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Taxol 대체 중국 허브 Cistanche

키워드:Aspergillus favus · Jojoba · Endophytic fungi · Gold nanoparticles · Taxol · - 조사 · 영양 최적화

소개

탁솔은 가장 상용화 된 광역 스펙트럼 중 하나입니다.항암제[1]. 탁솔의 활성은 튜불린 중합을 촉진하여 종양 세포의 유사분열 분열을 방해하는 세포 튜불린-서브유닛 헤테로다이머와의 결합에 대한 독특한 특이성으로부터 정교화됩니다[2]. 탁솔은 유방암, 폐암, 두경부암, 자궁암 및 진행된 형태의 카포시 육종에 대해 강력한 활성을 나타냈습니다[3]. 탁솔은 처음으로 주목 나무의 껍질에서 생산되었습니다. 그러나 탁솔의 낮은 수율은<0.001%, i.e., to produce 1 g Taxol, it requires~10 kg of plant bark that collected from 3 to 5 trees [6], is the main challenge. In addition, the vulnerability of this plant to unpredicted fluctuations with the environmental conditions strongly influences the Taxol yield, heterogeneity, and reproducibility [7–9]. Exploring the Taxol producing potency of the endophytic fungi inhabiting medicinal plants raises the hope for overcoming the low yield by the above-mentioned method [10, 11], due to their fast growth, cost-effectiveness, independence on climatic changes, and feasibility for genetic manipulation [12, 13]. Subsequently, a plethora of endophytic fungi with metabolic potency to produce Taxol has been reported as reviewed [1, 14–25]. However, the anticipation of these fungi for industrial production of Taxol has been challenged by the attenuation and loss of Taxol productivity by the fungal storage and multiple subculturing [21, 22, 26–28]. Thus, searching for a novel fungal isolate with affordable metabolic stability and sustainability for Taxol production is the challenge. Medicinal plants of well-known ethnopharmacological relevance and traditional pharmaceutical applications could be the repertoire of novel fungal isolates with unique features of metabolic stability for Taxol biosynthesis. Among the most common medicinal plants, jojoba "Simmondsia chinensis" is a monogenetic dioecious grey-green shrub belonging to the Simmondsiaceae family. Jojoba seeds contain up to 65% of light golden and odorless high-viscosity oily metabolites [29]. Jojoba oil has been frequently used for the relief of headaches, throat inflammation, and wound treatment [30, 31]. As well as Jojoba oil has been used as an anti-inflammatory and antimicrobial agent [30, 31]. The leaves of jojoba are rich with antioxidant flavonoid compounds that are traditionally used for treating of various disorders such as 천식,염증, 그리고암[32]. 따라서, 이 작업의 주요 목적은 탁솔 생산을 위한 고유한 대사 안정성을 갖는 호호바 식물로부터 새로운 진균 분리체를 탐색하고, 탁솔 수율을 최대화하기 위한 다양한 접근법을 평가하고, 추출된 탁솔 화합물의 항증식 활성을 향상시키는 것이었습니다. 감마선 조사에 의해 매개되는 금 나노입자와의 결합을 통해.

재료 및 방법

내생성 진균의 분리 및 배양

호호바(Simmondsia chinensis)의 잎, 나무껍질, 잔가지 및 새싹과 같은 다양한 부분이 카이로 대학교 농업 학부에서 수집되어 내생 진균의 공급원으로 사용되었습니다. 식물 부분을 수집하여 흐르는 수돗물로 세척하고 표면을 70% 에탄올로 1분 동안 멸균한 다음 멸균수로 헹구었습니다[28]. 표면 멸균된 식물 부분을 멸균 조건에서 작은 조각으로 자르고 감자 포도당 한천(PDA) 배지, Czapek's-Dox 및 맥아 추출물 한천 배지[33-36]의 플레이트에 놓고 플레이트를 30도에서 10 일. 식물 부분의 표면 살균 효과는 헹굼수를 원심분리하여 평가한 다음 500 ul의 살균수를 침전물에 첨가하고 PDA 배지에 도말했습니다[37]. 정제된 내생 진균 분리주를 PDA 사면에 7일 동안 접종하고 4도에서 보관하였다.

Endophytic Fungi에서 Taxol의 스크리닝, 추출 및 정량화

호호바에 서식하는 회수된 내생 진균은 감자 포도당 국물(PDB)에서 자라면서 탁솔 생산을 위해 스크리닝되었습니다[38]. 7일 된 fun gal 분리주 각각의 플러그 하나를 100 ml의 PDB/250 ml Erlenmeyer 작업에 접종하고 30±1도에서 15일 동안 진탕 조건(120 회전수). 배양 후 배양물을 여과하고 여액을 0.2% 중탄산나트륨으로 수정하여 지방산을 침전시켰다. 탁솔은 디클로로메탄으로 추출되었으며, 유기상을 수집하고 증발 건조시켰으며, 잔류물을 메탄올에 재용해시켰다[17, 39]. 탁솔은 Merck 1mm(20×20cm) 사전 코팅된 실리카 겔 플레이트(TLC Silica gel 60 F254, Darmstadt, Germany)를 사용하여 TLC로 분리 및 식별되었으며, 254nm에서 UV 조명으로 검출되었습니다[39]. 탁솔의 추정 반점을 TLC 실리카 겔 플레이트에서 긁어내어 메탄올에 용해시키고 10분 동안 격렬하게 와동시키고 1000rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 침전된 실리카 입자를 제거하고 상등액을 C18 역상 컬럼(Eclipse Plus C18 4)의 HPLC(영인, 크로매스, 9110 플러스 Quater nary Pump, 한국)로 택솔(Taxol) 정량 및 순도 확인을 위해 취하였다.6 ×150mm, 3.5μm, 카탈로그 번호 959,963–902). 사용된 이동상은 메탄올/아세토니트릴/물(25:35:40, v/v/v)을 1.0 ml/min의 유속으로 20분 동안 [40], 탁솔 분획은 227 nm에서 측정되었고, 그들의 실제 샘플과 비교하여 머무름 시간 및 흡수 피크 면적으로부터 화학적 정체 및 농도를 확인했습니다.

회수된 내생균의 형태학적 및 분자학적 동정

내생 진균 분리주는 참조 키[33–36]에 따라 PDA, Czapek's-Dox 및 맥아 추출물 배지에서 성장하여 거시적 및 미세 형태학적 특징을 기반으로 종 수준으로 식별되었습니다. 가장 강력한 탁솔-생산 진균 분리물의 정체는 내부 전사된 스페이서(ITS)의 서열에 기초하여 분자적으로 추가로 확인되었다[41, 42]. 진균 게놈 DNA(gDNA)는 액체 질소에서 균사체(~0.2g)를 분쇄한 다음 1ml CTAB 추출 버퍼(2% CTAB, 2% PVP40, { {21}}.2% 2-머캅토에탄올, 20mM EDTA, 100mM Tris−HCl 중 1.4M NaCl, pH 8.0). PCR 프라이머 세트는 ITS4 5'-GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3' 및 ITS5 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'이었다. PCR 반응은 10 ul의 2×PCR 마스터 혼합물(i-Taq™, Cat. No. 25027), 2 ul의 gDNA, 1 ul의 각 프라이머(10 pmol/ul)를 포함하고 멸균 증류로 20 ul로 완료됩니다. 물. PCR은 94도에서 2분 동안 초기 변성, 94도에서 30초 동안 변성, 55도에서 10초 동안 어닐링, 72도에서 30초 동안 35주기, 및 최종 확장을 72도에서 2번으로 프로그래밍하였다. 최소 PCR 앰플리콘은 1kb DNA 사다리(Cat. # PG010-55DI)를 사용하여 1xTBE 버퍼(Ambion Cat# AM9864)의 1.5% 아가로스 겔로 분석하고 겔 문서화 시스템으로 시각화했습니다. 동일한 프라이머 세트를 사용하여 Applied Biosystems Sequencer, HiSQV Bases, 버전 6.0에 의해 앰플리콘을 정제하고 시퀀싱했습니다. 얻어진 염기서열은 NCBI 데이터베이스에서 중복되지 않게 BLAST 검색하여 MEGA 6.0 소프트웨어로 가져오고 Clustal W 근육 알고리즘[43]과 정렬했으며 계통수는 MEGA 6.0의 이웃 결합 방법[44]으로 구성되었습니다.

추출된 택솔의 화학 구조

탁솔의 추정 반점을 TLC 실리카겔 플레이트에서 긁어내 정제하고 순도와 농도를 정품 탁솔과 비교하여 λ 227 nm(RIGOL, Ultra-3000 시리즈)에서 UV-Vis 분석으로 결정했습니다. [39]. 동일한 조건에서 블랭크 미디어를 분광광도 분석을 위한 음의 기준선으로 사용했습니다. 정제된 탁솔 샘플의 FT-IR 스펙트럼을 JASCO FT-IR 3600 분광광도계로 분석하였다. 탁솔 시료는 KBr 펠릿으로 분쇄하고 진공 상태에서 디스크에 압착하여 원본과 비교하여 400~4000cm-1 영역에서 흡수를 측정했습니다[3]. 추출된 탁솔의 화학구조는 정통 탁솔과 비교하여 HNMR 분광기(JEOL, ECA-500II, 500MHz NMR)에서 확인하였다. 샘플은 CDCl3에 용해되었고, 화학적 이동은 ppm(δ-척도)으로 제공되었으며, 결합 상수는 헤르츠(Hz)로 표시되었습니다.

상이한 유형의 배지가 탁솔 생산에 미치는 영향

각 진균 분리물의 7일 된 배양물로부터의 2개의 한천 마개(9mm)를 100ml 배지/감자 덱스트로스(PDB), Czapek's-Dox(CZD), M1D 및 맥아 추출물(ME ) 국물 매체. 곰팡이 포자가 없는 각 배지의 무접종 대조군을 음성 대조군으로 사용하여 동일한 조건에서 15일 동안 30도에서 배양했습니다. 인큐베이션 후, 진균 배양물을 여과하고 탁솔을 추출하고 상기 언급된 바와 같이 결정하였다.

탁솔 수율을 극대화하기 위한 영양 조건의 생물공정 최적화

강력한 진균 분리주에 의한 탁솔 수율을 극대화하기 위한 배지 조성의 최적화는 Placket-Burman 설계에 이은 중심 합성 설계를 사용한 반응 표면 방법론에 의해 수행되었다[17–20, 45]. RSM 설계에서 강력한 진균 분리주에 의한 탁솔 생산에 영향을 미치는 긍정적이고 중요한 변수를 Design-Expert 7.0(Stat Ease Inc., Minneapolis, USA)의 통계 소프트웨어 패키지를 사용하여 평가했습니다. 각 실험은 세 가지 생물학적 복제로 실행되었으며 평균값이 고려되었습니다. 원하는 조건에서 인큐베이션한 후, 진균 바이오매스를 여과하고 탁솔을 추출하고 전술한 바와 같이 TLC 및 HPLC로 정량화하였다.

Placket‑Burman 디자인

Placket-Burman 설계는 탁솔 생산에 영향을 미치는 중요한 변수를 평가하는 진균 성장 및 생리활성 2차 대사산물의 생산을 위한 배지 구성 요소의 최적화에 자주 사용되었습니다[18, 20, 46]. 요인의 선택은 정성적 및 정량적 스크리닝에 사용되는 매체를 기반으로 했습니다. 11가지 요소가 포함되었습니다. malt extract, peptone, sucrose, soytone, glutamine, beef extract와 온도, pH, 배양시간, 진탕속도 값 및 요인을 2단계로 변화시켜 최소 및 최대 범위를 선택하였다. 통계적 Design-Expert 7.0을 사용하여 12개의 실험 세트를 생성했습니다. 각 실험에 대해 탁솔 생산은 3개의 생물학적 복제에서 결정되었고 탁솔 수율의 평균이 고려되었습니다.

데이터의 회귀 분석은 통계 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 다음 방정식을 사용하여 각 변수의 효과를 계산했습니다(Biometrika, 2020).

여기서 E는 테스트 변수의 효과, M + 및 M-는 매개변수가 각각 더 높은 수준과 더 낮은 수준에 있을 때의 탁솔 시험 농도이고, N은 수행된 실험의 수입니다. 생산에 대한 각 변수의 영향은 각각의 E-값을 계산하여 결정되었습니다.

여기서 Tot high는 높은 수준의 총 응답 수이고, Tot low는 낮은 수준의 총 응답 수이며, No는 시행 횟수입니다.

중심 합성물 설계 및 택솔 생산에 영향을 미치는 요인 간의 상호작용

선택된 균류 분리체에 의한 탁솔 생산에 영향을 미치는 가장 중요한 긍정적 요인은 반응 표면형 CCD 모델 실험 설계를 사용하여 최적화되었다[47]. CCD를 사용하여 배지 구성 요소의 농도를 최적화하고 연구된 상호 작용을 사용하여 세 가지 변수에 대해 총 20개의 실험을 생성했습니다. 유력한 진균 분리주로부터 택솔 생산을 위한 변수의 최적 수준을 결정하기 위해, 다양한 인자 사이의 상호작용을 연구하고 탁솔 생산에 영향을 미치는 각 인자의 변수 조건을 결정하기 위해 3차원(3D) 반응 표면 곡선을 플롯하였다. 3D 그래프는 이상적인 수준에서 세 가지 요소의 상수를 유지하고 다른 두 가지 요소의 다양한 수준에 대한 탁솔 수율의 응답을 플로팅하여 수행되었습니다.

탁솔 수율에 대한 감마선 조사의 영향

탁솔을 생산하는 강력한 내생균주를 60코발트 소스(감마 세포4000-A-India)에 다양한 감마선 선량(0.25–3.0 kGy)으로 조사했습니다. 조사되지 않은 배양의 제어; 실험 당시 선량률 1.2 kGy/h. 대조군으로서 조사되지 않은 포자의 접종물과 비교하여 표준 배양 조건 하에서 조사된 배양액을 최적화된 배지에 접종하였다. 배양물을 회전 진탕기(120rpm)에서 15일 동안 30±2도에서 배양하였다. 인큐베이션 후, 배양물을 여과하고 탁솔을 추출하고, 정제하고, 전술한 바와 같이 TLC 및 HPLC로 정량하였다.

금 나노입자(AuNP)의 합성 및 특성화; 탁솔과의 접합

탁솔의 항암활성

간암(HPG2) 및 유방암(MCF7)에 대한 정제된 탁솔 및 탁솔-PVP-AuNP 접합체의 활성은 3-(4,5-디메틸티아졸- 2-일) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) 분석[48]. 96-웰 플레이트에 웰당 103개의 세포를 접종하고 37℃에서 밤새 배양한 다음 다양한 농도의 약물을 첨가하고 플레이트를 48시간 동안 다시 배양했습니다. MTT 시약(25 ul)을 첨가하고 2시간 동안 배양한 후, 발달된 formazan 복합체의 보라색을 λ570 nm에서 측정하였다. IC50 값은 양성 대조군으로 정상화되는 초기 종양 세포 수의 50% 성장을 감소시키는 약물의 양으로 표현되었습니다.

탁솔 및 탁솔-AuNP 접합체의 항균 활성

탁솔 및 탁솔-AuNPs 접합체의 항균 활성을 상이한 박테리아 분리물에 대해 평가하였다; Bacillus subtilis ATCC 6633 및 Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli 및 Enterobacter agglomerans, Candida albicans. 테스트된 박테리아 세포를 멸균 펩톤수에 현탁하여 λ6{{18 }}0nm. 미생물 병원체 성장의 성장 억제(mm)는 한천 디스크 확산법으로 평가하였다. 직경 6.0mm의 멸균 표준 항생제 디스크를 양성 대조군으로 사용했습니다. 멸균 항생제 디스크(6.0mm)에 20ul의 메탄올과 음성 및 양성 대조군으로 amoxicillin-clavulanic acid(AMC)를 넣었습니다. 디스크에는 동일한 농도의 탁솔, 탁솔-PVP-AuNP 및 AuNP(1.0 ug/ml)가 로드되었습니다. 3개의 생물학적 복제물이 준비되었습니다. 플레이트를 37도에서 24시간 동안 배양하고 억제 구역을 측정했습니다. 탁솔의 항균 활성을 정상화하기 위해 Amoxicillin clavulanic acid(AMC)와 nystatin을 사용하였다. 성장 억제 구역은 버니어 캘리퍼스(mm)로 측정하였다.

통계 분석

강력한 탁솔 생산자의 형태학적 및 분자적 동정

물질 및 방법에 기술된 거시적 및 미시적 설명 키에 따라 탁솔을 생성하는 유력한 진균 분리주의 형태학적 특징을 조사하였고, A. favus와의 형태학적 근접성을 밝혔다(도 2). PDA에서 30도에서 10일 동안 배양한 결과 거시적 및 미시적 특징은 보편적인 기준에 따라 분생포자 머리, 분지 방식, 암술머리의 정체, 분생포자의 존재론, 자실체 형성 등의 정체를 나타냈다. 형태학적 키[33], 그리고 Aspergillus favus와 동일한 것으로 밝혀졌습니다. 강력한 탁솔 생산 분리주 A. favus는 gDNA를 주형으로 사용하여 ITS 서열을 기반으로 추가로 식별되었습니다. A. favus의 PCR 앰플리콘(~550bp)을 분리, 정제 및 시퀀싱했습니다(그림 2). A. favus의 ITS 시퀀스는 NCBI 데이터베이스에서 중복 검색되지 않았으며 A. favus와 99%의 유사성, E. 값이 0, 쿼리 적용 범위가 95%인 것으로 나타났습니다. 따라서 현미경 및 분자분석 결과 표적 분리주는 A. favus로 확인되어 GenBank에 수탁번호 MW485934.1로 기탁되었으며, 이집트 Assiut University Mycological Center(AUMC)에 기탁되었다. 기탁 번호 AUMC13892. 현재 분리주는 A. favus 분리주 MW485934, MT446145, KJ863514, MW522551,

그림 1 호호바 식물의 형태학적 모습. 강력한 탁솔 생산 내생 진균의 B 플레이트 배양; A. favus Bd1(13), A. niger Lv1(21), Penicillium polonium(23) 및 A. oryzae Bd(25) PDA에서 30도에서 8일 배양 후. 곰팡이 분리균을 PDB에서 성장시키고 표준 조건에서 배양하고 탁솔을 추출하여 TLC로 확인하였다(C). D 유력한 진균 분리물로부터의 탁솔(Taxol)의 HPLC 크로마토그램. E HPLC로부터 정량화된 탁솔의 수율. F, 곰팡이 분리물로부터 추출된 탁솔의 UV-Vis 스펙트럼 분석. G 추출된 탁솔과 정품 탁솔의 FT-IR 분석

그림 2 A. PDA에서 3, 5, 8일 성장 후 A. favus 호호바 내생 식물의 거시적 특징. 400X 배율로 확대한 A. favus의 분생포자 머리의 미세 형태적 특징. 500bp의 A. favus ITS 영역의 C PCR 앰플리콘, 1kb 사다리로 정규화(Cat.#. SM0312). D 최대우도법에 의한 ITS A. favus의 계통발생학적 분석 [44]