종방향 면역 프로파일링을 통해 코로나-19 회복기 환자의 장기 체액 면역을 매개하는 주요 에피토프가 밝혀졌습니다.
Sep 12, 2023
배경: 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)는 현재까지 520만명의 사망자를 낸 전 세계적 대유행을 일으킨 고병원성 및 전염성 코로나바이러스입니다. 장기 면역의 혈청학적 특징, 특히 SARS-CoV-2 감염 후 지속적인 항체 반응을 중재하는 우성 에피토프에 관한 질문은 아직 밝혀지지 않았습니다.
목적: 우리는 코로나바이러스 질환 2019(COVID-19) 환자의 면역 반응 동역학과 수명뿐만 아니라 SARS-CoV-2에 대한 장기간 체액 면역을 유지하는 에피토프를 분석하는 것을 목표로 했습니다.
행동 양식: 주로 중등도의 코로나-19 증상을 경험한 31명의 개인을 대상으로 질병 발병 후 최대 180~220일까지 SARS-CoV-2 면역 역학을 평가한 후, 코로나19를 담당하는 우성 에피토프에 대한 단백질체 전체 프로파일링을 수행했습니다. 지속적인 체액성 면역 반응.
결과: 종단적 분석 결과, SARS-CoV-2 감염 후 초기 단계에서 사이토카인 생산이 활성화되는 것과 함께 코로나-19 환자에서 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 특이적 항체와 중화 항체가 지속되는 것으로 나타났습니다. 장기간 항체 반응을 중재할 수 있는 반응성이 높은 에피토프는 스파이크 및 ORF1ab 단백질에 위치하는 것으로 나타났습니다. SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 주요 에피토프는 S1 하위 단위와 S2 하위 단위의 N 말단 도메인에 매핑되었으며, 풍토성 인간 코로나바이러스 사이의 서열 상동성은 다양하고 초기 SARS-CoV 사이의 높은 서열 동일성은 다음과 같습니다. CoV-2(Wuhan-Hu- 1) 및 현재 유통되는 변종.
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결론: SARS-CoV-2 감염은 스파이크에 위치한 우성 에피토프와 장기 면역 반응을 중재하는 ORF1ab 단백질을 표적으로 삼아 코로나19 회복기 환자의 지속적인 체액성 면역을 유도합니다. 우리의 연구 결과는 합리적인 백신 설계 및 진단 개발을 돕는 길을 제공합니다. (J Allergy Clin Immunol 2022;149:1225-41.)
키워드:
SARS-CoV-2, 코로나-19, 장기 면역 반응, 체액성 면역, 단백질체 전체 펩타이드 마이크로어레이, 우성 에피토프
현재 진행 중인 2019년 코로나바이러스감염증(COVID{4}}) 범유행의 원인 병원체인 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV- 2)는 베타코로나바이러스 속에 속하며, 여기에는 고병원성으로 알려진 다른 2가지 인간이 포함됩니다. 코로나바이러스: 중증급성호흡기증후군(SARS) 및 중동호흡기증후군(MERS) 코로나바이러스.1 2019년 12월 말에 처음으로 기록된 사례가 발생한 이후 SARS-CoV-2 감염으로 인해 2억 6천 3백만 건 이상의 감염이 발생했습니다. 2021년 11월 현재 전 세계적으로 520만 명의 확진자와 520만 명의 사망자가 발생했으며, 이는 5개 대륙에 걸쳐 220개 국가와 지역에 영향을 미칩니다.2 감염 후 임상 증상은 무증상 감염, 경증 또는 중등도 증상, 심지어 생명을 위협하는 중증 폐렴까지 광범위하게 나타납니다.3 다양한 유형의 백신 접근법이 가능해짐에도 불구하고 많은 국가에서는 여전히 새로운 감염 물결을 억제하기 위해 고군분투하고 있으며, 항바이러스 면역 반응에 대한 전염성과 저항성이 증가한 것으로 보이는 바이러스 변종이 등장하고 있습니다. 중화 항체에 의해 매개되는 효과적인 체액성 면역 반응은 감염을 차단하고 바이러스 병원체를 제거하는 강력하고 필수적인 적응 면역을 보유해야 합니다. SARS-CoV-2 감염 후, 질병 발병 후 7~14일에 감염된 개인 사이에서 높은 비율(90% 이상)의 강력한 혈청전환이 관찰되었습니다.4-6 항원 특이적 IgA, IgG, SARS-CoV-2의 스파이크 단백질(S)과 뉴클레오캡시드 단백질(N)을 인식하는 IgM은 질병의 급성기와 회복기 초기 단계에서 검출 가능했습니다.4,5,7 중화 항체의 크기는 연령, 증상이 있는 감염, 질병의 심각도와 관련이 있습니다. 노인 환자와 심각한 코로나{30}} 증상을 보이는 개인은 더 높은 수준의 중화 항체가 발생하는 경향이 있습니다.4,8-10 항체 반응의 수명에 관한 여러 연구에 따르면 바이러스에 대한 혈청/혈장 반응성이 상실됨에도 불구하고 일부 증상이 있는 코로나-19 사례에서 시간이 지남에 따라 항원을 제거하고 중화 항체 역가가 감소하는 반면, 코로나-19 회복기 개인의 경우 감염 후 최대 8~12개월 동안 전반적인 장기 체액성 면역 수준이 유지되는 것이 관찰되었습니다. .10-13 또한 SARS-CoV-2 항원 특이적 기억 B 세포의 수는 발현하는 B 세포 클론의 지속적인 선택 및 축적과 함께 최소 6~12개월 동안 안정적으로 유지되었습니다. 중화 항체12,14는 SARSCoV-2 감염 후 지속적인 체액성 면역 유지를 나타냅니다.
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중화 항체는 바이러스 감염에 대한 숙주 방어에 근본적인 역할을 합니다. 매우 강력한 SARS-CoV-2 단클론 항체 패널이 확인되었으며, 이는 주로 비리온 표면에서 삼량체로 조립되어 바이러스 진입을 촉진하는 S 단백질의 수용체 결합 도메인에 위치한 에피토프를 표적으로 합니다. 및 안지오텐신 전환 효소 2 수용체 결합 시 융합이 있습니다. S1 하위 단위와 S2 하위 단위의 N 말단 도메인(NTD)을 포함한 S 단백질의 다른 영역에도 중화 항체를 유도할 수 있는 면역원성 에피토프가 포함되어 있습니다. ,19,20 중화 외에도 SARS-CoV-2의 항체는 자연살해세포에 의해 유발되는 항체 의존성 식세포작용과 단핵구 또는 대식세포에 의한 항체 의존성 세포독성과 같은 Fc 매개 이펙터 기능을 통해 생체 내에서 보호를 제공할 수 있습니다. 21,22 바이러스 감염과 싸우는 것 외에도, 자연 감염이나 백신 접종에 의해 생성된 항체는 염증 활성화 증가 또는 항원/항체 면역 복합체 형성을 통한 바이러스 감염성 강화 또는 Fc 의존 기능을 통해 바이러스 발병을 촉진할 수 있습니다.23-25 하지만 생체 내 SARS-CoV-2 와 관련하여 강화된 바이러스 감염은 관찰되지 않았습니다. 항체 반응의 이러한 다양한 역할은 SARSCoV-2 에피토프의 체계적인 특성 규명뿐만 아니라 중화 또는 비중화 에피토프를 표적으로 하는 오래 지속되는 항체의 특성을 필요로 합니다. SARS-CoV-2 감염 후 항체 반응의 동역학과 지속 기간에 대한 최근의 진전에도 불구하고, 장기간 체액성 면역 반응을 유지하는 주요 에피토프에 관한 종단적 분석은 여전히 제한적입니다. 이전 연구에서는 주로 ELISA 기반 분석법,26,27 파지 또는 박테리아 디스플레이 기반 접근법28-31 및 마이크로어레이 기반 기술을 사용하여 코로나19에 감염된 개인의 항체 반응 에피토프를 프로파일링했습니다.30,{{ 38}} SARS-CoV-2 S 단백질의 여러 면역우세 에피토프가 확인되었습니다. 가장 자주 감지되는 영역은 S2 하위 단위의 융합 펩타이드(FP)에 가깝거나 이에 걸쳐 매핑되었으며, 두 번째 헵타드 반복은 S2 하위 단위 내 및 S1 하위 단위의 C 말단 도메인에 있습니다.26,28-30, 32,33 또한, 혈청학적 스크리닝에서는 N 단백질, 막(M) 단백질, ORF1ab, ORF3a 및 ORF7a를 포함하여 SARS-CoV-2 프로테옴 전체의 다른 단백질에 위치한 에피토프도 밝혀졌습니다.28-30, 34,35 이전 연구에서 항원 에피토프에 대한 중요한 통찰력을 제공했지만, 이러한 연구는 주로 초기 회복기 단계의 코로나19 환자의 에피토프 프로파일링에 중점을 두었습니다. 내구성 있는 SARS-CoV-2 특이적 항체 반응을 매개하는 정확한 에피토프와 에피토프 인식 역학은 아직 밝혀지지 않았습니다. 여기에서는 코로나-19 환자의 체액성 면역 반응, 특히 SARS-CoV-2에 대한 지속적인 장기 면역을 담당하는 에피토프의 동역학과 수명에 대한 더 깊은 이해를 얻기 위해 포괄적인 종단 분석을 수행했습니다. 증상 발생 후 최대 180~220일까지 31명의 코로나19{65}} 환자를 대상으로 면역 프로파일링을 실시했습니다. 항원 결합 및 중화 항체와 혈청 사이토카인 수준의 평가를 바탕으로 우리는 펩타이드를 사용하여 지속적인 체액성 면역 반응을 매개하는 SARSCoV-2의 ORF1ab, S 및 N 단백질에 위치한 에피토프 패널을 추가로 확인했습니다. SARS-CoV-2의 완전한 프로테옴을 포함하는 마이크로어레이. 우리의 결과는 바이러스 감염을 극복하기 위한 장기 면역의 특징을 밝히고 합리적인 백신 설계 및 개선된 혈청학적 진단 도구 개발에 도움이 될 것입니다.
행동 양식
연구 참가자 및 샘플 수집
SARS-CoV-2 관련 면역 반응의 동역학을 종단적으로 평가하기 위해 난퉁 대학교 부속 난퉁 제3병원에 입원한 SARS-CoV-2 감염자 31명으로부터 101개의 혈청 샘플을 수집했습니다. , 중국) 2020년 1월부터 3월 사이. 모든 환자는 역전사 정량 PCR 테스트를 통해 SARS-CoV-2 감염이 확인된 것으로 진단되었습니다. 질병 중증도는 중화인민공화국 국가위생건강위원회가 발표한 소설 코로나바이러스 폐렴 진단 및 치료 프로토콜 버전 7에 따라 경증~중등도(비심각) 또는 중증 코로나19-19로 정의되었습니다.36 환자를 추적관찰했습니다. 급성 감염에서 회복된 후 4~8개월 동안 세로로 증가합니다. 혈액 샘플은 31명의 연구 참가자 중 20명의 환자를 대상으로 증상 발생 후 4일부터 219일까지 종단적으로 수집되었으며(개인당 평균 4.5개 샘플, 범위: 2~8), 단일 시점 샘플링은 각 환자에 대해 수행되었습니다. 기타 질병 회복기 말기(질병 발병 후 122~214일)에 있었던 11명. 따라서 연령 및 성별이 일치하는 건강한 기증자의 혈청(n{27}})도 대조군으로 포함되었습니다. 연구 참가자 중 SARS나 MERS에 감염된 기록이 있는 사람은 없었습니다.
이 연구는 난통대학교 산하 난퉁 제3병원 윤리위원회의 승인을 받았습니다(승인 EL2020006). 각 연구 참가자로부터 서면 동의서를 얻었습니다. 원심분리를 통해 혈청 겔 튜브에서 말초혈액으로부터 혈청을 분리하고 분취량으로 만든 후 사용하기 전에 280℃에 보관했습니다.
세포주
HEK293T 및 Huh7 세포를 10% 열 불활성화 소 태아 혈청(Gibco), 100 U/mL 페니실린(Gibco) 및 100 mg/L 페니실린(Gibco)이 보충된 Dulbecco 변형 Eagle 배지(Gibco; Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass)에서 배양했습니다. mL 스트렙토마이신(Gibco), 37℃, 5% CO2.
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ELISA를 통한 IgG 항체 검출
인간 혈청 샘플의 항원 결합 IgG 항체의 수준은 ELISA에 의해 결정되었습니다. 96웰 ELISA 플레이트(Corning, Corning, NY)를 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질(Sino Biological, 중국 베이징, 카탈로그 번호 40588-V08B)로 사전 코팅했습니다. , 웰당 50 ng) 또는 스파이크 단백질(Sino Biological, 40589-V08B1, 웰당 100ng), SARS-CoV 스파이크 단백질(Sino Biological, 40634-V08B, 100ng/웰) 웰) 또는 MERS-CoV 스파이크 단백질(Sino Biological, 40069-V08B, 웰당 50ng)을 48C에서 하룻밤 동안 투여합니다. 0.05% Tween 20(PBS-T)이 포함된 인산완충식염수(PBS)에 5% 무지방 우유로 37°C에서 2시간 동안 차단한 후, 시작 희석액 1에서 연속 희석된 열 불활성화 혈청 샘플을 3-접습니다. :200을 사전 코팅된 플레이트에 37℃에서 2시간 동안 첨가했습니다. 웰을 PBS-T를 사용하여 각 단계 사이에 3회 세척했습니다. 반응은 37℃에서 1시간 동안 고추냉이 퍼옥시다제 결합 항인간 IgG 항체(Abcam, Cambridge, United Kingdom, 1:100,000 희석)와 함께 배양한 후 테트라메틸벤지딘 기질(Life Technologies, Carlsbad)을 추가하여 시각화했습니다. , 캘리포니아). 2 mol H2SO4를 사용하여 현상 반응을 중단하고 보정 파장을 630 nm(OD{48}} OD630)로 설정하여 450 nm에서 흡광도를 측정했습니다. 결합 항체의 종말점 역가를 계산하기 위해, 곡선의 선형 부분(y 5 kx 1 b) 내에서 혈청 희석의 log10 대 보정된 광학 밀도(OD) 값(OD{51}} OD630)을 플로팅하여 데이터를 선형화했습니다. , r2 > 0.99), 조정된 OD 값(OD{58}} OD630) 5 0이 계산된 혈청 희석을 계산하여 종말점 역가를 제공합니다. 펩타이드 면역화된 마우스의 항원 특이적 IgG 항체를 펩타이드 기반 ELISA로 평가했습니다. 간략하게 말하면, 96-웰 ELISA 플레이트(Thermo Fisher Scientific)를 탄산염 완충액(pH 9.6) 내 웰당 4개의 혼합 펩티드(펩티드 318, 356, 510 및 530) 1mg으로 48℃에서 밤새 코팅했습니다. 5% 무지방 우유를 함유한 PBS-T로 차단한 후, 웰을 1:40으로 희석된 혈청 샘플과 함께 37℃에서 1시간 동안 배양했습니다. 이어서, 플레이트를 세척하고 양고추냉이 퍼옥시다제 결합 항-마우스 IgG 항체(Abcam)와 함께 배양했습니다. 반응은 테트라메틸벤지딘 기질(Life Technologies)을 사용하여 시각화하였고, 2 mol H2SO4로 반응을 중지한 후 450 nm에서의 흡광도를 측정했습니다.
슈도바이러스 생산 및 적정
C-말단 19 aa 결실이 있는 SARS-CoV-2(NC_045512) 또는 SARS-CoV(AY291315.1) 스파이크 단백질을 코딩하는 코돈 최적화 유전자 또는 MERS-CoV(JX{10 }}) C-말단 16 aa로 잘린 스파이크 단백질을 각각 pcDNA3.1(1) 벡터에 클로닝했습니다. 100mm 조직 배양 접시에서 배양된 HEK 293T 세포를 폴리에틸렌이민(Polysciences)을 사용하여 스파이크 단백질을 코딩하는 플라스미드 1mg과 env가 결핍된 루시퍼라제 발현 백본(pNL{22}}.luc.RE) 15mg으로 동시 형질감염시켰습니다. , 펜실베니아주 워링턴). 슈도바이러스 함유 세포 배양 상청액을 형질감염 48시간 후 수집하고 여과한 후 분취량으로 280℃에서 보관했습니다. 바이러스 역가(50% 조직 배양 감염 용량)를 결정하기 위해 슈도바이러스의 연속 희석액을 96-웰 플레이트에 미리 파종된 1 3 104 Huh7 세포에 첨가했습니다. 감염 12시간 후, 바이러스 함유 배지를 새로운 성장 배지로 교체하고, 세포를 추가로 48시간 동안 배양하였다. 세포 용해의 루시퍼라제 활성은 마이크로플레이트 리더(BioTek Instruments, Winooski, Vt)를 사용하여 Steady-Glo Luciferase Assay System(Promega, Madison, Wisc)으로 측정하였고, 평균 배경 값의 10배보다 높은 상대 발광 단위를 생성하는 웰을 고려했습니다. 긍정적인.
슈도비rus 중화 분석
코로나-19 환자 또는 건강한 기증자의 열 불활성화 혈청 샘플을 2-배 연속 희석하고 37°C에서 1시간 동안 50% 조직 배양 감염 용량의 200 슈도바이러스와 함께 배양했습니다. 그 다음, 혼합물을 96- 웰 플레이트에 미리 파종한 Huh7 세포를 감염시키기 위해 이중으로 적용했습니다. 감염 후 12시간에 웰에 새로운 성장 배지를 보충하고, 세포의 루시퍼라제 활성을 48시간 후에 측정했습니다. SARS-CoV-2 및 SARS-CoV 슈도바이러스에 대한 50% 중화 역가(NT50)는 GraphPad Prism 8.0 소프트웨어(GraphPad Software, La Jolla, CA)를 사용하여 비선형 회귀로 계산되었습니다. MERS-CoV 슈도바이러스의 NT50은 혈청 샘플을 적용하지 않은 바이러스 대조군에 비해 상대 발광 단위가 50% 감소한 최고 혈청 희석으로 정의되었습니다.
단백질 마이크로어레이 기반 사이토카인 검출
다양한 사이토카인(IL-1a, IL-1b, IL- 4, IL-6, IL-8, IL-10)의 정량 측정 , IL-13, MCP-1, IFN-g 및 TNF-a)를 다중 ELISA 어레이(RayBiotech, Peachtree Corners, Ga)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 간단히 말하면, 사이토카인 특이적 항체로 사전 코팅된 유리 슬라이드를 실온에서 30분 동안 샘플 희석제로 차단한 후, 60 mL의 2-배 희석된 혈청 샘플 또는 사이토카인 표준 희석액을 첨가했습니다. 48℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 슬라이드를 5회 세척하고 80mL의 비오티닐화 검출 항체 칵테일에 이어 Cy3 등가 염료-접합 스트렙타비딘으로 실온에서 1시간 동안 염색했습니다. 형광 강도는 InnoScan 300 마이크로어레이 스캐너(Innopsys, Chicago, Ill)를 사용하여 532 nm에서 검출하였고, 데이터는 Q-Analyzer 소프트웨어(RayBiotech)를 사용하여 분석했습니다.
펩타이드 합성 및 소 혈청 알부민과의 접합
SARS-CoV-2 프로테옴을 덮는 총 515개의 펩타이드(길이 15개 aa, 11개 aa 중첩)는 SARS-CoV의 아미노산 서열을 기반으로 GL Biochem(중국 상하이)에서 합성되었습니다. -2 계통의 우한후(Wuhan-Hu)-1. 제조업체의 지침에 따라 가교제 Sulfo-SMCC(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 펩티드를 소 혈청 알부민(BSA)과 접합시켰습니다. 간략하게, Sulfo-SMCC를 BSA에 대해 30-배 몰 과량으로 첨가한 후 PBS에 투석했습니다. 이어서, 시스테인이 포함된 펩타이드를 1:1(wt/wt) 비율로 첨가하고 2시간 동안 배양한 후 PBS로 추가로 투석하여 유리 펩타이드를 제거하였다.
펩타이드 마이크로어레이 제작
펩타이드 마이크로어레이, SARS-CoV-2의 펩타이드, 음성 대조군(BSA) 및 양성 대조군(항인간 IgG 및 항인간 IgM 항체, Sigma-Aldrich, St Louis, MO)을 준비합니다. , Super Marathon 프린터(Arrayjet, Edinburgh, Scotland, United Kingdom)를 사용하여 PATH 기판 슬라이드(Grace Bio-Labs, Bend, Ore)에 3중으로 고정되었습니다. 그런 다음 추가 사용을 위해 펩타이드 마이크로어레이를 280°C에서 보존했습니다.
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마이크로어레이 기반 에피토프 매핑
Microarray 기반 혈청 분석은 Li et al,37과 같이 약간의 수정을 거쳐 수행되었습니다. 동일한 하위 배열에 대한 개별 챔버를 만들기 위해 14- 챔버 고무 개스킷을 각 펩타이드 마이크로어레이 슬라이드에 장착했습니다. 슬라이드 어레이를 사용하기 전에 실온으로 가온한 후 PBS-T 중 3% BSA로 3시간 동안 차단했습니다. 코로나-19 환자의 혈청 샘플 또는 20 건강한 기증자(대조군)의 혈청 샘플을 대부분의 샘플에 대해 PBS-T에 1:200으로 희석한 다음 각 하위 배열과 함께 2시간 동안 배양했습니다. 48C. 어레이를 PBS-T로 세척하고 Cy3-결합 염소 항인간 IgG 및 Alexa Fluor 647 결합 당나귀 항인간 IgM(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)과 1:1000 희석으로 배양했습니다. 실온에서 각각 1시간 동안. 인큐베이션 후, 어레이를 PBS-T로 세척한 후 실온에서 원심분리에 의해 완전히 건조시켰다. 이어서, LuxScan 10K-A 마이크로어레이 스캐너(CapitalBio, Beijing, China)를 사용하여 어레이를 스캔하고, FL 형광 강도 데이터를 GenePix Pro 6.0 소프트웨어(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)로 얻고 분석했습니다.
그림 1. 코로나-19 환자의 항체 반응의 종방향 역학. 연구 설계의 개략도. 총 31명의 SARS-CoV-2 감염자와 20명의 건강한 기증자가 연구에 등록되었습니다. 혈청 샘플 수집은 SARS-CoV-2에 감염된 31명 중 20명의 환자에 대해 여러 시점에서 종단적으로 수행되었으며, 다른 11명의 환자에 대해서는 단일 시점에서 샘플링이 수행되었습니다. 다양한 분석에 사용된 참가자 수와 혈청 샘플이 나열되어 있습니다. B 및 C, 31명의 코로나19-19 환자로부터 채취한 총 101개의 혈청 샘플을 서로 다른 시점에서 SARS-CoV-2 N 단백질(B) 및 S 단백질(C) 결합 IgG 항체에 대해 ELISA로 테스트했습니다. 증상 발생 후(일 1-30, n 5 37; 일 31-61, n 5 18; 일 100-150, n 5 21; 일 {{21 }}, n 5 25). 20명의 건강한 기증자의 혈청 샘플이 대조군으로 포함되었습니다. D, 시간 경과에 따른 SARS-CoV-2 슈도바이러스에 대한 NT50은 비선형 회귀 분석을 통해 계산되었습니다. E, 질병 발병 후 지정된 시점에 코로나19 환자의 혈청 중화 활성 분포가 제시됩니다. NT50 역가가 20 미만인 샘플은 중화되지 않는 것으로 정의되었습니다.
펩타이드 마이크로어레이 데이터 분석
IgG 및 IgM 데이터를 각각 분석했습니다. 각 지점의 신호 강도는 전경에서 배경을 뺀 값으로 정의되었으며 각 펩타이드에 대한 삼중 지점의 평균을 구했습니다. 코로나-19 샘플의 양성 펩타이드 반응에 대한 컷오프 값은 건강한 기증자 대조군 신호 강도의 두 배로 설정되었습니다. 3개의 샘플링 시점(질병 발병 후 10-60, 100-150 및 180-220일) 모두에서 테스트된 샘플 중 양성률이 80% 이상인 펩타이드를 우성 및 지속성 펩타이드로 정의했습니다. 모든 시점에서 60% 이상의 긍정적인 반응 빈도는 3-하위적이고 지속적인 것으로 간주되었습니다. 3개의 샘플링 시점 그룹에서 각 펩타이드의 평균 신호 강도를 계산했습니다. 높은 신호 강도(모든 테스트 샘플의 신호 강도 평균 1SD 이상)를 나타내는 펩타이드도 선택되었습니다. 데이터 처리 및 분석은 R v3.6.3 소프트웨어(https://www.r-project.org/)에 의해 수행되었으며 다양한 샘플링 시점 그룹 간의 중요한 신호 강도 변화는 Limma를 기반으로 평가되었습니다. P < .05의 차이는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.
마우스 예방접종
6~8주령의 암컷 BALB/c 마우스는 Beijing Vitalstar Biotechnology(Beijing, China)에서 구입했습니다. 모든 생쥐는 특정 병원균이 없는 시설에 보관되었으며, 동물 연구는 천진 의과대학(중국 천진) 동물 기관 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 면역화를 위해, 마우스 그룹(n 5 5)에 50mg 명반(InvivoGen, San Diego, CA)과 혼합된 각 펩타이드(각각 펩타이드 318, 356, 510 및 530)를 용량당 25mg씩 근육 주사했습니다. 및 10mg CpG 보조제를 사용하고, 보조제 존재 하에 2-주 간격으로 펩타이드 용량당 50mg을 2회 추가 증량했습니다. 보조제만을 사용한 백신접종은 음성 대조군으로 사용되었습니다. 두 번째 및 세 번째 면역화 후 10일 또는 14일에 면역화된 마우스로부터 혈청을 수집했습니다.
통계 및 구조 분석
모든 그래프는 GraphPad Prism으로 표시되었습니다. 그림 1, 2, 4의 그룹 간 통계적 비교는 Tukey 다중 비교를 사용한 1-방식 ANOVA를 통해 수행되었습니다. www.jacionline.org에서 사용할 수 있는 온라인 저장소의 그림 1 그림 E9 및 그림 E10에 표시된 상관 관계는 Pearson 상관 분석에 의해 결정되었습니다. P < .05의 차이는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. SARS-CoV-2 스파이크 단백질(단백질 데이터 뱅크[PDB; http://www.wwpdb.org/] ID: 6VXX 및 PDB ID: 6ZGI)의 구조와 SARS-CoV의 이량체화 도메인{{ 13}} 뉴클레오캡시드 단백질(PDB ID: 6YUN)을 사용하여 스파이크 단백질에 위치한 확인된 에피토프의 구조적 세부사항과 뉴클레오캡시드 단백질의 이량체화 도메인을 해부했습니다. 다양한 인간 코로나바이러스 간의 서열 정렬 및 상동성 분석은 MEGA v10.1.6 소프트웨어의 Clustal W 알고리즘에 의해 수행되었습니다.
결과
SARS-CoV-2 감염은 지속적인 항원 특이적 결합 및 중화 항체를 유도합니다.
SARS-CoV-2 감염 후 항체 반응을 종단적으로 평가하기 위해 PCR로 확인된 SARS-CoV-2 감염자 31명으로부터 101개의 혈청 샘플을 수집했습니다(그림 1, A). 연구 참가자에는 중등도의 코로나19-19 환자 26명이 포함되었으며, 1명은 무증상, 2명은 경증, 2명은 심각한 증상을 보였습니다(www.jacionline.org에서 온라인 저장소의 표 E1 참조). 본 연구에 등록된 환자의 연령 범위는 17~66세(평균 연령, 45세)였으며 남성(51.6%)과 여성(48.4%)이 거의 균등하게 분포되었습니다. 연구 참가자 중 가장 흔한 증상은 발열(83.9%), 기침(67.7%), 근육통(22.6%), 오한(22.6%)이었고, 평균 질병 기간은 15일이었습니다. 증상 발생 후 최대 219일까지 여러 시점에서 입원 및 회복 후 퇴원하는 동안 20명의 코로나19 환자로부터 총 90개의 혈청 샘플을 수집했습니다(그림 1, A 및 온라인 저장소의 표 E2 참조). 다른 11명의 참가자로부터의 샘플링은 후기 회복기(증상 발병 후 122~214일) 동안 단일 시점에 수행되었습니다. 또한 연령과 성별 분포가 일치하는 건강한 기증자 20명의 샘플이 대조군으로 포함되었습니다(표 E1). 혈청 샘플의 항원 특이적 IgG 항체는 SARS-CoV-2 N 단백질 또는 S 단백질로 사전 코팅된 ELISA를 통해 정량화되었습니다. 건강한 기증자와 비교하여, 항-N 및 항-S IgG 항체는 증상 발생 후 30일 이내에 코로나{46}} 환자에서 모두 발생했으며 기하 평균 종점 역가는 4.10(log10 항-N IgG)이고 4.20(log10 항-S IgG)(그림 1, B 및 C, www.jacionline.org 온라인 저장소의 표 E3 참조, 그림 E1, A 및 B 및 그림 E2), 혈청전환이 있다는 이전 관찰과 일치합니다. SARS-CoV-2 감염 후 1~2주에 발생합니다.5,38 이후 항원 결합 항체 역가는 시간이 지남에 따라 다양한 정도로 감소했습니다. 코로나-19 환자에서는 항-N IgG 항체 수준이 빠르고 극적으로 감소하는 것이 관찰된 반면, 건강한 기증자에 비해 질병 발병 후 최대 180~220일까지 더 높은 수준의 항-S IgG 역가가 유지되었습니다(그림 1, B). 및 C). 상관관계 분석을 통해 log10 항-N IgG 역가와 항-S IgG 역가 사이에 유의미한 상관관계가 있는 것으로 나타났습니다(r5 0.50 및 P < .001; 그림 1, F). 결합 항체를 정량화하는 것 외에도, 위형화된 SARS-CoV-2를 사용하여 코로나-19 환자의 기능적 중화 항체의 역학을 추가로 결정했습니다. 증상 발생 후 4~30일 사이에 수집된 환자 혈청 샘플(35/37)의 95% 이상은 SARS-CoV-2에 대해 강력한 중화 활성을 나타냈으며, 대부분의 샘플은 중등도(NT{90}} ) ~ 강한(NT50 > 320) 중화 활성(그림 1, D 및 E). 주목할 점은 중화 역가가 없거나 낮은 2개의 샘플(최소 혈청 희석률 1:20의 NT50)을 바이러스 감염 후 초기(증상 발병 후 4일 및 11일)에 수집한 후 강력한 중화 항체를 유도했다는 것입니다(그림 1, D 및 그림 E1, C). 시간이 지남에 따라 코로나19 환자의 SARS-CoV 중화 항체 수준이 감소함에도 불구하고 증상 발생 후 180~220일 동안 채취한 대부분의 환자 혈청 샘플(24/25)은 SARS-에 대한 중화 양성 반응을 유지했습니다. CoV-2, 기하 평균 NT50 역가가 2.8-배 감소했습니다(그림 1, D 및 E, 표 E3, 그림 E3). 예상한 대로 항-N IgG 항체와 비교하여 SARS-CoV-2 S 결합 IgG 역가와 중화 항체 역가 사이에 더 강한 상관관계가 확인되었습니다(r 5 0.61 및 P < .001; 그림 1 , G 및 H), 이는 SARS-CoV-2 S 단백질이 중화 항체의 주요 표적이라는 연구 결과와 일치합니다. SARS-CoV-2의 S 단백질은 독성이 높은 SARS-CoV(76% 서열 동일성)와 높은 서열 유사성을 공유하고 MERS-CoV(34% 서열 동일성)와 낮은 서열 상동성을 나타냅니다. 코로나바이러스 사이의 혈청학적 교차 반응이 보고되었습니다.8,10,28,29 그러나 SARS-CoV-2에 대한 항체의 다른 코로나바이러스에 대한 교차 반응에 대한 종단적 추적 평가 데이터는 여전히 제한적입니다. 우리는 SARS-CoV-2에 감염된 개인의 세로 혈청에서 교차 결합 및 교차 중화 항체를 확인했습니다. 결과에 따르면 환자 혈청 샘플의 80% 이상이 증상 발생 후 1개월 이내에 SARS-CoV 및/또는 MERS-CoV의 S 단백질에 결합했으며, 이중 교차 반응성을 보이는 샘플의 27%가 나타났습니다(그림 1, I). SARS-CoV S 단백질에 대한 반응성은 초기(질병 발병 후 1-30일)에 검사한 샘플에서 MERS-CoV(35%)보다 더 큰 비율(73%)을 나타냈습니다(그림 1, I). 이중 교차 결합 및 SARS-CoV 교차 결합 항체는 질병 발병 후 180~220일에 이중 교차 결합 샘플이 8%, SARS-CoV 단일 교차 결합 샘플이 20%에 불과하여 시간이 지남에 따라 점진적인 감소를 보였습니다(그림 1). , I; www.jacionline.org에서 사용 가능한 온라인 저장소에서 www.jacionline.org에 있는 이 기사의 온라인 저장소에 있는 그림 E4, A, 그림 E5, A 및 그림 E6을 참조하십시오. 흥미롭게도 MERS-CoV S 단백질 반응성 항체의 양성은 시간이 지나도 상대적으로 일정하게 유지되었습니다(그림 1, I). 높은 교차 결합 능력과 달리, 소수의 환자 혈청 샘플만이 SARS-CoV 및/또는 MERS-CoV 슈도바이러스를 교차 중화했습니다(그림 1, I; 그림 E4, B; 그림 E5, B; 그림 E7 참조). 온라인 저장소). 증상 발생 후 1~30일에 수집된 샘플의 약 27%에서 교차 중화 활동이 나타났으며, 이 수치는 180~220일에 20%로 감소했으며 SARS-CoV 교차 중화 활동에 더욱 극적인 변화가 나타났습니다(그림 1, I ). 질병 발병 후 30일 이내에 MERS-CoV보다 SARSCoV를 교차 중화시킨 샘플의 비율이 더 높습니다. SARS-CoV와 MERS-CoV 교차 중화를 나타내는 샘플의 비슷한 비율에도 불구하고 교차 중화 양성인 혈청 샘플 중에서 MERS-CoV의 NT50 값이 SARSCoV의 NT50 값보다 훨씬 낮았다는 점은 주목할 가치가 있습니다(그림 E4, B; 그림 E5, B; 그림 E7).
시스탄체 식물의 면역 체계 증가
SARS-CoV-2 감염으로 인해 사이토카인 생산이 활성화됩니다.
SARS-CoV-2 감염 후 면역학적 변화를 종합적으로 특성화하기 위해 우리는 코로나-19 환자의 혈청에서 사이토카인 수준의 역학적 변화를 추가로 평가했습니다. 증상 발생 후 첫 2개월 이내에 수집된 55개의 세로 혈청 샘플을 단백질 기반 마이크로어레이를 통한 사이토카인 생산 검출에 사용했습니다. IL-1a(전염증성), IL-6(전염증성) 및 IL-10(항염증성)을 포함한 여러 사이토카인의 혈청 수준 증가가 질병 발병 첫 달 동안 관찰되었습니다. ), 이는 중증 코로나-19 사례39,40 뿐만 아니라 IFN-g(TH1 유형) 및 IL-4(TH2 유형)에서 사이토카인 방출 증후군과 관련이 있습니다(그림 2, A, www.jacionline.org에서 이용 가능한 온라인 저장소의 그림 E8). 구체적으로, IL-6, IL-10 및 IFN-g의 혈청 수치는 환자의 증상 발생 후 15일 이내에 증가했다가 후기 단계에서 감소하는 반면, IL-1의 방출은 a와 IL-4은 발병 후 16~30일 동안 현저하게 증가하다가 이후 급속히 정상 수준으로 감소하는 것으로 나타났다(그림 2, A). 상관관계 분석에서는 SARS-CoV-2 감염 후 항원 특이적 항체 반응과 사이토카인 생산 사이에 약하거나 선형 연관성이 없는 것으로 나타났습니다. 그러나 IL-10과 SARS-CoV{{ 수준 사이에는 통계적 유의성이 관찰되었습니다. 34}} N 단백질 결합 항체(r 5 0.321 및 P < .05), IL-1b 생산과 S 단백질 결합 항체(r 5 20.335 및 P 사이)<.05), and between TNF-a and S protein binding antibody levels (r 5 20.335 and P <.05; see Fig E9 in the Online Repository). To allow direct visualization and comparison among patient samples across multiple cytokine responses over time, we constructed a heat map showing fold changes in cytokine release relative to the healthy donor control group (Fig 2, B). Consistent with our findings presented above, elevated serum cytokine levels after SARS-CoV-2 infection were predominantly observed during the acute phase and an early period of convalescence (within 30 days after disease onset) (Fig 2, A and B). Among cytokines tested, proinflammatory IL-6 exhibited the most robust response, with a 4.9-fold increase and a 2.9-fold increase on average for samples collected during 1 to 15 days and 16 to 30 after onset of symptoms, respectively (Fig 2, B). Of note, 1 serum sample (sample Pt-S22, collected on day 18 after disease onset) obtained from a COVID–19–infected individual with moderate disease, exhibited a marked increase in the production of multiple proinflammatory cytokines, including IL-1a, IL-1b, IL-6, and TNF-a (Fig 2, B). Additionally, hyperproduction of cytokines including IL- 1a, IL-4, IL-6, IL-10, IL-13, and IFN-g was also detected in 1 sample (sample Pt-S11, collected at day 15 after disease onset) collected from a severe case of COVID-19; presumably, these are associated with disease severity and outcome (Fig 2, B). These results indicate broad inflammatory activation and changes over time involving the concomitant release of proinflammatory and anti-inflammatory cytokines as well as TH1-type and TH2-type cytokines in COVID-19 patients.
전체 단백질체 에피토프 매핑은 코로나-19 환자의 지속적인 체액성 면역 반응을 중재하는 우성 에피토프를 식별합니다.
시간이 지남에 따라 SARS-CoV-2에 대한 체액성 면역의 특징을 더 잘 특성화하기 위해 우리는 펩타이드 기반 마이크로어레이를 사용하여 프로테옴 전체 에피토프 매핑을 적용했습니다. SARS-CoV-2 프로테옴을 덮는 펩타이드 라이브러리가 생성되어 슬라이드에 고정되었으며, 각 펩타이드의 길이는 15 aa이고 중복되는 부분은 11 aa였습니다. 무증상(n 5 1) 또는 경증(n 5 2)~중등도(n 5 15) 또는 중증(n 5 1) 환자 19명으로부터 얻은 총 51개 종단적 혈청 샘플 ) SARS-CoV-2 감염을 테스트했습니다(표 I). 상대적으로 균형 잡힌 샘플링 수, 간격 및 시점을 달성하기 위해 증상 발병 후 16~219일 범위의 각 코로나19-19 참가자로부터 2~3개 시점에서 순차적으로 샘플을 수집했습니다. 무증상 감염을 보인 한 사람을 제외하고(18/19) 대부분의 환자는 바이러스 감염 후 중화항체를 생성했습니다(표 I). 다양한 샘플링 시점에 따라 샘플은 10-60일(n 5 18), 100-150(n 5 18)일, {{28일)의 3개 그룹으로 나누어졌습니다. }} (n 5 15). 혈청 IgG 및 IgM 항체 모두에 대해 코로나{31}} 환자의 바이러스 에피토프 프로필에 대한 종단 평가가 수행되었으며, 20명의 건강한 기증자로부터 수집된 혈청을 음성 대조군으로 사용했습니다. SARS-CoV-2 프로테옴 마이크로어레이를 사용하여 펩타이드 결합 항체 반응의 동역학을 결정하고 (1) 결합 신호 강도, (2) 각 펩타이드에 대한 양성-반응 샘플의 비율(양성률)을 분석했습니다. . 음성 대조군의 신호 강도의 두 배로 설정된 양성 펩타이드 결합 반응에 대한 컷오프 값을 기반으로 우리는 최소 1명의 환자와 반응하는 IgG에 대한 총 460개의 양성 펩타이드와 IgM에 대한 479개의 양성 펩타이드를 확인했습니다. 혈청 샘플. SARS-CoV-2의 양성 펩타이드 수와 다양한 ORF(오픈 리딩 프레임)에 대한 반응 분포는 서로 다른 샘플링 그룹 간에 상대적으로 안정적이었으며 시간이 지남에 따라 양성 펩타이드 수가 약간 감소하는 경향이 있었습니다(그림 3, ㅏ). 가장 큰 반응성은 전체 게놈의 2/3 이상을 차지하는 가장 큰 ORF인 레플리카제 폴리단백질 ORF1ab에서 확인되었습니다(그림 3, A). 흥미롭게도 우리는 SARS-CoV-2 감염 후 초기(질병 발병 후 며칠 10-60; 온라인 저장소의 그림 E10 참조) 양성 펩타이드 결합 반응과 혈청 사이토카인 수준 사이에 중간 정도에서 강한 정도의 상관 관계를 관찰했습니다. www.jacionline.org). IgM에 대한 양성 결합 펩타이드의 수는 IL-6 및 IL-10의 혈청 수준과 연관되어 있는 것으로 나타났습니다. 마찬가지로, 총 반응성 펩타이드의 평균 신호 강도와 IgM에 대한 ORF1ab 결합 펩타이드의 평균 신호 강도는 혈청 샘플에서 IL{57}} 및 IFN-g 생산과 긍정적인 연관성을 나타냈습니다. 이러한 데이터는 SARS-CoV-2 감염 후 사이토카인 수준의 변화가 항원 특이적 체액 반응에 의해 인식되는 에피토프의 크기와 폭에 영향을 미칠 수 있음을 시사합니다. 양성 에피토프 식별을 기반으로 우리는 3개의 샘플링 그룹 각각 중에서 코로나19{63}} 샘플의 80% 이상에서 지속적으로 반응성을 유지하는 가장 일반적인 에피토프를 추가로 선택했습니다(우성 및 지속 에피토프라고 함). 결과는 장기 체액성 면역 반응을 중재할 수 있는 이러한 우세한 에피토프가 SARS-CoV-2 ORF1ab 다단백질 및 S 단백질에 위치하며 IgM 항체(n{69}})에 의해 인식되는 에피토프가 더 많은 것으로 나타났습니다. IgG 항체(n5 10)(그림 3, B 및 표 II; www.jacionline.org 온라인 저장소의 그림 E11 및 그림 E12 참조). ORF1ab 다단백질은 장기 반응을 매개하는 우성 에피토프의 최대 수를 보유했으며, 에피토프는 비구조 단백질 영역(nbsp) 2-5, nbsp 8-10, nbsp 12-14, 및 nbsp 16(표 2). 특히, 우리는 혈청 샘플링 시점에 관계없이 100% 코로나-19 환자의 IgG 및 IgM 항체에 의해 인식될 수 있는 하나의 면역우세 에피토프 2073(ORF1ab, aa 5801-5815)을 식별했습니다(그림 3, B 및 표 II, 온라인 저장소의 그림 E13 및 그림 E14 참조). 반응성이 높은 이 펩타이드는 ORF1ab 다단백질의 헬리카제(nsp 13) 영역 내에 위치하며, 이는 SARS-CoV-2 복제 동안 이중 가닥 RNA 주형을 푸는 데 필수적입니다.41 선택된 ORF1ab 펩타이드 중 2개의 면역우세 펩타이드 IgG 항체가 인식하는 평균 신호 강도가 가장 높은 번호 1985(ORF1ab, aa 5449-5463)와 번호 2073(ORF1ab, aa 5801-5815)은 모두 nsp 13에 위치합니다. IgM 반응의 경우 펩타이드 685 nsp 2의 ORF1ab, aa 249-263)와 nsp 13의 펩타이드 1985(ORF1ab, aa 5449-5463)가 가장 강력한 결합 강도를 나타냈습니다(그림 3, B). 다양한 펩타이드(그림 3, B)에 대한 기준선 신호(건강한 기증자의 풀링된 혈청)의 변화를 고려하여 건강한 대조군과 비교하여 각 주요 펩타이드에 대한 신호 강도의 배수 변화를 추가로 계산했습니다. 결과는 nsp13 영역에 위치한 펩티드 2073(IgG 결합) 및 펩티드 1985(IgM 결합)가 최대 180~220일까지 수집된 환자 혈청 중에서 최고 펩티드 결합 강도(배 변화)를 유지함을 보여주었습니다(그림 E13 및 그림 E14).
그림 2. 코로나-19 환자의 사이토카인 생산 동역학. A, 16명의 코로나19-19 환자로부터 수집한 55개 혈청 샘플의 급성기 및 초기 회복기 동안 사이토카인 생산 수준을 단백질 마이크로어레이 기반 ELISA로 검출했습니다(일 1-15, n 5 11; 일 16-30, n 5 26; 일 31-61, n 5 18; 건강한 기증자, n 5 20). 각 점은 개별 혈청 샘플을 나타냅니다. 점선은 검출 한계를 나타냅니다. 통계적 유의성은 Tukey 다중 비교를 사용한 1-방식 ANOVA에 의해 결정되었습니다. *P < .05, **P < .01, ****P < .0001. B, 건강한 기증자의 20개 샘플 평균값과 비교하여 (A)에 표시된 코로나{18}} 환자의 각 사이토카인 생산 수준의 변화 배수. 각 열은 증상이 발생한 후 표시된 시점에서 수집된 별개의 혈청 샘플을 나타냅니다. 각 행은 테스트된 1개의 개별 사이토카인을 나타냅니다.
표 I. 에피토프 매핑에서 코로나-19 환자 및 샘플 코호트의 특성
그림 3. SARS-CoV-2에 감염된 개인의 장기 항체 반응에 기여하는 우성 에피토프의 IgM 및 IgG 인식. SARS-CoV-2의 프로테옴을 덮는 펩타이드 마이크로어레이를 사용하여 코로나19 환자 19명의 에피토프 혈청 인식에 대한 종단 분석. 환자 샘플(n{8}})에서 펩타이드 결합의 양성 반응에 대한 컷오프 값은 20명의 건강한 기증자로부터 수집된 혈청의 신호 강도의 두 배로 설정되었습니다. A, 10-60일(n 5 18), 100-150일(n 5 18)에 수집된 1개 이상의 샘플에서 검출 가능한 펩타이드 수 및 양성 결합 펩타이드의 분포, 질병 발병 후 180- 220일(n 5 15). 숫자는 각 ORF에서 확인된 총 IgG 및 IgM 에피토프를 나타냅니다. B, 3개의 샘플링 시점 모두에서 80% 이상의 샘플에서 지속적으로 반응성을 보인 지배적이고 지속적인 IgG 및 IgM 에피토프의 신호 강도(x축). 각 점은 건강한 기증자로부터 수집된 혈청(상단) 또는 증상 발병 후 표시된 시점에서 수집된 별개의 환자 혈청 샘플을 나타냅니다. E, 봉투 단백질.
TABLE II. Epitopes with >3개 샘플링 시점 모두에서 80% 양성률
SARS-CoV-2 S 단백질의 지배적이고 지속적인 에피토프는 NTD 및 S2 하위 단위에 위치합니다.
SARSCoV-2 S 단백질로부터 총 4개의 지배적이고 지속적인 에피토프가 확인되었습니다: 펩타이드 318(S, aa 45-59) 및 펩타이드 356(S, aa 197-211)은 다음 위치에 있습니다. NTD 지역 내; S2' 절단 부위와 S2 서브유닛의 FP 부분을 덮는 펩타이드 510(S, aa 813-827) 및 연결 영역에 위치한 펩타이드 530(S, aa 893-907) FP와 S2 서브유닛의 첫 번째 헵타드 반복 영역 사이(그림 3, B 및 표 II). 우리가 선택한 S 단백질의 주요 펩타이드 중에서 S 단백질의 NTD에 위치한 펩타이드 318은 가장 강력한 결합 강도를 나타냈습니다(대조군에 비해 배수 변화; 그림 E13 및 그림 E14). 구조 분석에 따르면 이러한 에피토프는 단량체 S 단백질의 표면에 완전히 노출되어 있습니다. 그러나 펩타이드 318, 356 및 530에 대한 에피토프의 일부 잔기는 삼량체 S 단백질의 표면 아래에 숨겨져 있습니다(그림 4, A 및 B). 상황. 구체적으로 말하면, 펩타이드 318의 2개 루프 세그먼트(aa 45-46 및 aa 56-59)는 삼합체 S 단백질에 노출되며 중앙 b-가닥은 내부에 묻혀 있습니다. 코어 b-가닥(aa 203-209) 및 루프 세그먼트(aa 210-211)를 포함하여 펩타이드 356의 대부분의 잔기는 표면에서 접근 가능합니다. 펩티드 510은 S2' 절단 부위와 FP의 중심 나선을 포함하며, 둘 다 S 단백질의 표면에 완전히 나타납니다. 펩타이드 530의 잔기는 삼량체 S 단백질에 노출된 루프(aa 893-895)의 작은 부분만 가지고 대부분 비밀스럽습니다(그림 4, C). 7개의 일반적인 인간 코로나바이러스 간의 서열 상동성 분석에서는 S2 서브유닛(펩타이드 510 및 530)에 위치한 2개의 에피토프가 다른 코로나바이러스와 높은 서열 동일성을 공유하는 것으로 나타났으며, 이는 인간 코로나바이러스 중에서 이러한 에피토프를 표적으로 하는 혈청학적 교차 반응성을 시사합니다(그림 4, D). 펩타이드 318의 서열은 SARSCoV와 높은 유사성을 보인 반면, 펩타이드 356의 서열 상동성은 코로나바이러스 사이에서 낮은 수준으로 나타났는데, 이는 이 영역을 표적으로 하는 SARS-CoV-2 특이적 항체 반응을 시사합니다(그림 4, D). 전 세계적으로 새로 출현하고 순환하는 SARS-CoV-2 변종을 고려하여, 우리는 초기 SARS-CoV-2 균주(Wuhan-Hu{{52} }) 및 5가지 우려 변종(Alpha, Beta, Gamma, Delta, Omicron)과 2가지 관심 변종(Lambda 및 Mu)(세계보건기구 변종 바이러스 분류에 따름)(2021년 11월 30일 업데이트됨) ). 결과는 새로운 Omicron 변이체에서 확인된 단일 N211I 돌연변이를 제외하고 분석된 변이체들 사이에서 이러한 우성 및 지속성 에피토프의 서열이 거의 동일하다는 것을 보여주었습니다(그림 4, E). 이러한 데이터는 초기 SARS-CoV-2 변종에 의해 생성된 항체가 현재 순환하는 변이체를 일관되게 인식할 수 있으며 이러한 주요 에피토프가 SARS-CoV 감염 시 지속적인 장기 항체 반응을 중재할 수 있음을 나타냅니다.-2 변형. S 단백질에서 확인된 에피토프의 면역학적 특성을 추가로 확인하고 이러한 S 단백질 에피토프의 펩타이드 백신 후보로서의 잠재적 가치를 추가로 조사하기 위해 선택된 펩타이드를 사용하여 마우스 면역화 연구를 수행했습니다. BALB/c 마우스에 명반 및 CpG 보조제의 존재 하에 각 펩타이드를 3회 접종했습니다(그림 4, F). 선택된 4개의 펩타이드 중에서 펩타이드 356을 이용한 백신접종은 2차 및 3차 투여 후에 항원 특이적 항체를 유도했습니다(그림 4, G). 혈청 중화 분석 결과에 따르면 선형 펩타이드를 사용한 면역화는 SARS-CoV-2에 대한 상당한 수준의 중화 항체를 생성하지 않았으며(그림 4, H), 이는 이러한 선형 펩타이드가 강력한 중화 항체 반응을 유도하는 데 제대로 수행되지 않음을 나타냅니다.
SARS-CoV-2의 N 단백질에는 바이러스 감염 후 지속적인 항체 반응을 중재하는 대부분의 반응성 에피토프가 부족합니다.
많은 연구에서 SARS-CoV-2 N 단백질의 강력한 항원성이 밝혀졌습니다.4,11,12 그러나 현재 선택 기준에 따라 N 단백질에 위치한 우성 및 지속성 에피토프를 식별하지 못했습니다. (3개 샘플링 시점 모두에서 양성률 80% 이상). 코로나-19 환자의 N 단백질의 에피토프 프로필에 대한 종단적 평가를 위해 우리는 지속적으로 양성 반응성을 유지하는 하위 에피토프를 선택하기 위해 펩타이드 마이크로어레이에서 얻은 데이터를 기반으로 한 두 번째 에피토프 스크리닝을 수행했습니다. 3개의 샘플링 시점 각각에 대한 코로나19-19 샘플의 60% 이상(하위 우성 및 지속성 에피토프라고 함). SARS-CoV-2 N 단백질의 총 4개의 하위 우세 및 지속성 에피토프가 확인되었으며, 그 중 펩타이드 2455(N, aa 213-227)는 코로나19에서 IgG 및 IgM 항체 모두에 반응성을 나타냈습니다.{{16 }} 신호 강도가 비교적 높은 환자(그림 5, A 및 B, www.jacionline.org 온라인 저장소의 표 E4 참조). 2개의 중첩 펩타이드인 펩타이드 2455(N, aa 213-227) 및 펩타이드 2456(N, aa 217-231)은 N 말단 RNA 결합 도메인 사이의 Ser/Arg가 풍부한 링커 영역에 위치합니다. 및 N 단백질의 C-말단 이량체화 도메인. 펩티드 2482(N, aa 321-335) 및 펩티드 2491(N, aa 357-371)은 N 단백질의 이량체화 도메인 내에 완전히 또는 부분적으로 위치합니다(표 E4). N 단백질의 손상되지 않은 형태와 관련된 3-D 구조가 부족하기 때문에 C-말단 이량체화 도메인의 이량체 구조에 대해 확인된 2개의 에피토프의 구조 분석만 수행했습니다. 펩타이드 2482의 잔기는 이량체화 경계면에서 역평행 방식으로 배열된 2b 가닥을 형성하는 반면, 펩타이드 2491의 aa{37}}는 이량체의 반대쪽 끝에 위치한 나선 기반 구조를 형성합니다(그림 5, C). . 초기 SARS-CoV-2(Wuhan-Hu-1 계통)와 7개의 새로운 변종 사이의 서열 정렬을 통해 N 단백질의 이러한 하위 지배적 및 지속성 에피토프의 서열이 현재 순환하는 변종 사이에서 거의 동일하다는 사실이 추가로 밝혀졌습니다. Delta 변종에서 발생하는 펩타이드 2455의 단일 G215C 치환과 Lambda 변종에서 확인된 펩타이드 2455의 단일 G214C 돌연변이는 이러한 펩타이드를 표적으로 하는 항체가 신흥 SARS-CoV-2 변종의 항원을 잠재적으로 인식함을 시사합니다(그림 5, D ).
그림 4. 지속성 체액성 면역 반응 매개 측면에서 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 주요 에피토프. A 및 B, 단량체(A) 및 삼량체(B) S 단백질(PDB ID: 6VXX)의 3-D 구조에 대한 지배적이고 지속적인 에피토프의 위치. 에피토프는 녹색(펩티드 356, aa 197-211), 빨간색(펩티드 318, aa 45-59), 파란색(펩티드 510, aa 813-827) 및 보라색(펩티드 530, aa)으로 강조 표시됩니다. 893-907) 각각. 닫힌 형태의 세 가지 S 단량체는 각각 회색, 분홍색 및 청록색으로 표시됩니다. C, S 삼량체(PDB ID: 6VXX)의 폐쇄 상태에 있는 SARS-CoV-2 S 단백질의 우세 에피토프에 대한 상세한 구조 분석. D, 일반적인 인간 코로나바이러스 중에서 확인된 에피토프의 서열 정렬. SARS-CoV-2와 다른 인간 코로나바이러스 사이에 보존된 에피토프 잔기는 회색으로 표시됩니다. E, 초기 SARS-CoV-2(Wuhan-Hu-1 계통) 및 7개의 새로운 변종에 대한 에피토프 보존 분석. 검은 점은 우한후-1 균주와 표시된 균주 사이의 동일한 잔기를 나타냅니다.
그림 5. SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질에 위치한 하위 에피토프는 지속적인 항체 반응을 중재할 수 있습니다. 질병 발병 후 여러 시점에 수집된 환자 혈청 샘플 중 하위 펩타이드의 A, IgG 및 IgM 인식 빈도(60% 이상의 샘플에서 지속적으로 반응성). B, 시간 경과에 따른 확인된 하위 우세 에피토프의 신호 강도 동역학. 각 점은 증상 발병 후 표시된 시점에 코로나19-19 환자로부터 얻은 별개의 환자 혈청 샘플을 나타냅니다. 점선 수평선은 각 펩타이드에 대한 양성 반응의 컷오프 값을 나타냅니다. C, N 단백질의 C-말단 이량체화 도메인에 대한 에피토프의 상세한 구조 분석(PDB ID: 6YUN). 에피토프는 파란색(펩티드 2482, aa 321-335) 및 갈색(펩티드 2491, aa 357-364)으로 표시되어 있습니다. 2개의 단량체 구조는 각각 회색과 청록색으로 표시됩니다. D, 초기 SARS-CoV-2(Wuhan-Hu-1 계통)와 7개의 새로운 변종 사이에서 확인된 N-단백질 에피토프의 서열 정렬 분석. 검은색 점은 우한-후-1 균주와 표시된 변종 사이의 동일한 서열을 나타냅니다. 아미노산 서열의 변화는 빨간색으로 강조 표시됩니다.
그림 6. SARS-CoV-2에 감염된 개인이 인식하는 높은 결합 강도와 시간이 지남에 따라 반응 빈도가 감소하는 라이너 에피토프. A 및 B, 높은 결합 신호 강도(모든 테스트 샘플의 신호 강도의 평균 1SD 이상)를 나타내지만 시간이 지남에 따라 양성률이 감소하는 확인된 펩타이드의 종단 분석 및 분포. 에피토프의 인식 빈도(A)와 신호 강도(B)는 증상 발병 후 3개의 샘플링 시점으로 표시되었습니다. (B)의 각 점은 증상 발병 후 지정된 시점에 수집된 개별 환자 혈청 샘플을 나타냅니다. 점선 수평선은 각 펩타이드의 양성 컷오프 값을 나타냅니다. 통계적 유의성 분석은 Limma of R v3.6.3 소프트웨어를 기반으로 수행되었습니다. *P < .05 및 **P < .01. C, SARS-CoV{14}} S 단백질 구조(PDB ID: 6ZGI)에서 2개의 인접한 에피토프인 펩타이드 510(우성 및 지속성)과 펩타이드 511(높은 신호 강도 및 시간 경과에 따른 양성 감소)의 위치 및 서열 비교 . 2개의 에피토프 사이의 겹치는 영역은 녹색으로 강조 표시됩니다. 고유한 시퀀스는 빨간색과 파란색으로 표시되어 있습니다.
종단적 혈청학적 분석을 통해 신호 강도는 높지만 시간이 지남에 따라 반응성이 감소하는 에피토프를 식별합니다.
위에서 언급한 지속적인 체액성 면역 반응을 담당하는 선택된 고반응성 에피토프 외에도 우리는 강력한 결합 강도(테스트된 모든 샘플의 신호 강도의 평균 1SD 이상)를 나타내는 9개의 양성 펩타이드 패널을 추가로 식별하고 특성화했습니다. 체액성 면역 반응이 약해지는 일반적인 추세에 따라 시간이 지남에 따라 코로나19 환자의 혈청 샘플에서 반응성이 감소하는 추세(양성률 20% 이상 변화). 이러한 에피토프는 3가지 주요 항원인 ORF1ab, S 및 N 단백질 내에 위치합니다(그림 6, A; www.jacionline.org 온라인 저장소의 표 E5 참조). 또한 ORF1ab(펩타이드 784-IgG, 1617-IgM 및 1986-IgM) 및 N(펩타이드 2457-IgG) 단백질의 4개 펩타이드의 신호 강도가 크게 감소한 것으로 관찰되었습니다. 샘플링 시점의 초기 기간(질병 발병 후 10-60일)과 샘플링 시점의 후기 단계(증상 발병 후 100-150일 또는 180-220일)의 샘플 사이(그림 6) , 비). 특히, S 단백질 펩타이드 510(지배적이고 지속적; 그림 3, B)과 펩타이드 511(높은 신호 강도 및 시간이 지남에 따라 감소하는 양성률; 그림 6, A)의 두 펩타이드는 서로 크게 중첩됨에도 불구하고 서로 다른 패턴을 나타냈습니다. 시간 경과에 따른 환자 혈청 샘플 간의 반응성. 서열 및 위치 분석에 따르면 펩타이드 510은 S2' 절단 부위와 813-SKRS-816의 추가 아미노산을 포함하는 반면, 펩타이드 511은 확장된 828-LADA{{29가 있는 FP 내에 완전히 포함되어 있습니다. }} 삼량체 S 단백질의 표면에 완전히 노출된 잔기(그림 6, C). 이러한 결과는 궁극적으로 SARS-CoV-2에 대해 더 오래 지속되고 더 강력한 체액성 면역에 기여할 수 있는 에피토프의 새로운 특징을 밝혀냈습니다.
논의
SARS-CoV-2 감염에 대한 장기적인 면역 반응을 체계적으로 특성화하는 것은 향상된 진단법, 효과적인 치료 중재 및 백신 개발에 매우 중요합니다. 이번 연구에서 우리는 180~220일 동안 추적관찰 기간 동안 코로나-19 환자에 대한 포괄적인 종단 분석을 수행했으며, 바이러스 감염 후 지속적인 체액성 면역 반응과 활성화된 사이토카인 생산을 보여주었습니다.
중요한 것은 SARS-CoV-2의 프로테옴에 걸쳐 있는 펩타이드 기반 마이크로어레이를 활용함으로써 에피토프 인식의 동역학을 추가로 밝혀내고 장기적인 체액성 면역을 중재할 수 있는 우세한 에피토프 패널을 확인했다는 것입니다. SARS-CoV-2 감염 후 체액성 면역 반응의 수명에 관해 여기서 보고하는 연구 결과는 이전에 발표된 일부 데이터5,10,12,13,42를 확인하지만 세로 혈청 샘플을 사용하여 심층 혈청학적 프로파일링 및 에피토프 스크리닝을 수행하여 이를 확장합니다. 프로테옴 전체 마이크로어레이 접근법을 통해 코로나19 환자로부터{11}} 본 연구에서 우리는 SARS-CoV-2 S 단백질 내에서 80% 이상의 코로나-19 환자에게 지속적으로 반응할 수 있는 4개의 주요 에피토프(펩타이드 318, 356, 510 및 530)를 식별했습니다. 증상 발생 후 최대 180~220일 동안 샘플을 테스트합니다. S2 절단 부위와 S2 하위 단위의 FP를 구성하는 펩타이드 510(S, aa 813-827)은 다른 그룹의 이전 연구에서 일반적으로 확인되었습니다.26,28,32-34 기능 분석에 따르면 항체 이 영역을 표적으로 삼는 것은 S 단백질 표면에 많이 노출됨에도 불구하고 SARS-CoV-22633에 대해 제한적인 중화 효능을 나타낼 수 있습니다(그림 4, AC). FP와 S2 서브유닛의 첫 번째 헵타드 반복 영역 사이에 위치하는 펩타이드 530(S, aa 893-907)의 경우 잔기는 일반적으로 S 단백질의 삼량체 구조 내부에 묻혀 있으므로 SARS-CoV-2에 대한 강력한 중화 항체를 통해 접근하기 어렵습니다(그림 4, AC). 또한 SARS-CoV-2의 장기 항체 반응을 중재할 수 있는 2개의 S1-NTD 지향 펩타이드도 선택되었습니다. 펩타이드 서열 및 위치에 대한 분석 결과, 이들 2개 펩타이드의 잔기(펩타이드 318(S, aa 45-59) 및 펩타이드 356(S, aa 197-211))가 인식되는 보고된 에피토프에 매우 근접한 것으로 나타났습니다. 감염을 강화하는 항체에 의해23,25 그러나 S1 하위 단위의 NTD를 표적으로 하는 매우 강력한 중화 항체의 핵심 부위는 제외하고16,19,43 이는 확인된 2개의 펩타이드에 대한 비중화 항체에 의한 에피토프 인식 가능성을 시사합니다. 위에서 언급한 세부 사항 외에도, 선택된 펩타이드를 사용한 마우스 면역화는 강력한 중화 항체 반응을 유도하는 데 있어 이러한 비수용체 결합 도메인 선형 펩타이드의 낮은 효능을 추가로 나타냈습니다(그림 4, G). 종합적으로, 이러한 데이터는 SARS-CoV-2 감염에 대한 장기 체액성 면역 반응을 매개하는 우세한 선형 에피토프가 아마도 중화 효능이 없거나 제한적인 항체를 유도할 가능성이 있음을 시사합니다. SARS-CoV-2 항체, 특히 S 단백질 지향 에피토프의 에피토프 환경에 대한 완전한 이해는 항체의 기능적 해부에 대한 새로운 통찰력을 제공하여 혁신적이고 합리적인 백신 설계를 더욱 촉진합니다. 중화 항체는 바이러스 감염을 제거하는 보호 기능을 제공하는 반면, 비중화 항체는 바이러스 제거 중에 유익하거나 중립적이거나 심지어 해로운 역할을 할 수 있습니다. 비중화 항체는 항체 의존성 식세포작용 및 항체 의존성 세포독성과 관련하여 다양한 Fc 매개 이펙터 기능을 통해 생체 내에서 추가 보호를 제공합니다. 대조적으로, 일부 연구에서는 코로나바이러스 감염에서 비중화 항체의 병원성 역할 가능성을 제안했습니다. SARS-CoV 및 MERS-CoV에 대한 여러 유형의 백신 후보를 사용한 이전 연구에서는 바이러스 공격 후 백신을 접종한 작은 동물과 사람이 아닌 영장류에서 면역병리학이 강화된 것으로 관찰되었습니다.24,44-50 보다 최근에는 두 그룹에 대한 연구에서 중화되지 않는 것으로 보고되었습니다. SARS-CoV-2 S 단백질의 NTD를 표적으로 하는 항체는 Fcg 수용체 독립적 메커니즘을 통해 시험관 내에서 바이러스 감염을 강화할 수 있었지만,23,25 동물 모델에서 수동적으로 투여된 감염 강화 항체는 SARS에 대해 보호하는 것으로 나타났습니다. -CoV-2 생체 내 감염. 코로나바이러스 감염 시 항체의 논란의 여지가 있는 역할을 고려할 때, 생체 내에서 바이러스 감염과 싸우는 데 있어 이러한 지배적이고 지속적인 에피토프를 인식하는 항체의 잠재적인 역할을 검증하기 위해서는 추가 조사가 필요합니다. SARS-CoV-2에 대한 합리적인 백신 설계의 다음 단계는 매우 강력한 중화 항체와 보호적 비중화 항체를 유도하는 동시에 감염 강화 에피토프 또는 면역우세 에피토프의 발현을 감소시킴으로써 구상될 수 있습니다. 유익한 효과. 이전의 여러 연구에서는 중화와 관련된 항체 기능을 묘사하는 것을 목표로 SARS-CoV-2의 S 단백질에만 초점을 맞추었지만, 우리는 포괄적인 프로테옴 전체 에피토프 매핑을 수행하고 ORF1ab 다단백질 내에서 다음과 같은 에피토프 패널을 식별했습니다. 시간이 지남에 따라 환자 혈청 샘플의 높은 비율로 일관되게 인식되었습니다. 여러 비구조 단백질에 분포된 이러한 ORF1ab 지향 펩타이드는 SARS-CoV-2 비리온을 표적으로 하는 기능성 항체를 유도하지 못할 수 있지만, 자연 감염과 예방접종을 구별하는 데 도움이 되는 진단 도구로 적용될 수 있습니다. 전 세계적으로 백신 접종자 수가 증가함에 따라 S 단백질과 N 단백질을 기반으로 하는 현재의 혈청학적 테스트는 SARS-CoV-2 감염 검출을 위한 분자 테스트를 지원하는 효과적인 접근 방식으로서 도전에 직면해 있습니다. 바이러스 감염 후 면역 상태 결정. 코로나19 감염자 중 ORF1ab 내에서 가장 일반적이고 지속적으로 반응하는 펩타이드를 활용함으로써 수용체 결합 도메인 기반 S 단백질과 관련된 백신 접종 상태를 고려하지 않고 자연 감염에 대한 혈청학적 진단이 수행됩니다. 기반 및 비활성화 바이러스 기반 백신 접근법. SARSCoV-2에 감염된 개인과 백신 수혜자로 구성된 더 큰 집단에서 확인된 ORF1ab 펩타이드의 반응성, 민감성 및 특이성을 평가하기 위해서는 향후 연구가 필요합니다. 또한, 전장 단백질에 비해 펩타이드의 낮은 민감도와 일반적인 인간 코로나바이러스 간의 교차 반응 가능성을 극복하기 위해서는 다중 펩타이드 조합 전략을 통한 검출 효율성에 대한 추가 평가가 필요할 것입니다. 본 연구의 주요 제한점은 소규모 환자 코호트 규모에서 얻은 샘플이 상대적으로 적고 대다수의 참가자가 심각하지 않은 코로나{106}} 질병을 경험했다는 것입니다. 이는 질병의 심각도에 따라 달라질 수 있는 긍정적인 반응 빈도와 면역 반응의 크기에 관한 우리의 결론 중 일부를 제한할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이 연구에서 제시된 데이터는 SARS-CoV-2 감염 후 시간 경과에 따른 면역 반응 역학과 코로나19 환자의 체액성 면역 지속을 중재할 수 있는 주요 에피토프의 특징에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 종합적으로, 이러한 발견은 바이러스 감염에 의해 유발된 자연 면역의 수명에 대한 더 깊은 이해를 제공하고 혁신적인 예방접종 전략과 향상된 진단 접근법에 대한 광범위한 의미를 갖습니다.
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