는 7) LMS의 기질 용액으로 사용됩니다. 기질 용액의 멜라닌 농도는 63 μg/mL였으며 475 nm에서 분광 광도계로 확인되었습니다. 0.8mL의 멜라닌 기질 용액을 1.5mL Eppendorf 튜브에서 0.1mL 매개체 용액(0–1mM)과 혼합했습니다. 멜라닌 탈색 반응은 진탕 수조에서 120 rpm으로 25 ºC에서 멜라닌과 매개체의 혼합물에 락카제 용액(15.8 μg(0.6 U) lacT 또는 19.2 μg(1.8 U) lacM) 0.1 mL를 첨가하여 시작되었습니다. . 반응 후, 반응 혼합물을 원심분리하고 상등액의 흡광도를 475 nm에서 측정하였다. 탈색 수율(백분율)은 다음 방정식을 사용하여 계산되었습니다.

탈색(백분율) {0}}(A0 − At)/A0 × 100, (1)

2.3. LMS에 의한 멜라닌 탈색의 동역학적 연구

2.4. 자연 매개체의 세포 독성

B16F10 흑색종 세포주(Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea)를 사용하여 LMS에 대한 천연 매개체의 세포독성을 측정하였다. 매개체의 세포독성을 측정하기 위해 NR(neutral red) 분석을 수행하였다[29]. NR은 살아있는 세포 리소좀의 생존력을 측정합니다. 3 × 104 세포 농도의 흑색종 세포를 96-웰 플레이트의 각 웰에 분주했습니다. 배양 24시간 후, 세포를 천연 매개체(1, 2, 5, 10, 22 및 46mM)로 처리하였다. 2일 동안 추가 배양한 후, 세포를 DMEM에 용해된 50 μg/mL NR 용액으로 처리하고 3시간 동안 배양하였다. 흡인으로 상등액을 제거한 후 NR desorb 용액(빙초산 1%, 에탄올 49%, 증류수 50%)을 사용하여 색을 추출하였다. 추출 공정 후 540 nm에서 흡광도 변화를 측정하였다.

2.5. 멜라닌/셀룰로오스 하이드로겔 필름의 제조 및 탈색

멜라닌/셀룰로오스 필름에 대한 LMS의 탈색 활성을 측정하기 위해 제조된 하이드로겔 필름을 1×2 cm 시트로 절단하였다. 하이드로겔 필름을 4mL의 0.1M 시트르산 인산염 완충액(pH 5.5)에 담갔다; 이어서, 0.5mL의 1mM 아세토시린곤 및 0.5mL의 레이스 용액(2.5U)을 완충액에 첨가하였다. 탈색 반응은 수조에서 120pm, 25℃에서 3시간 동안 진탕하면서 수행하였다. 반응 후 필름을 증류수로 세척하고 큐벳 안쪽에 부착하여 UV/Vis 분광광도계를 이용하여 400~800nm ​​범위의 스펙트럼 변화를 측정하였다. lacM 또는 매개체가 없는 대조군 반응도 동일한 조건에서 수행되었습니다. 필름으로부터의 멜라닌 방출 또는 멜라닌/셀룰로오스 필름의 변색은 반응 조건에서 검출되지 않았다. 또한, LMS에 의한 탈색 반응 후 멜라닌/셀룰로오스 필름의 색상 파라미터(L*, a* 및 b* 값)의 변화도 색채계(KONICA MI NOLTA, Tokyo, Japan)를 사용하여 기록하였다. ∆L(metric lightness difference), ∆E(total color difference), YI(yellowness index), WI(whiteness index) 값은 다음 방정식[30–32]을 사용하여 구했습니다.

2.6. 천연 멜라닌의 제조

B16F10 흑색종 세포로부터 천연 멜라닌을 얻었다. 세포는 멜라닌을 생성하기 위해 알파-멜라닌 세포 자극 호르몬으로 처리되었습니다. 배양 4일 후, 트립신-EDTA를 사용하여 세포를 포획하고 10분 동안 초음파 처리하였다. 8000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상등액을 얻은 다음 6 M HCl을 사용하여 pH 1.5로 조정하였다. 잔류 단백질 부분을 가수분해하기 위해 용액을 100℃에서 4시간 동안 끓였다. 천연 멜라닌을 함유한 용액을 아세톤으로 세척한 후 클로로포름과 에탄올로 세척한 다음 탈이온수로 세척하여 세포, 배지 성분, 단백질 분획 등의 잔류물을 제거하였다[33,34]. 모든 세척 공정은 2회 이상 실시하였다. 마지막으로 천연 멜라닌을 동결건조하여 얻어 LMS의 기질로 사용하였다.

3. 결과 및 논의

3.1. LMS에 의한 멜라닌 탈색에 대한 매개체의 효과

LMS에 의한 멜라닌 탈색 반응에 대한 다양한 매개체의 영향을 T. versicolor(lacT)와 M. thermophila(lacM)의 두 가지 락카제를 사용하여 조사했습니다(그림 1).멜라닌 탈색 매개체 없이 lacT를 사용했을 때 반응 5시간 후 탈색 수율은 1%에 불과했다. HOBt가 lacT의 매개체로 사용되었을 때, 탈색 수율은 반응 5시간 후에 2%로 약간 향상되었습니다. 페놀 또는 비페놀 화합물의 라카제 촉매 산화에서 HOBt, ABTS, VLA 및 TEMPO와 같은 다양한 합성 매개체를 사용하면 반응 속도가 크게 향상되었습니다[10,15]. laccase의 활성 부위로의 표적 화합물의 접근이 입체 장애에 의해 제한될 때, laccase에 의해 형성된 매개체 라디칼은 전자 전달 또는 수소 원자 전달 메커니즘에 의해 표적 화합물을 효율적으로 산화시킬 수 있습니다[12]. HOBt는 높은 산화 환원 전위(1.1V)로 인해 LMS에서 가장 일반적으로 사용되는 합성 매개체 중 하나입니다[6]. 그러나 HOBt는 잠재적인 세포 독성과 laccase를 비활성화하는 능력 때문에 좋은 화장품 성분이 아닙니다. 따라서 우리는 LMS에 의한 멜라닌 탈색 반응을 위해 acetosyringone, syringaldehyde, p-coumaric acid, vanillin, vanillic acid, vanillyl alcohol, acetovanillone 등 7가지 천연 매개체를 선택하였다. 흥미롭게도 모든 천연 매개체는 결핍에 의한 멜라닌 탈색에 대해 HOBt보다 더 효율적인 매개체 역할을 합니다. acetosyringone, syringaldehyde, p-coumaric acid를 사용한 경우 5시간 반응 후 탈색 수율은 각각 28%, 22%, 18%였다. 이러한 결과는 LMS에 의한 멜라닌 탈색 반응에 대한 천연 매개체의 유용성을 입증합니다. LMS의 매개체는 laccase에 의해 매개체 라디칼로 산화되고 매개체 라디칼은 멜라닌의 산화 및 탈색을 유도합니다. 멜라닌 탈색 매개체 없이 평형 상태에 도달할 수 있는 충분한 반응시간 동안 릴락을 사용하였을 때 반응 24시간 후 탈색 수율은 7%였다. 바닐산을 제외한 천연 매개체는 반응 24시간 후 lacT에 의한 멜라닌 탈색에 대해 HOBt보다 더 효율적인 매개체 역할을 합니다. 바닐산을 매개체로 24시간 반응 후 탈색 수율은 5시간 반응 후보다 낮았다. 이는 바닐산의 산화 라디칼 형태의 안정성이 낮기 때문일 수 있습니다. acetosyringone, syringaldehyde 및 acetovanillone을 사용한 경우 24시간 반응 후 탈색 수율은 각각 34%, 30% 및 31%였습니다. p-Coumaric acid는 acetovanillone보다 초기 반응 속도를 높이는 데 더 효율적이었고, acetovanillone은 p-coumaric acid보다 평형 상태에서 더 높은 탈색 수율을 유도하였다.

lacM을 사용한 LMS에 의한 탈색 반응에 대한 매개체의 효과도 lacT를 사용한 LMS에 의해 얻어진 것과 매우 유사하였다. 멜라닌 탈색 매개체 없이 레이스를 사용했을 때 반응 5시간 후 탈색 수율은 2%에 불과했다. lacM에 대한 매개체로서 HOBt는 5시간 반응 동안 탈색 수율을 향상시키지 않았다. p-쿠마르산과 바닐린을 제외한 모든 천연 매개체는 lacM에 의한 멜라닌 탈색의 효율적인 매개자로 작용했습니다. acetosyringone과 syringaldehyde를 사용한 경우 반응 5시간 후 탈색 수율은 각각 25%와 22%였다. p-Coumaric acid와 vanillin은 각각에 대한 효율적인 매개체로 사용되었지만 레이스를 사용하는 LMS에서 탈색율을 효율적으로 향상시키지 못했습니다. 이는 p-coumaric acid와 vanillin에 대한 lacM의 기질 특이성이 낮기 때문일 수 있습니다. lacM과 p-쿠마르산 및 바닐린의 반응 24시간 후의 탈색 수율은 lacT에 의해 얻어진 수율과 유사하였다. 이것은 p-coumaric acid와 vanillin의 산화 형태가 lacM에 의한 산화 속도가 lacT에 의한 산화 속도보다 훨씬 낮음에도 불구하고 멜라닌을 효율적으로 탈색시킬 수 있음을 나타냅니다. 매개체가 없는 lacM을 멜라닌 탈색에 사용하여 충분한 반응 시간 동안 반응시킨 경우 반응 24시간 후 탈색 수율은 5%였다. 바닐산을 제외한 천연 매개체도 24시간 반응 후 lacM에 의한 멜라닌 탈색에 대해 HOBt보다 더 효율적인 매개체 역할을 합니다. acetosyringone, syringaldehyde 및 acetovanillone이 lacM의 매개체로 사용된 경우, 탈색 수율은 반응 24시간 후 각각 34%, 28% 및 31%였습니다. 바닐산이 lacT와 lacM 모두에 대한 매개체로 사용되었을 때 가장 낮은 탈색 수율을 보였다. 이는 바닐산의 산화 라디칼 형태의 안정성이 낮기 때문일 수 있습니다. Khammuang과 Sarnthima는 Lentinus polycarpous의 laccase를 사용하여 vanillin과 vanillic acid가 멜라닌 탈색의 매개체로 사용될 수 있다고 보고했습니다[28]. 그러나 lacT와 lace의 매개체로 사용했을 때 acetosyringone보다 멜라닌에 대한 탈색 활성이 훨씬 낮았다.

이러한 결과는 천연 매개체가 HOBt보다 LMS에 의한 멜라닌 탈색에 더 효율적임을 나타냅니다. HOBt는 높은 산화 환원 전위와 HOBt의 N OH 그룹의 촉매 역할 때문에 laccase에 대한 효율적인 합성 매개체로 간주되었습니다[5]. 표적 기질을 산화시키는 매개체의 효율은 안정한 라디칼을 형성하는 능력과 매개체의 산화환원 전위보다는 부피가 큰 알킬 치환체로 인한 입체 장애에 크게 의존합니다[19,35]. HOBt의 산화 중간체의 낮은 안정성은 순환 전압 전류법을 통해 결정되었습니다[6]. 따라서 HOBt를 이용한 LMS의 낮은 탈색 수율은 laccase의 반응 조건에서 HOBt의 낮은 안정성 때문일 수 있다. syringaldehyde의 산화환원 전위는 HOBt보다 낮지만 syringaldehyde가 HOBt보다 상대적으로 높은 안정성을 보였다[6].

그림 2에서 볼 수 있듯이 이 작업에 사용된 천연 매개체는 벤젠 고리의 서로 다른 위치에 다양한 치환기(예: 히드록실, 메톡시, 카르복실, 케톤 또는 알데히드)를 가지고 있습니다[12,19]. 2개의 메톡시기(acetosyringone 및 syringaldehyde)를 가진 매개체는 1개의 메톡시기를 가진 매개체보다 더 높은 탈색율을 보였다. 메톡시기가 없는 p-coumaric acid의 탈색율은 laccase의 종류에 따라 달라졌다. lacT를 함유한 p-coumaric acid는 1개의 methoxy group을 함유한 것보다 탈색율이 높았으며, lacM을 함유한 p-coumaric acid는 5시간 반응에서 가장 낮은 탈색율을 보였다. Fillatet al. 또한 천연 매개체를 가진 곰팡이 laccases에 의한 플렉소 잉크의 탈색에 대해서도 유사한 결과를 보여주었습니다[36]. 고리에 2개의 메톡시 치환기를 갖는 페놀성 천연 매개체(아세토시린곤, 메틸 주사기 및 시링알데하이드)는 메톡시기가 없는 p-쿠마르산보다 더 빠르게 락카아제에 의해 산화되었습니다. 이는 메톡시기가 p-쿠마르산 측쇄의 이중결합보다 전자공여체로서 더 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다. 메톡시기가 1개인 매개체를 비교했을 때 아세토바닐론 > 바닐린 > 바닐릴알코올 > 바닐산 순으로 탈색 수율이 증가하였다. 케톤기를 가진 아세토바닐론은 알데하이드, 수산기, 카르복실기를 가진 매개체보다 높은 탈색율과 수율을 보였다. ketone group을 가진 acetosyringone 역시 aldehyde group을 가진 syringaldehyde보다 높은 탈색율과 수율을 보였다.

다음 실험에서는 높은 멜라닌 탈색능을 나타내는 acetosyringone, syringaldehyde, acetovanillone을 LMS가 멜라닌을 탈색시키는 매개체로 선정하였다. LMS에 의한 탈색 반응에 대한 매개체의 영향을 시간 경과에 따라 조사했습니다(그림 S1). lacT와 acetosyringone, syringaldehyde, acetovanillone을 사용한 탈색 반응은 반응 1시간 후 각각 21%, 18%, 1%의 탈색 수율을 보였다. lacM과 acetosyringone 및 syringaldehyde를 사용한 탈색 반응은 반응 1시간 후 각각 19% 및 18%의 탈색 수율을 나타냈습니다. 동일한 매개체를 사용했을 때 두 laccase 모두 ​​유사한 반응 프로파일을 보였다. Acetosyringone과 syringaldehyde는 초기 반응 동안 탈색율을 유의하게 향상시켰다. 이러한 결과는 dimethoxy 그룹을 포함하는 acetosyringone 및 syringaldehyde가 하나의 메톡시 그룹을 포함하는 acetovanillone보다 LMS에 의한 초기 탈색 속도를 향상시키는 데 더 효율적이라는 것을 보여줍니다. Fillatet al. 또한 매개체의 고리 구조에 있는 메톡시 그룹이 기질의 산화 촉진제 역할을 한다고 보고했습니다[36]. 반면, acetovanillone은 24시간 반응 후 탈색 수율이 syringaldehyde와 유사하나, acetovanillone이 반응 속도를 약간 증가시켰다.

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