Long Non-Coding RNA KCNQ1OT1은 노화 및 칼로리 제한에서 MiR-760을 통해 단백질 키나제 CK2를 조절합니다.

키워드:KCNQ1OT1; 긴 비암호화 RNA; 노화;칼로리 제한; 단백질 키나제 CK2;미르-760

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1. 소개

Long non-coding RNA(lncRNA)는 단백질로 번역되지 않는 200개 이상의 뉴클레오티드 크기를 가진 전사체입니다. LncRNA는 세포의 전사 조절을 포함하여 다양한 기능을 담당합니다.시스또는트랜스, 핵 도메인의 구성 및 microRNA(miRNA)와의 상호 작용 [1–3]. 특히 lncRNA와 miRNA의 상호 작용 네트워크를 이해하면 유전자의 조절 메커니즘에 대한 새로운 관점을 얻을 수 있습니다. lncRNAKCNQ1OT1, 전체 이름은KCNQ1중복 전사체 1은 RNA 중합효소 II에 의해 안티센스 방향으로 전사되는 91kb 전사체입니다.KCNQ1[4,5]. KCNQ1OT1KCNQ1 유전자의 인트론 10에 존재합니다. 그만큼KCNQ1유전자좌는 인간 염색체 11(11p15.5)의 짧은 팔에 있습니다. G9a와 H3K27 histone methyltransferase PRC2(polycomb repressive complex 2) 모집을 통해,KCNQ1OT1염색질과 상호작용하여 복잡한 접힘 구조를 형성한 다음 여러 표적 유전자를 침묵시킵니다.6]. 추가적으로,KCNQ1OT1다양한 miRNA(예: miR-760, miR{{1} }a, miR-452-3p, miR-320a, miR-701-3p 및 miR-2054), 모두 표적 유전자의 발현을 조절합니다. [7–13]. 그럼에도 불구하고 생물학적 역할은KCNQ1OT1노쇠와 칼로리 제한(CR)은 불분명합니다.

세포 노화는 텔로미어 단축, 발암성 활성화 및 산화 스트레스와 같은 여러 세포 스트레스에 의해 자극되는 증식의 말기 정지입니다.14,15]. 이전 연구에서는 2개의 촉매( 및/또는 0 ) 소단위 및 2개의 규제 노화 조절제로서의 소단위. CK2억제는 노화 관련을 포함한 여러 노화 마커의 발현을 유발합니다. -갈락토시다아제(SA- -gal) 활동 [16], p53–p21Cip1/WAF1축 활성화 [17], 활성산소종(ROS) 생성 [18], 노화 관련 헤테로크로마틴 병소(SAHF) 형성 [19] 및 노화 관련 분비 표현형(SASP) 발현 [20]. miR-186, miR-216b, miR-337-3p 및 miR-760는 CK2를 억제하여 세포 노화를 촉진합니다. [21,22]. 영양실조 없이 총 칼로리 섭취를 만성적으로 줄이는 칼로리 제한(CR)은 세포 노화를 지연시키는 가장 성공적인 전략입니다.23]. 최근에 CK2가 CR에 의해 상향조절되고 자가포식을 유도한다는 것이 보고되었다.24]. 그러나 CR 매개 CK2 상향 조절의 기본 분자 메커니즘은 아직 명확하지 않습니다.

이 연구에서 잠재적인 역할은KCNQ1OT1노화와 CR이 평가되었습니다.KCNQ1OT1녹다운은 CK2를 하향 조절하여 노화 표현형을 촉진했습니다. 인간 암 MCF-7 및 HCT116 세포 및 폐 섬유아세포 IMR-90 세포에서. 이 연구는KCNQ1OT1CK2를 상향 조절 노화 및 CR 동안 miR-760과의 상호작용을 통한 발현, 제안KCNQ1OT1노화 관련 질병에 대한 새로운 치료 표적이 될 수 있습니다.

2. 결과

2.1. KCNQ1OT1 녹다운 유도 SA- 활성화 -gal 염색, p53-p21Cip1/WAF1경로 및 CK2를 통한 H3K9 트리메틸화 인간 암세포의 침묵

MCF-7 및 HCT116 세포는KCNQ1OT1관련성을 조사하기 위한 siRNAKCNQ1OT1노화에.KCNQ1OT1녹다운 상향 조절 SA- -gal 활동(그림1ㅏ). 또한, 면역블롯 결과는KCNQ1OT1 녹다운p53 및 p21의 수준을 상향 조절Cip1/WAF1, 및 SAHF의 특징(H3K9 트리메틸화(H3K9me3) 증가 및 H3K9 아세틸화(H3K9Ac) 감소)(그림1비). 이전에 CK2 하향조절이 이러한 노화 마커(SA- -gal 염색, p53-p21Cip1/WAF1경로 및 SAHF) [16,17,19]. 따라서 여부를 조사하였다.KCNQ1OT1CK2와 상호 작용합니다. 흥미롭게도 이소성 CK2 표현은 SA-의 유도를 폐지했습니다. -여자 활동, p53, p21Cip1/WAF1및 H3K9me3에 의해 매개됨KCNQ1OT1하향 조절(그림1A,B). 뿐만 아니라,KCNQ1OT1 녹다운CK2의 단백질 수준 감소 (수치1비). 이러한 결과는 종합적으로 다음을 제안합니다.KCNQ1OT1녹다운은 CK2를 하향 조절하여 세포 노화를 유도합니다.

2.2. CK2를 통한 KCNQ1OT1 녹다운 유도 SASP 인자 발현 및 ROS 생성 인간 암세포의 침묵

여부를 조사했다.KCNQ1OT1하향 조절은 노화 세포가 전염증 인자를 분비한다는 보고로 인해 SASP 인자의 발현을 증가시켰습니다.14,15]. KCNQ1OT1녹다운은 인터루킨(IL)-1을 포함한 SASP 인자의 발현을 유도했습니다. , IL-6 및 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP) 3(그림2A). KCNQ1OT1하향 조절은 산화 스트레스가 노화의 주요 원인이기 때문에 세포 내 ROS의 양을 증가시켰습니다.14,15]. 이를 위해 HCT116 및 MCF-7 세포를KCNQ1OT1siRNA 및 CM-H로 염색2DCFDA.KCNQ1OT1녹다운은 flflow cytometry 동안 FL 형광의 오른쪽 이동으로 표시된 바와 같이 ROS 생산을 증가시켰습니다(그림2비). 이전에 CK2 하향조절이 SASP 발현을 유도한다고 보고되었다[20] 및 ROS 생성 [18]. CK2의 이소성 발현 에 의해 매개되는 SASP 인자 발현 및 ROS 생성의 유도를 폐지했습니다.KCNQ1OT1하향 조절(그림2A,B). 종합적으로, 이러한 결과는 다음을 나타냅니다.KCNQ1OT1녹다운은 CK2를 하향 조절하여 ROS 생성 및 염증을 유도합니다.

그림 1. 인간 암세포에서 CK2x 침묵을 통한 SA--gal 염색, p53-p21CipI/WAF경로 및 H3K9 트리메틸화의 KCNQ10T1 녹다운 유도 활성화. HCT116 및 MCF{{10}} 세포를 pcDNA3.1.HA-CK2x의 부재 또는 존재 하에 2일 동안 KCNO10T1 siRNA로 형질감염시켰다. (A) 세포를 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴--D-갈락토사이드로 염색하고 대표 이미지를 20배 배율로 얻었다(위). 축척 막대=100 음. 세 가지 독립적인 실험의 대표 데이터가 표시됩니다. 그래프는 파란색으로 염색된 세포의 백분율을 나타냅니다(하단). (B) Immunoblotting은 특정 항체를 사용하여 각 단백질의 수준을 결정하는 데 사용되었습니다(위). 3-액틴은 대조군으로 사용되었습니다. 그래프는 B-액틴에 대한 각 단백질의 정량을 나타냅니다(하단). 데이터는 평균 SEM으로 보고됩니다.* p < 0.05; ** p < 0.01, ** p < 0.001.H3K9me3, 히스톤 H3 Lys9 트리메틸화; H3K9AC, H3 Lys9 아세틸화.

그림 2. 인간 암세포에서 CK2x 침묵을 통한 KCNQ10T1 녹다운 유도 노화 관련 분비 표현형(SASP) 인자 발현 및 활성산소종(ROS) 생성HCT116 및 MCF-7 세포에 KCNO1{ {20}}pcDNA3.1-HA-CK2a의 부재 또는 존재 하에 2일 동안 T1 siRNA. (A) 각 mRNA의 수준은 특정 프라이머(위)를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 결정되었습니다. 세 가지 독립적인 실험의 대표 데이터가 표시됩니다. 그래프는 6- 액틴(하단)에 대한 각 mRNA의 정량을 나타냅니다. (B) 세포를 10 UM CM-HDCEDA와 함께 배양했습니다. 형광 강도는 유세포 분석으로 측정했습니다(위). 세 가지 독립적인 실험의 대표 데이터가 표시됩니다. 그래프는 상대 형광 수준(하단)을 보여줍니다. 데이터는 평균 ± SEM으로 보고됩니다. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001.

2.3. KCNQ1OT1은 CK2 침묵을 통해 LPS(Lipopolysaccharide) 매개 SASP 인자 발현에 관여했습니다. 인간 암세포에서

LPS로 치료하면 CK2를 하향 조절하여 세포 노화를 일으키기 때문에 [20], LPS 하향 조절 여부를 테스트했습니다.KCNQ1OT1표현. LPS로 치료(6µg/µL) 전사 수준 감소CK2 그리고KCNQ1OT1인간 암세포에서 (그림3ㅏ). 또한,KCNQ1OT1LPS로 처리된 세포에서 SASP 인자 발현에 대해 조사하였다. 그러나 LPS(6µg/µL) SASP 계수 증가(IL-1 , IL-6 및 MMP3) 인간 암세포에서의 발현; pcDNA3로 추가 처리.1-KCNQ1OT1(36,181–37,140)은 SASP 인자의 LPS 매개 유도를 제거했습니다(그림3비). 이전에 miR-760, miR- 186, miR-337-3p 및 miR-216b의 공동 작용이 CK2를 침묵시킴으로써 조기 노화를 자극한 것으로 나타났습니다. HCT116 세포의 단백질 [21], 그 miR-760 및 miR-186은 복제 노화 IMR-90 세포에서 상향조절되었습니다[22]. LPD 처리에 의해 영향을 받는 이러한 miRNA의 발현 패턴이 결정되었습니다. 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(qPCR) 분석 결과 miR-760의 양이 LPS로 처리된 HCT116 및 MCF-7 세포 모두에서 200% 이상 증가한 것으로 나타났습니다(6µg/µL), 대조군 세포와 비교하여. miR-186은 LPS 처리에 의해 상향 조절되지 않았고, miR-337-3p와 miR-216b는 이들 세포에서 다르게 조절되었습니다(그림3씨). 따라서 이러한 결과는 종합적으로 LPS가 하향 조절을 통해 miR-760 양을 증가시켰음을 나타냅니다.KCNQ1OT1, 결과적으로 CK2 하향 조절 매개 노화.

그림 3. KCNO10T1은 인간 암세포에서 CK2x를 억제하여 지질다당류(LPS) 매개 노화 관련 분비 표현형(SASP) 인자 발현에 관여했습니다. (A) HCT116 및 MCF-7 세포를 LPS(6ug/uL)로 2일 동안 처리하였다. 각 mRNA의 수준은 특정 프라이머를 사용하여 RI-PCR에 의해 결정되었습니다(상단). 세 가지 독립적인 실험의 대표 데이터가 표시됩니다. B-액틴을 대조군으로 사용하였다. 그래프는 B-액틴(하단)에 대한 각 mRNA의 정량을 나타냅니다. (B) 세포를 pcDNA3의 부재 또는 존재 하에 LPS(6 ug/uL)로 처리하였다.1-KCNO10T1(36,181-37,140) 이틀 동안. 각 mRNA의 수준은 특정 프라이머를 사용하여 RI-PCR에 의해 결정되었습니다(왼쪽). 세 가지 독립적인 실험의 대표 데이터는 3-액틴이 대조군으로 사용되었음을 보여줍니다. 그래프는 액틴(오른쪽)에 대한 각 mRNA의 정량을 나타냅니다. (C) 세포를 2일 동안 LPS(6 ug/uL)로 처리하고 세포로부터 전체 RNA를 분리하고 PCR 분석을 수행하여 miR-760, miR-186, miR{{ 26}}p 및 miR-216b는 정규화를 위해 RNU48을 사용합니다. 데이터는 평균 ±SEM.*p<0.05로 표시됩니다. ** p < 0.01; *** p < 0.001.

2.4. KCNQ1OT1 상향 조정된 CK2 인간 암 세포에서 miR-760을 Sponging하여

다음으로 여부를 조사하였다.KCNQ1OT1CK2 조절 miR-760을 통한 표현. HCT116 및 MCF-7 세포는 pcDNA3.1-KCNQ1OT1(36,181–37,140) 또는 KCNQ1OT1 siRNA와 함께 miR-760 모방체 또는 억제제와 함께 형질감염되었습니다(서열은 보충 표 S1에 표시됨). 이소성 표현KCNQ1OT1(36,181–37,140)의 mRNA 수준 증가CK2 , 반면 miR-760 모방체를 사용한 추가 치료는 억제됨KCNQ1OT1-매개CK2 상향조절(그림4ㅏ). 대조적으로,KCNQ1OT1녹다운은 mRNA 수준을 감소시켰습니다.CK2 , 반면 miR-760 억제제를 사용한 추가 치료는 억제됨KCNQ1OT1최저 매개CK2 하향 조절(그림4비). miR-760 모방체와 억제제 모두 양을 변경할 수 없었습니다.KCNQ1OT1, miR-760이 다음의 업스트림 조절기가 아님을 나타냅니다.KCNQ1OT1. 전체적으로 이러한 결과는 다음을 나타냅니다.KCNQ1OT1양을 증가시킨다CK2 miR-760 스폰지에 의한 mRNA. 보충 그림 S1은KCNQ1OT1, miR-760 및CK2 TargetScan 및 Miranda를 사용하여 결정된 mRNA.

그림 4. KCNQ10T1은 인간 암세포에서 miR-760을 스펀지하여 CK2x를 상향 조절했습니다. (A) HCT116 및 MCF-7 세포를 pcDNA3.1-KCNO10T1(36,181-37,140)로 2일 동안 형질감염시켰다. miR-760의 부재 또는 존재. (B) HCT116 및 MCF-7 세포를 miR-760 억제제의 부재 또는 존재하에 2일 동안 KCNO10T1 siRNA로 형질감염시켰다. 각 mRNA의 수준은 특정 프라이머(위)를 사용하여 RT-PCR에 의해 결정되었습니다. 세 가지 독립적인 실험의 대표 데이터가 표시됩니다. 그래프는 B-액틴(하단)에 대한 각 mRNA의 정량을 나타냅니다. 데이터는 평균 ± SEM으로 보고됩니다.* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001.

2.5. 인간 암 세포에서 KCNQ1OT1 상향 조절을 통한 miR-760 하향 조절에 의한 CR 조건 상향 조절된 CK2x

CR 조건에서 KCNQ1OT1 발현이 상향 조절되는 것으로 추정되는데 이는 CK2x mRNA의 수준이 CR 조건에서 상향 조절되었기 때문입니다[24]. 이 가설을 테스트하기 위해 HCT116 및 MCF-7 세포를 CR 조건에서 배양했습니다. 도 5A에 나타낸 바와 같이, 이들 세포에서 KCNO10T1 및 CK2x의 발현이 CR에 의해 유도되었으며, KCNQ10T1 siRNA를 추가로 처리하면 CR 매개 CK2a유도가 억제되어 KCNQ10T1이 CR 조건에서 CK2x의 양성 조절자임을 나타낸다. 또한 실시간 qPCR로 분석한 결과 CR 조건에서 miR-760 수준이 70% 감소한 반면 miR-186, miR-216b 및 miR{{22 }}CR 조건의 p는 변경되지 않았거나 증가했습니다(그림 5B). 다음으로, CR 매개 CK2x 상향 조절에 대한 miR-760의 효과를 조사했습니다. miR-760로 치료하면 miR-760가 CK2ain CR 조건의 주요 음성 조절자임을 나타내는 CR 매개 CK2x 상향 조절이 억제됩니다(그림 5C). 마지막으로, 실시간 gPCR 분석 결과 KCNO10T1 siRNA로 처리하면 miR-760 수준이 증가하는 반면 CR은 KCNO10T1 녹다운 매개 miR-760 유도를 억제하는 것으로 나타났습니다(그림 5D). 전체적으로, 이러한 결과는 CR이 KCNQ10T1을 상향 조절하여 miR-760을 하향 조절하여 인간 암세포에서 CK2x 상향 조절을 초래함을 나타냅니다. lncRNA SNHG6가CRC 세포에서 miR-760 스폰지 [25], CR이 상향 조절되는지 여부를 테스트했습니다.SNHG6 표현. 하지만,SNHG6CR 조건에서 표현이 변경되지 않음(데이터는 표시되지 않음)

그림 5. 인간 암세포에서 KCNO10T1 상향 조절을 통한 miR-760 하향 조절에 의해 CK2x가 상향 조절된 칼로리 제한(CR) 조건. (A,C 및 D) HCT116 및 MCF-7 세포를 KCNO1{{20}}T1 siRNA(A 및 D) 또는 miR-760(C)로 1.5일 동안 형질감염시켰다. 그런 다음 CR 조건에서 7시간 동안 배양합니다. (B) HCT116 및 MCF-7 세포를 CR 조건 하에서 7시간 동안 인큐베이션하였다. (A,C) 각 mRNA의 수준은 특정 프라이머를 사용하여 RT-PCR에 의해 결정되었습니다. 3-액틴은 B-액틴(하단)에 대한 각 RNA의 정량화를 나타내는 제어 그래프로 사용되었습니다. (B,D) 총 RNA를 세포에서 분리하고 정규화를 위해 RNU48을 사용하여 qPCR로 분석하여 표시된 miRNA의 상대적 수준을 결정했습니다. 데이터는 평균 + SEM으로 표시됩니다. * y < 0.05.*p < 0.01;** * p < 0.001.

2.6. KCNQ1OT1은 CR 조건이 구조한 인간 폐 섬유아세포에서 복제 노화 동안 하향 조절되었습니다

CK2x는 복제 노화 세포와 노화된 조직에서 하향 조절되기 때문에[16]KCNO1OT1이 인간 폐 섬유아세포 IMR-90 세포에서 노화 동안 하향 조절되는지 여부를 조사했습니다. KCNO10T1 녹다운은 CK2xin IMR-90 세포의 mRNA 수준을 감소시켰습니다(그림 6A). 반대로, KCNO1OT1 녹다운은 IMR-90 세포에서 SA-P-gal 활성을 상향 조절했고, CK2a의 이소성 발현은 KCNO1OT1 하향 조절에 의해 매개되는 SA-3-gal 활성의 유도를 제거했습니다(그림 6B). 복제 노화에 의해 KCNQ10T1 발현이 어떻게 감소하는지 확인하기 위해 IMR-90 세포를 노화와 유사한 상태가 관찰될 때까지 반복적으로 통과시켰다. PDL 47의 대부분의 세포는 SA-B-gal에 대해 양성으로 염색된 반면, 초기 계대(PDL 34) 세포 중에서는 SA-B-gal에 대해 양성으로 염색된 소수만이 있었습니다(데이터는 표시되지 않음). KCNO10T1의 전사 수준은 초기 계대(PDL 34) 세포에 비해 복제 노화 세포(PDL 47)에서 60% 감소하여 KCNO10T1이 복제 노화 동안 하향 조절되었음을 나타냅니다. 마지막으로, CR 조건은 정상 칼로리 조건에 비해 초기 계대(PDL 34) 세포에서 KCNO1OT1을 150% 증가시켰습니다. 그러나 CR 조건은 정상적인 칼로리 조건에 비해 복제 노화 세포(PDL 47)에서 KCNO10T1을 더 강력하게(250%) 증가시켰습니다. 이는 CR이 복제 노화에 의해 매개되는 KCNO10T1 및 CK2x의 감소된 발현을 구제할 수 있음을 나타냅니다(그림 6C). 종합적으로, 이 데이터는 복제 노화가 KCNQ10T1의 하향 조절을 통해 CK2x 발현을 감소시키고 CR이 KCNO1OT1-CK2 축을 통해 복제 노화를 억제할 수 있음을 나타냅니다.

그림 6. KCNQ1011은 열량 제한(CR) 조건에 의해 구조될 수 있는 인간 폐 섬유아세포 세포에서 복제 노화 동안 하향조절되었습니다. (A) IMR-90 세포(PDI36)를 KCNO10T1 siRNA로 형질감염시켰다. 각 mRNA의 수준은 특정 프라이머(위)를 사용하여 RT-PCR에 의해 결정되었습니다. 세 가지 독립적인 실험의 대표 데이터가 표시됩니다.3-액틴이 대조군으로 사용되었습니다. 그래프는 6-액틴(하단)에 대한 각 mRNA의 정량을 나타냅니다. (B) IMR-90 세포(PDL 36)를 pcDNA3.1-HA-CK2a의 부재 또는 존재하에 2일 동안 KCNO10T1 siRNA로 형질감염시켰다. 세포를 5-브로모-4-클로로3-인돌릴--D-갈락토사이드로 염색하고 대표 이미지를 20배 확대(왼쪽)축척 막대=100 음 . 세 가지 독립적인 실험의 대표 데이터가 표시됩니다. 그래프는 파란색으로 염색된 세포의 백분율을 나타냅니다(오른쪽). (C) PDL 34 및 PDL 47의 IMR-90 세포를 CR 조건 하에서 7시간 동안 인큐베이션하였다. 각 mRNA의 수준은 특정 프라이머를 사용하여 RT-PCR에 의해 결정되었습니다(왼쪽). 세 가지 독립적인 실험의 대표 데이터가 표시됩니다3-액틴이 대조군으로 사용되었습니다. 그래프는 6-액틴(오른쪽)에 대한 각 mRNA의 정량을 나타냅니다. 데이터는 평균 土 SEM으로 보고됩니다.* p < 0.05, ** p < 0.01; *** p < 0.001. (D) 노화 및 CR에 대한 KCNO10T1의 역할을 설명하는 가능한 모델. PDL, 인구 배가 수준