국소 비뇌하수체 성장 호르몬은 노화로 유도되고 상피 손상을 촉진합니다

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요약

연령 관련 DINA 손상을 조절하는 미세 환경 요인은 불분명합니다. 비뇌하수체 성장 호르몬(np)은 인간 결장, 형질전환되지 않은 인간 결장 세포, 섬유아세포, 그리고 3-나이 관련 DNA 손상이 있는 차원 장 오르가노이드에서 유도됩니다. Autocrine/paracrine npGH는 TRIM29를 유도하고 ATM 인산화를 감소시켜 p53을 억제하고 DNA 손상 반응(DDR)을 약화시켜 DNA 복구 및 DNA 손상 축적을 감소시킵니다. 최대 4개월까지 배양된 오르가노이드는 npGH 증가, p53 억제 및 DDR 약독화와 함께 노화 마커, p16 및 SA{9}}갈락토시다제 및 텔로미어 길이 감소 및 DNA 손상 축적을 나타냅니다. 노화된 오르가노이드에서 GH를 억제하면 p53이 증가하고 DNA 손상이 감소합니다. WT 생쥐는 연령 의존적 결장 DNA 손상 축적을 나타내는 반면 결장 GH 신호가 없는 나이든 생쥐에서는 p53이 상승하여 DNA 손상이 낮게 유지됩니다. 연령 관련 npGH 유도가 증식성 미세 환경을 가능하게 하므로 npGH 신호를 폐지하는 것은 DNA 손상 및 연령 관련 병리를 방해함으로써 노화 방지 요법으로 표적이 될 수 있습니다.

소개

생물학적 기능은 노화와 함께 노화 관련 질병의 증가와 함께 감소합니다.플라보노이드연령 관련 병리는 돌연변이 및 연령 관련 염색체 이상을 유발하는 축적된 DNA 손상 및 DNA 복구의 결핍에 의해 유발됩니다. 지속적인 DNA 손상은 또한 세포 증식을 차단하여 노화와 세포자멸사를 초래하여 노화 과정을 더욱 촉진할 수 있습니다(Ou and Schumacher, 2018). DNA 손상은 이중 가닥 DNA 파손(DSB)의 마커인 증가된 인산화된 히스톤 2A 변이체(yH2AX)에 의해 입증된 바와 같이 야생형(WT), 형질전환되지 않은 인간 및 쥐 세포에서 나이가 들면서 축적됩니다(Sedelnikova et al., 2004) 및 복구되지 않은 DNA 손상(Dolle et al., 1997; Hasty et al., 2003; Lombard et al., 2005; Petr et al., 2020). 결함이 있는 DNA 손상 복구로 인한 게놈 불안정성은 세포 변형에 유리할 수 있습니다(Negrini et al., 2010). DNA 손상은 단일 가닥 DNA 파손 및 DSB의 복구를 담당하는 운동실조-모세혈관확장증 돌연변이(ATM) 유전자의 인산화를 유발합니다. ATM은 종양 억제인자 p53을 인산화하고 안정화시켜 여러 DNA 복구 경로를 촉진하여 DNA 손상 복구를 보장합니다. 따라서 ATM은 DNA 손상 반응(DDR)과 DNA 복구를 모두 활성화하는 데 핵심적인 역할을 합니다(Ou and Schumacher, 2018).

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ATM 발현과 활동은 나이가 들면서 악화되며(Feng et al..2007; Gutierrez-Martinez et al.,2018), 나이와 관련된 기능적 p53 손실을 초래하고 축적된 DNA 손상과 염색체 불안정성을 초래할 가능성이 있습니다(Simon et al., 2009) 방사선과 같은 스트레스 요인에 대한 .p53 반응은 나이든 쥐(Feng et al., 2007)와 나이든 개체에서 유래한 인간 진피 섬유아세포(Goukassian et al., 2000)에서 더 낮습니다. 따라서 노화의 특징은 DDR 활성 감소와 복구되지 않은 DNA 손상이 축적된 p53 억제를 포함하며, 이는 모두 상피 증식에 유리한 환경을 가능하게 합니다(Lopez-Otin et al., 2013).

뇌하수체 성장 호르몬(GH) 분비가 나이와 함께 감소함에 따라 변경된 GH 신호전달이 노화 과정과 관련이 있습니다(Ho and Hoffman, 1993). 그럼에도 불구하고, 노화에 대한 GH 감쇠의 유익한 효과를 뒷받침하는 증거가 있습니다. 세포에서 쥐 및 인간 질병 모델(Brown-Borg et al., 1996; Junnila et al., 2013)에서 GH 결핍의 이점은 주로 인슐린 감수성 향상, 간 단백질 산화 감소를 포함하여 수명을 연장하는 2차 요인을 선호하는 관찰에서 비롯됩니다. , 암 발병률 감소 및 연령 관련 염증 감소(Aguiar-Oliveira and Bartke, 2019; Bartke, 2016; Junnila et al., 2013; Spadaro et al., 2016). Leiden 연구 가족의 가족 수명과 사망률 감소 환경적으로 일치하는 대조군보다 통합 순환 GH 수준이 낮은 반면(van der Spoeletal., 2016), GHexcess는 말단 비대증 환자에서 볼 수 있듯이 수명을 감소시킵니다(Chesno-kova et al., 2019a; Melmed, 2020; Waters and Barclay, 200 7) 및 GH를 과발현하는 형질전환 뮤린 모델에서(Bartke, 2003).헤스페리딘 사용일부에서는 인간(He et al., 2014; Samaras and Storms, 1992)과 개(Greer et al., 2007)의 키와 수명 사이에 음의 상관관계가 있다고 제안했습니다. 우리는 노화에 대한 유해한 GH 영향이 적어도, 부분적으로 축적된 DNA 손상에 기인합니다(Ches-nokova 및 Melmed, 2020). 이 전제를 뒷받침하기 위해 말단 비대증 환자에서 유래한 림프구는 염색체 이상 증가와 함께 DNA 손상을 나타내는 반면(Bayram et al., 2014), 수리되지 않은 DNA 손상은 제브라피쉬 말단 비대 모델의 간에 축적됩니다(Elbialy et al., 2018). 높은 순환 GH 수준은 쥐의 결장 DNA 복구를 약화시켜 DNA 손상 축적을 유발하는 반면, DNA 손상은 인간 결장 세포와 GHR 신호 전달이 중단된 생쥐에서 GH 수용체(GHR)를 차단한 후 약화됩니다(Chesnokova et al., 2019a).

말초 조직에서 국소적으로 합성되는 비뇌하수체 GH(np)는 뇌하수체에서 생성되는 내분비 GH1과 동일하며 뇌하수체 GH 및 npGH 리간드를 모두 인식하는 널리 발현되는 GHR(Ballesteros et al., 2000)을 통해 자가분비/주변분비 기전을 통해 작용합니다. Waters and Barclay, 2007, Waters et al, 2006).잃어버린 제국DDR 활성화가 npGH를 유도함에 따라(Chesnokova et al., 2013), 우리는 연령 관련 축적된 결장 DNA 손상이 npGH 발현을 유도하고, 이는 차례로 DNA 손상 복구를 더욱 제한할 것이라는 가설을 세웠습니다.

Cistanche 캔 안티 에이징

노화를 반영하는 시험관 내 및 생체 외 인간 모델을 모두 사용하여 H2AX 인산화 증가(yH2AX)에 의해 입증된 바와 같이 npGH가 유도되고 DNA 손상이 노화된 인간 조직에 축적됨을 보여줍니다. 또한, 결장 DNA 손상은 노화된 WT 마우스에서 상당히 증가하는 반면, 상피 DNA 손상은 GH 신호가 없는 연령 일치 GHR{4}}마우스 및 결장 특이적 GHR 녹아웃 마우스(GHRcolKO)에서 낮게 유지됩니다.

국소 npGH는 유도된 인간 다능성 줄기 세포(iPSC)에서 생성된 노화된 3-차원(3D) 장내 오르가노이드에서도 유도되었습니다(Barrett et al, 2014; Chesnokova et al, 2019a). Organoid npGH는 차례로 p53을 억제하고 DNA 손상 복구를 약화시켰습니다.미분화 정제 플라보노이드 분획 1000 mg 사용npGH의 효과는 GH 발현 섬유아세포를 인간 콜로노이드가 내장된 결장 칩 미세유체 장치와 함께 배양하여 p53/p21을 억제하고 DNA 손상을 강화하기 때문에 측분비일 가능성이 높습니다. 대조적으로, 노화된 오르가노이드에서 GH를 억제하면 DNA 손상을 예방할 수 있습니다.

따라서 우리는 상피 npGH가 노화 동안 강력하게 유도되고 npGH가 DNA 복구를 감소시키고 노화 관련 DNA 손상 축적을 촉진한다는 것을 보여줍니다. 전반적으로, 결과는 국소 결장 상피 npGH가 점막 장 변화를 유발하여 노화 조직의 신생물 발달에 유리한 염색체 불안정 환경을 생성함을 시사합니다.

중요한 것은 노화 과정에 대한 강력한 영향이 없음에도 불구하고 "항노화" 호르몬으로 GH를 부적절하게 널리 사용하고 있음에도 불구하고(Blackman et al., 2002; Clemmons et al..2014; Lieut al., 2007; Melmed, 2019), 우리의 결과는 국소 GH 신호가 조직 미세 환경에 기여하여 연령 관련 병리의 발달을 촉진한다는 것을 보여줍니다. 따라서 불리한 상피 DNA 손상을 억제하기 위해 국소 npGH 신호를 억제하는 것은 무형성 노화 치료 표적을 제공할 수 있습니다. 이러한 연구의 결과는 수명 연장(즉, 국소 GH 신호 유도보다 억제)에 대한 혁신적인 접근 방식을 알려줍니다. 결과

인간의 결장 DNA 손상 및 npGH는 노화와 함께 축적됩니다.

연령 관련 DNA 손상은 3개 연령 그룹에 걸친 환자 코호트에서 파생된 비종양성 인간 결장 파라핀 조직 샘플에서 평가되었습니다. {{6 년). yH2AX에 대해 점수를 매겼을 때, 젊은 코호트의 11개 샘플 중 3개(27%)에서 DNA 손상이 나타났고, 16개 중 8개(50%)가 중년에 DNA 손상을, 18개 중 8개(45%)에서 DNA 손상이 나타났습니다(그림 1A{18}}C 및 1J).

우리가 이전에 DNA 손상이 npGH를 유도한다는 것을 보여주었듯이(Chesnokova et al, 2013), 우리는 DNA 손상의 연령 의존적 축적이 비종양성 결장 조직에서 GH 발현과 관련이 있는지 여부를 결정하고자 했습니다. 신경내분비 결장 세포에서는 no가 발현되기 때문에(Chesnokova et al, 2016), 분석에서 이러한 세포를 제외했습니다.

상피 GH 발현은 중년 및 노년층(각각 38개 및 42개 시료)에서 추출한 정상 결장 시료의 16% -17%에서 검출되었지만 젊은 집단(37개 시료)의 2%에서만 검출된 반면, GH 발현 점수는 중년 코호트에서 증가했으며 노인 코호트 샘플에서 추가로 증가했습니다(p<0.01) (figures="" 1d-1f="" and="" 1k).="" furthermore,="" colon="" mrna="" gh="" expression="" increased="" in="" both="" middle-aged="" (30%="" of="" 10="" samples)="" and="" aged="" (26%="" of="" 14="" samples)="" versus="" young="" cohort="" samples(17%="" of9=""><0.01 and=""><0.05, respectively)(figures="" 1g-1).="">오테플라보노이드요약하면, 이러한 결과는 노화 결장에서 유도되지 않은 DNA 손상 축적을 가리킵니다.

DDR 활성화는 국소 npGHin 뮤린 및 인간 결장을 유도합니다

다음으로 활성화된 DDR이 국소 결장 npGH 발현을 유발하는지 여부를 고려하고 p53을 안정화하기 위해 nutlin3으로 마우스를 처리하고(Vassilev et al, 2004) 유도된 결장 p53 이상을 관찰했습니다(그림 2A). DNA 손상 요법 전후(표 S1), 우리는 연구된 6명의 환자 샘플 모두에서 치료 전 기준 상피 npGH 발현과 치료 후 증가된 npGH 발현을 관찰했습니다(p<0.01) (figure="" 2b).="" enhanced="" gh="" expression="" was="" also="" observed="" in="" tumor-associated="" fibroblasts="" after="" dna="" damage(figure="" 2c),="" indicating="" that="" these="" findings="" are="" likely="" not="">

DDR은 시험관 내에서 GH 발현을 활성화합니다

우리는 단일 가닥 DNA 절단과 DSB(Walles et al, 1996)를 모두 생성하고 DDR이 시험관 내에서 GH를 활성화하는지 여부를 결정하기 위해 토포이소머라제 II 억제제 에토포사이드를 사용했습니다. NCC, hNCF 및 HCT116인간 결장 선암종 세포에서 DNA 손상 유발 npGH(도 3A 및 S1A-S1C); 오르가노 이드에서 에토포사이드 유도 GH 및 GH mRNA(그림 3B 및 S1D), IGF1 및 프로락틴 mRNA 수준은 변하지 않았습니다(그림 S1E). 다운스트림 GH 신호인 STAT5 인산화(Waters, 2016)는 모든 세포 유형에서 유도되었습니다(그림 3A{17}}C 및 S1A-S1C). 대조적으로, GH small interfering RNA(siRNA)로 npGH를 제거하면 etoposide가 pSTAT5를 유도하는 것을 방지하여(그림 3C 및 S1F), DNA 손상 유도 결장 npGH가 기능적으로 활성이라는 증거를 제공합니다. 24시간 동안 에토포사이드로 처리된 NCC의 영상화는 여러 세포에서 GH 및 yH2AX 공동 발현을 보여주었습니다(그림 3D).

DNA 손상을 받는 상피 세포는 GH를 분비합니다. 유도된 세포 내 npGH가 자가분비/주변분비 효과를 발휘하는지 여부를 결정하기 위해 우리는 에토포사이드 처리 후 NCC 및 오르가노이드 배양 배지로 분비되는 GH 수준을 평가했습니다. 처리 후 8시간 및 24시간에 ANCC에서 수집하고 처리 후 4-48시간에 오르가노이드에서 수집된 배지는 DDR 활성화 후 시간 의존적 GH 증가를 보여주었습니다(그림 3E). NCC와 오르가노이드는 인간 결장 조직과 마찬가지로 GH 수용체를 발현하기 때문에(Chesnokova et al., 2016), 이러한 결과는 DNA 손상에 대한 반응으로 유도된 국소 GH가 노화 조직을 자가분비/주변분비 작용에 노출시킬 수 있음을 시사합니다.

Autocrine/paracrine GH는 인간 결장 세포 p53을 억제합니다

내분비 GH가 쥐의 결장 p53을 억제함에 따라(Chesnokova et al, 2016), 우리는 국소 GH가 인간 상피 결장 세포에서 유사한 au-자가분비/주변분비 효과를 발휘하는지 여부를 결정했습니다. hGH를 사용한 뉴클레오펙션 또는 렌티바이러스 발현 GH(lenti-GH)(그림 4A, 4B 및 S2)와 hGH를 안정적으로 발현하는 오르가노이드(그림 4C)로 감염 후 두 명의 다른 환자에서 파생된 두 개의 개별 NCC 라인의 분석은 억제된 것으로 나타났습니다. p53 및 수반되는 과발현. lenti-GH 또는 bromodeoxyuridine(BrdU)으로 펄싱된 빈 벡터(lenti-V)로 감염된 오르가노 id에서 파생된 세포는 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 평가된 바와 같이 겸손하지만 유의하게 증가된 BrdU 혼입이 뒤따르는 p53 억제를 나타냈습니다(그림 S3A). 대조적으로, 작은 헤어핀 GH(GH)를 발현하는 렌티바이러스를 사용한 GH 억제는 NCC에서 집락 형성 및 집락 크기를 감소시켰으며(그림 S3B 및 S3C), 이는 친문학 npGH 활동을 나타냅니다.

인간 결장-칩의 측분비 GH 효과 장 점막 상피 세포에 대한 npGH의 측분비 효과를 평가하기 위해, 우리는 lenti-GH에 감염된 UNCF와 건강한 결장 칩 미세유체 장치(Kasendra et al, 2020)를 공동 배양했습니다. 8일 동안 오르가노이드 유래 상피 세포. hNCF에서 배지로의 국소 GH 분비는 ELISA(338ng/mL/1x10도 세포)에 의해 확인되었습니다.{10}}Ethynyl{11}}'-deoxyuridine(EdU)(20μM)은 7일째에 추가되었습니다. , 칩은 24시간 후에 고정되었고, EdU 및 H2AX에 대해 염색되었고, EdU 플러스 핵은 상피 세포에서 계수되었습니다. 시드된 별도의 칩 세트

웨스턴 블롯에 의해 p53/p21을 평가하기 위해 상피 세포를 사용하였다. 칩 상피 세포의 증식이 증가했습니다(p<0.05), likely="" due="" to="" decreased="" p53="" and="" p21="" (figures="" 4d="" and="" 4e).="" moreover,="" dna="" damage="" accumulation="" was="" evident,="" with="" increased="" numbers="" of="" cells="" expressing="" γh2ax="" （p=""><0.01） （figure="">

자가분비/주변분비 GH는 DDR을 억제합니다.

DNA 손상 시 ATM의 활성화는 손상된 DNA 부위를 표시하여 DDR을 활성화하고 복구를 촉진하는 H2AX를 인산화합니다(Turinetto and Giachino, 2015). ATM은 또한 p53을 인산화하여 DNA 복구를 더욱 향상시킵니다(Blackford and Jackson 2017). hNCC와 pIRES{4}}ZsGreen1hGH 또는 lentil-GH에 감염된 오르가노이드에서 GH 과발현은 DNA 복구에 관여하는 ATM 및 DNA-단백질 키나제(PK)cs의 인산화를 억제했습니다(Blackford 및 Jackson. 2017), 표적 단백질 p53의 인산화 감소(그림 5A{11}}C).

Tip60 히스톤 아세틸라제는 ATM을 활성화하고(Jackson and Bartek, 2009) TRIM29에 의해 부정적으로 조절됩니다(Sho et al., 2011; Sun et al, 2005). 우리는 NCC 및 오르가노이드에서 GH 과발현이 TRIM29 유도를 초래하여 결국 Tip60을 억제한다는 것을 관찰했습니다(그림 5A-5C). 유사한 결과가 GH를 발현하는 플라스미드로 뉴클레오펙션한 후 48시간 후 및 lenti-GH로 감염 후 6일째에 두 번째 NCC 라인에서 관찰되었습니다(그림 S4A 및 S4B).

자가분비/주변분비 GH는 DNA 복구를 약화시킵니다.

다음으로 DSB 수리 메커니즘, 특히 오류가 발생하기 쉬운 비-상동 말단 결합(NHEJ)(Jackson and Bartek, 2{18}}09) 및 오류 방지 상동 재조합(HR)(Beucher et al., 2009)에 대한 영향을 측정했습니다. , Blackford 및 Jackson, 2017, Chapman et al., 2012). NHEJ 및 HR 리포터 카세트를 안정적으로 발현하는 NCC를 pcDNA3.{8}}인간 GH1(hGH1) 플라스미드로 뉴클레오펙션하고 I-Excel 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 플라스미드로 공동 형질감염시켜 DSB를 유도하고 DSB 복구 리포터의 재결합을 측정했습니다. 형질감염 효율은 DsRed를 코딩하는 플라스미드로 공동 형질감염시켜 제어하였다(Seluanov et al, 2010). pcDNA3.{16}}hGH1 뉴클레오펙션 후 NHEJ 효율은 0.{19}}.83이었고 48h(p<0.05)(figure5d), and="" hr,while="" low(0.05),="" consistent="" with="" other="" reports="" (chitnis="" et="" al,2014;gatei="" et="" al.,2011),showed="" consistently="" decreased="" efficiency="" by="" up="" to="" 38.7%±3.5%="" (n="4" independent=""><0.05) at="" 72="">

자가분비/주변분비 GH는 복구되지 않은 DNA 손상을 증가시킵니다.

npGH가 DNA 손상을 증가시키는지 조사하면서 우리는 lenti-GH로 안정적으로 형질감염된 NCC와 오르가노이드가 Comet 분석(p< 0.05)="" (lee="" and="" paull,="" 2007)(figures="" 5e="" and="" 5f).="" levels="" of="" unrepaired="" dna="" were="" also="" markedly="" increased="" in="" a="" second="" ncc="" line="" in="" cells="" nucleofected="" with="" a="" plasmid="" expressing="" gh="" or="" infected="" with="" lenti-gh="" (figures="" s4c="" and="" s4d).="" overall,="" these="" results="" show="" that="" npgh="" is="" induced="" in="" response="" to="" dna="" damage="" and="" enhances="" dna="" damage="" accumulation="" by="" interfering="" with="" both="" ddr="" and="" dna="" repair="">

GH는 노화된 3D 인간 장내 오르가노이드에서 유도되고 DDR을 약화시킵니다.

노화된 인간 결장 표본에서 관찰된 증가된 GH 발현 및 DNA 손상에 이어, 노화된 인간 조직의 모델을 요약하기 위해 3개의 독립적인 iPSC 라인에서 생성된 오르가노-이드를 "노화"했습니다. 이러한 오르가노이드는 장세포, 잔 세포, Paneth 세포 및 장내분비 세포로 구성되며 꼬리형 호메오박스 2(CDX2)를 발현합니다(Barrett et al..2014; Gao et al.,2009; Workman et al.,2017). 3개의 iPSC 계통 중 2개(1행 및 3행)는 60세 이상의 개인에게서 얻었고 세 번째 iPSC 계통(2행)은 30-세 개인의 섬유아세포에서 파생되었습니다. 라인 1과 3에서 생성된 오르가노이드는 최대 2개월 동안 배양되었으며, 이 시점에서 세포 증식이 상당히 느려졌습니다. 대조적으로, 라인 2에서 생성된 오르가노이드는 최대 4개월 동안 배양에서 강력하게 증식했습니다. 세포 노화는 p16 증가와 텔로미어 길이 감소에 의해 세 계통 모두에서 확인되었습니다(p<0.05)(figures 6a="" and="" 6b).="" in="" aged="" organoids,="" we="" also="" found="" increased="" senescence-associated="" β-galactosidase="" (sa-β-galactosidase)="" activity,="" which="" has="" been="" shown="" to="" increase="" with="" age="" (kurz="" et="" al.,="" 2000;="" lee="" et="" al.,="" 2006),="" as="" well="" as="" increased="" β-galactosidase="" protein="" expression,="" which="" correlates="" with="" sa-β-galactosidase="" enzymatic="" activity(figures="" 6a="" and="">

이러한 시험관 내 오르가노이드 기능은 노화 인간 조직과 일치하는 세포 변화를 충실하게 재현하는 것으로 보이기 때문에(Baker et al.,2{7}}11;Lieut al.,2019; Lopez-Otin et al.,2013), 우리는 이것을 사용했습니다. 인간 결장 상피 노화의 기본 신호 메커니즘을 추가로 연구하는 모델. 1행에서, GH mRNA 수준은 배양 1개월 후에 유도되었고 2개월 후에 추가로 증가했습니다(p <0.05)(그림 6c),="" 이는="" 웨스턴="" 블롯="" 및="" 면역조직화학(ihc)="" 모두에서="" 노화된="" 오르가노이드에서="" 볼="" 수="" 있는="" 유의하게="" 증가된="" npgh와="" 일치합니다.="" (그림="" 6d,="" 6e="" 및="" s5b).="" yh2ax는="" 또한="" 장기간="" 배양으로="" 강력하게="" 유도되었으며,="" 이는="" 시험관="" 내="" 노화로="" 축적된="" 내인성="" dna="" 손상을="" 나타냅니다.="" ncc="" 및="" gh로="" 형질감염된="" 오르가노이드에서="" 억제된="" p53을="" 보여주는="" 결과와="" 일관되게(그림="" 4a{17}}c),="" 우리는="" npgh="" 증가와="" 일치하여="" 배양="" 1개월="" 및="" 2개월에서="" 억제된="" p53을="" 관찰했습니다(그림="" 6e="" 및="" s5b).="" 유사한="" 결과(="" a="" 및="" b)="" (a)="" ancc,="" hncf="" 및="" hct116="" 세포="" 및="" (b)="" 오르가노이드의="" 웨스턴="" 블롯.="" 세포를="" 표시된="" 용량의="" 에토포사이드로="" 처리하고="" 24시간="" 후에="" 분석했습니다.="" 오르가노이드는="" 3="" um="" 에토포사이드(etop)로="">

(C) 24시간 동안 대조군으로 GH siRNA(siGH RNA) 또는 스크램블 RNA(Scr RNA)로 뉴클레오펙션된 NCC를 표시된 용량의 에토포사이드(Etop)로 처리하고 24시간 후에 분석했습니다. 웨스턴 블롯의 ImageJ 정량화는 그림 S1에 나와 있습니다.

(D) 24시간 동안 20μM 에토포사이드로 처리된 NCC의 대표적인 이미지. GH, 빨강; yH2AX, 녹색; 팔로이딘, 회색; DAPI, 파란색. 밝은 녹색 핵은 세포 사멸을 나타냅니다. 스케일 바, 20um. 대조군, 처리되지 않은 세포.

(E) 각각 20 또는 5 uM 에토포사이드로 처리된 ANCC 및 오르가노이드의 배양 배지에서 GH의 웨스턴 블롯. 배지는 처리 후 4-48시간에 열 8 및 24시간에서 그리고 오르가노이드에서 수집되었습니다. Ponceau는 로딩 컨트롤로 사용되었습니다. 적어도 3개의 독립적인 실험에서 대표적인 오점이 표시됩니다.

iPSC 라인 2 및 3에서 생성된 오르가노이드를 각각 4개월 및 2개월 동안 배양하여 얻었다(도 S6A-S6D).

또한, 노화된 오르가노이드에서 증가된 npGH는 ATM 및 DNA-PKcs 둘 다의 억제된 인산화 및 낮은 수준의 인산화된 p53과 함께 약독화된 DDR과 연관되었습니다(그림 6E 및 S5B). 이러한 결과는 억제된 DDR 활성이 yH2AX 유도에 의해 입증된 바와 같이 누적된 복구되지 않은 DNA 손상을 초래함을 시사합니다(그림 6E 및 S5B). 배양 2개월 후, GH shRNA로 감염된 노화된 오르가노이드는 증가된 p53(그림 6F 및 S7A)과 Comet 분석에 의해 측정된 감소된 DNA 손상을 보여주었습니다(p<0.01)(figure 6g),="" indicating="" a="" requirement="" for="" npgh="" in="" age-related="" dna="" damage="" accumulation="" in="" this="">

GH 신호 결핍은 노화 마우스에서 생체 내 결장 DNA 손상을 약화시킵니다

노화된 오르가노이드에서 얻은 결과를 확인하기 위해 생체 내에서 노화된 WT 및 GHR{0}} 마우스를 연구했습니다. 결장 DNA 손상은 노령(24-개월) 대 젊은(3-개월) WT 생쥐에서 유의하게 증가했습니다(p<0.01), but,="" strikingly,="" was="" not="" increased="" in="" aged="" ghr-mice="" (figures="" 7a="" and="" s7b),="" likely="" due="" to="" p53="" in-duction.="" we="" also="" generated="" transgenic="" mice="" with="" colon-specific="" ghr="" excision="" (car1-cre/ghr"loxmox,="" ghrcolko)(figure="" s7d).="" control="" mice="" were="" derived="" from="" the="" same="" breeding,="" but="" they="" did="" not="" harbor="" the="" cre="" enzyme.="" colon="" dna="" damage="" was="" much="" reduced="" in="" 20-month-old="" male="" ghrcolko="" mice="" with="" ghr="" excision="" compared="" to="" control="" mice,="" but="" not="" in="" the="" small="" intestine="" with="" intact="" ghr(figure="" 7d).="" thus,="" it="" appears="" that="" dna="" is="" repaired="" more="" efficiently="" in="" mice="" devoid="" of="" gh="" signaling,="" likely="" due="" to="" the="" higher="" colon="" p53="" expression="" we="" observed="" in="" both="" ghr-/-and="" in="" ghrcolko="" animals(figures="" 7b,7c,="" 7e,="" s7c,="" and="" s7e).="" these="" in="" vivo="" results="" buttress="" our="" hypothesis="" that="" npgh="" en-hances="" age-associated="" colon="" dna="" damage="">

논의

우리는 여기서 npGH가 인간 결장 조직 및 3D 인간 장 오르가노이드에서 나이에 따라 증가한다는 것을 보여줍니다. 우리는 상피 비종양 세포, 정상 결장 섬유아세포, 오르가노이드 및 DNA 손상 요법을 받는 환자의 결장암 조직을 포함하여 인간 모델에서 관찰된 바와 같이 노화된 인간 결장 조직에서 npGH가 DNA 손상에 의해 유도된다는 여러 증거를 보여줍니다. ; 우리는 또한 활성화된 DDR이 있는 마우스의 결장에서 생체 내에서 유사한 결과를 보여줍니다.

3D 인간 장 오르가노이드를 사용하여 우리는 증가된 p16, 노화 및 텔로미어 단축을 관찰했으며, 이는 모두 인간 조직의 연령 관련 변화와 일치합니다(Baker et al., 2011; Liu et al., 2019; Lopez-Otin et al., 2013 ). 오르가노이드 모델의 한계에도 불구하고, 우리의 결과는 연령 관련 결장 변화의 기초가 되는 신호 메커니즘을 연구하기 위한 충실한 인간 요약으로서 장 오르가노이드를 지지합니다(Hu et al., 2018).

우리는 자가분비/주변분비 방식으로 작용하는 국소 npGH가 p53을 억제하고 이웃 세포 증식을 증가시킨다는 것을 발견했습니다. 유도 GH는 또한 DDR 및 DNA 복구를 억제하여 DNA 손상 축적을 더욱 강화합니다. 결과는 또한 GH-분비 인간 뇌하수체 종양 내에서 DNA 손상 축적에 대한 관찰된 효과와 일치합니다(Ben-Shlomo et al., 2020).

정상 결장 조직에서의 GH 작용은 20세 이상의 환자에서 결장암 유병률의 동인으로서 연령 관련 DNA 손상 및 염색체 불안정성으로 예시되는 연령 관련 결장 폴립 비율의 기초가 될 수 있는 증식 촉진 환경의 발달을 촉진합니다. 50년(Aunan et al., 2017). 여기서 우리가 보여주는 연령 관련 DNA 손상 증가는 정상적인 결장 표본에서 yH2AX가 연령에 따라 선형적으로 증가한다는 보고와도 일치합니다(Risques et al., 2008). 노화 오르가노이드에서 관찰된 yH2AX의 현저한 상향 조절은 yH2AX가 DNA 복구 단백질을 끌어들이는 DNA 손상 부위를 표시하기 때문에 DNA 손상 축적을 나타냅니다(Turinetto and Giachino, 2015). 이러한 결과는 노화 세포에서 유도된 GH가 H2AX 인산화를 억제한다는 사실과 겉보기에는 일치하지 않을 수 있습니다. 그러나 우리는 이러한 관찰을 해석하여 GH가 ATM의 인산화를 감소시켜 DDR 활성을 감소시키고, 이는 차례로 H2AX를 포함한 다운스트림 단백질의 인산화를 감소(완전히 폐지하지는 않음)한다는 것을 보여줍니다. DDR이 적절하게 활성화되지 않으면 DNA 복구가 변경되지만 yH2AX는 복구되지 않은 DNA 손상 부위를 표시하므로 여전히 축적됩니다. 따라서 노화된 인간 조직 및 오르가노이드에서 관찰되는 yH2AX 수준은 DDR 활성의 순 결과와 복구되지 않은 DNA의 양을 반영합니다.

DNA 손상은 DNA 손상에 대한 p53 반응의 손실로 인해 염기 절단 복구 손실로 인해 노화된 조직에 축적될 수 있습니다(Cabelof et al., 2006; Simon et al., 2009, 2012). 우리의 실험에서 p53은 p53을 억제하는 GH의 초기 발견과 일치하는 결장 세포와 npGH를 발현하는 오르가노이드에서 감소했습니다(Chesnokova et al., 2016). 대조적으로, 암에 저항력이 있고 수명이 더 긴 노화된 GHR-/- 마우스(Basu et al., 2018)와 결장 특이적 GHRcolKO 마우스는 결장 p53의 증가된 발현을 나타내어 DNA 복구를 향상시킬 가능성이 있습니다. GH가 p53을 억제함에 따라(Chesnokova et al., 2013), npGH 유도는 연령 관련 감소된 p53과 일치하는 국소 미세 환경의 변화를 초래할 수 있습니다(Feng et al., 2007; Goukassian et al., 2000). GH 프로모터는 p53 결합 부위를 포함하고(Chesnokova et al., 2013), DNA 손상 유발 p53은 GH 발현을 활성화합니다(Chesnokova et al. 2013, 2019a). 따라서 우리의 결과는 노화된 오르가노이드에서 DNA 손상 축적이 npGH를 유도하여 p53을 하향 조절한다는 것을 보여줍니다.

중요한 것은 npGH가 DNA 손상 세포에서 국부적으로 분비되기 때문에 인접 세포에서 분비된 GH에 대한 측분비 작용이 작동할 수 있다는 것입니다. 결장 칩과 GH 발현 hNCF를 공동 배양하는 동안, 우리는 섬유아세포 유래 측분비 효과에 노출된 칩 내장 상피 세포에서 DNA 손상 및 증식이 증가하고 p53/p21이 하향 조절되는 것을 관찰했습니다. 이러한 결과는 인간 조직의 국소적 비유도 노화가 종양 억제 단백질을 억제하고 상피 증식 및 DNA 손상을 향상시켜 조직 미세 환경을 변경함을 시사합니다.

결과는 외인성 GH 치료가 DJ{0}} KO 마우스에서 증식 능력, 집락 형성 및 전이를 증가시킨다는 관찰과 일치하며(Chien et al., 2016), 인간 종양 세포에서 GH 유도가 다음과 관련이 있다는 증거와 일치합니다. 여러 암의 진행(Perry et al., 2017); 이러한 결과는 GH 억제로 더 적은 수의 콜로니 형성과 더 작은 콜로니 크기를 보여주는 우리의 결과와 일치합니다.

DNA 손상 복구 경로는 세포 변형을 유도하는 염색체 불안정성으로부터 보호합니다(Negrini et al. 2010). 예를 들어, Tip60은 ATM을 활성화하고(Jackson and Bartek, 2009), DDR의 중앙 조절자인 ATM은 p53을 인산화하고 안정화합니다. 노화 세포는 ATM 및 p53 억제가 감소할 뿐만 아니라 DNA 복구 조절 장애로 인해 복구되지 않은 DNA 손상이 뒤따릅니다(Lan et al., 2019). 따라서 결장 세포에서 DNA 손상은 나이가 들면서 축적되며(Risques et al., 2008; Schu-macher et al., 2008), 적어도 부분적으로는 DDR 효율 감소로 인해(Jackson and Bartek, 2009) 노화된 쥐에서 y-조사에 대한 반응은 ATM을 안정화하는 p{13}}의 연령 관련 감소에 기인합니다(Feng et al, 2007). 우리 실험에서 DNA 손상에 대한 반응으로 유도되지 않은 Tip60도 억제되어 약화된 ATM 및 p53 인산화에 의해 각각 입증된 바와 같이 DNA 복구 감소. 이러한 결과는 국소 npGHoverexpression이 연령 관련 조절 장애 DDR 및 DNA 복구에 기여할 수 있음을 시사합니다. 노화된 오르가노이드에서 GH 유도는 DDR을 약화시키는 반면, GH 억제는 DNA 손상 감소로 입증되는 DDR을 활성화했습니다. 이러한 결과는 ANCC에서 GH 신호 전달을 차단하면 DNA 손상이 감소한다는 초기 관찰에 의해 뒷받침됩니다(Chesnokova et al., 2019a). 또한, 우리는 결장 DNA 손상이 절제된 GHR이 있는 결장 표적 GHRcolKO 마우스에서 축적되지 않는다는 것을 보여주지만, GHR이 손상되지 않은 소장에는 축적되었습니다. 이러한 결과는 노화된 GHR{20}}마우스가 결장 DNA 손상을 축적하지 않는다는 우리의 증명과 함께, 다음과 같이 에이메이렌더 세포에 대한 국소 npGH 유도가 형질전환에 민감하고 아마도 암 치료 내성에도 기여한다는 가설을 생체 내에서 뒷받침합니다. 제안되었습니다(Basu and Kopchick, 2019).

여기에 표시된 결과는 또한 GH 효과가 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF1)에 의해 매개될 가능성을 높입니다. GH와 달리 IGF1 신호전달은 비종양 및 종양 세포에서 DNA 복구를 활성화하며(Chesnokova and Melmed, 2020; Chitnis et al.,2014; Turney et al.,2012), 우리는 p53의 GH 억제 및 DNA 유도가 손상 연령은 정상 결장 조직에서 IGF1과 독립적으로 발생합니다(Ches-nokova et al., 2019a, 2019b). 그러나 GH가 IGF1을 활성화하는 세포 및 조직에서 후자의 성장 인자는 게놈 안정성에 대한 GH 작용에 대응하기 위해 세포 특이적 방식으로 신호를 보낼 수도 있습니다.

이 발견은 축적된 DNA 손상에 대한 반응으로 노화된 결장 조직에서 유도된 npGH가 추가 DNA 손상을 촉진하고 DNA 손상 복구의 불리한 결정인자인 것으로 보입니다. 이러한 발견의 외삽은 몇 가지 잠재적인 임상 적용을 위한 플랫폼을 제공합니다. DNA 손상 축적은 연령 관련 질병의 특징이므로 자가분비/주변분비를 차단하기 위한 GH 신호전달을 표적으로 하는 효과는 연령 관련 상피 DNA 손상을 방해하고 궁극적으로 연령 관련 상피 병리의 진행을 개선하는 데 유용한 것으로 입증되지 않을 수 있습니다(Miman et al. ,2016) 이러한 접근 방식은 DNA 손상 요법을 받는 암 환자에게도 도움이 될 수 있습니다. 이 치료에서는 자가분비/주변분비에 의해 유발된 상피 필드 변화가 정상적인 이웃 조직을 손상시킬 수 없습니다. 이와 관련하여 승인된 GHR 길항제(List et al., 2011; Trainer et al, 2000)로 GH 신호 전달을 방해하면 임상적 이점을 얻을 수 있습니다. 중요하게도, 인간 GH는 승인되지 않은 노화 방지 및 근력 강화 요법으로 부적절하게 홍보되었습니다(Giordano et al., 2008; Holt and Ho, 2019; Medeiros 및 Siegel Watkins, 2018; Melmed, 2019). 우리가 여기에서 보고하는 npGH의 유해한 측분비 효과를 감안할 때 노화 방지 엘릭서로 장기간 부적절한 GH 투여는 GHR 신호를 유도하고 상피 세포 DNA 손상의 발병 위험뿐만 아니라 잠재적인 활성화 가능성이 있는 잠재 증식성 병변을 유발할 수 있습니다.

이 기사는 Cell Reports 37, 11{12}}068, 2021년 12월 14일, ª 2021 The Author(s)에서 발췌한 것입니다. 1 이것은 CC BY-NC-ND 라이선스(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)에 따른 오픈 액세스 기사입니다.