수두대상포진 바이러스의 잘린 당단백질 E는 대장균 기반 백신 설계에 이상적인 면역원입니다.

수두-대상포진 바이러스(VZV)는 수두와 대상포진 질환을 모두 일으키는 전염성이 높은 병원체입니다. 높은 효능에도 불구하고 허가된 백신에는 안전성과 접근성에 대한 우려가 남아 있습니다. 여기서 우리는 E. coli 발현 시스템을 사용하여 VZV gE 면역원을 생산하고자 했습니다. 우리는 gE 단백질의 가용성 발현과 수율이 단백질에 대한 C 말단 절단을 통해 향상될 수 있으며, 이로써 백신 제조를 위한 강력하고 확장 가능한 정제 공정을 촉진할 수 있음을 발견했습니다. 이하 tgE로 지칭되는 납 절단 gE(aa 31-358)는 용액 내 균질한 단량체였으며 탁월한 항원성을 나타냈습니다. 마지막으로 우리는 tgE의 면역원성을 상업용 보드카 LAV 및 Shingrix 백신과 평가하고 비교했습니다. 우리는 알루미늄 보조제 tgE가 보드카 LAV와 비교하여 면역원성이 있음을 발견했습니다. AS01B로 보조제를 첨가한 경우 tgE의 2회 용량 면역은 특히 IFN- -발현 비율 측면에서 동일한 용량의 Shingrix 백신과 항체 반응 및 세포 매개 면역에서 유사하거나 더 나은 효능을 나타냈습니다. CD4+ T 세포. 결론적으로, 이 대장균 매개 tgE 발현 방법은 수두 및 대상포진 백신 개발을 위한 이상적인 VZV gE 면역원을 생성하기 위한 비용 효율적이고 확장 가능한 전략을 제공합니다.

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수두-대상포진 바이러스, 당단백질 E, 대장균, 백신

소개

수두-대상포진 바이러스(VZV)는 두 가지 주요 질병 범주를 유발하는 병원성 인간 알파 헤르페스바이러스입니다. 수두에 의한 1차 감염은 피부에 물집 같은 발진이 생기고 발열, 권태감과 같은 경미한 전신 증상이 나타나는 전염성이 높은 질병입니다. 주로 어린이에게서 발생합니다. 대상포진(HZ)은 노화로 인해 약화된 세포 면역 체계에 반응하여 바이러스가 잠복적으로 재활성화되어 여러 가지 다른 합병증이 있거나 없이 고통스럽고 국소적인 수포성 발진(HZ)을 유발합니다(Cohen, 2013; Heininger 및 Seward, 2006; Zerboni 외, 2014). 수두와 HZ는 둘 다 생약독화바이러스백신(LAV)으로 예방할 수 있습니다. 수두 예방을 위한 최초의 LAV는 Takahashi 등이 개발했습니다. (1974)은 vOka 바이러스 변종을 기반으로 하며 나중에 미국에서 일상적으로 사용하기 위해 Varivax로 허가되었습니다. 이후 HZ 예방을 위한 Zostavax의 개발 및 라이선싱이 이어졌습니다(Tseng et al., 2011). 불행하게도 Varivax 접종이 시작된 지 10년 동안 HZ 사례의 거의 1/3이 vOka 계통과 관련이 있는 것으로 확인되었습니다(Galea et al., 2008). -바이러스 유형을 지정한 다음 다시 활성화하여 HZ를 유발합니다. 또한, Zostavax의 효능은 투여 당시 환자의 연령에 반비례하며, 연령이 증가하면 효능이 낮아진다(Oxman et al., 2005). 이전 연구에서는 VZV 당단백질 E(gE)가 비리온 외피와 감염된 세포 표면에서 가장 풍부한 바이러스 당단백질인 것으로 나타났습니다. GE는 또한 vOka 백신 접종 이후뿐만 아니라 자연 수두 감염 동안 세포성 및 체액성 면역을 유도할 수 있는 가장 중요한 VZV 보호 항원 중 하나입니다(Arvin, 1992; Oliver et al., 2016). 최근 재조합 HZ 하위 단위 백신인 Shingrix(HZ/su)가 50세 이상의 성인에서 HZ 및 관련 대상포진후 신경통(PHN)을 예방하기 위해 승인되었습니다(Shah et al., 2019; Syed, 2018). 임상시험에서 싱그릭스는 효율적인 VZV 특이적 세포 매개 면역(CMI)을 유도했으며, 50년 이상 참가자들 사이에서 전체 백신 효능은 97.2%, 참가자들에서는 91.3% 이상의 보호율을 보였습니다. 70년까지. 이러한 발견은 연령에 관계없이 백신 접종을 받은 개인의 HZ 위험이 크게 감소했음을 종합적으로 나타내며, 따라서 ZOSTAVAX에 비해 더 강력한 백신 옵션이 됩니다(Lal et al., 2015; Shah et al., 2019).

시스탄체 식물의 면역 체계 증가

Shingrix는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현되는 재조합 gE 항원과 3-Odesacyl-4'-모노포스포릴 지질 A(MPL) 및 Quillaja saponaria를 함유한 리포솜 기반 보조제 시스템(AS01B)으로 설계되었습니다. Molina, 분수 21(QS21)(Dendouga et al., 2012). 그러나 재조합 CHO 세포는 긴 생산 주기가 필요하고 복잡한 정제 공정으로 인해 제조 비용이 높고 공급이 제한됩니다. 따라서 Shingrix는 특히 개발도상국에서 광범위하게 사용하기에 이상적인 백신 솔루션이 아닙니다(Kim et al., 2012). 미생물 발현 시스템은 빠른 성장, 배양 용이성, 낮은 생산 비용 등 포유류 발현 시스템에 비해 여러 가지 장점을 제공하므로(Overton, 2014), 따라서 수많은 바이오의약품의 발현 및 생산에 널리 사용됩니다(Adkins and Wagstaff, 1998; Monie 등, 2008; Wu 등, 2012). 그러나 원핵생물 시스템에서 재조합 진핵생물 단백질의 성공적인 발현을 위해서는 생산 중 잘못된 접힘 및 번역 후 변형 부족과 같은 몇 가지 어려움을 극복해야 합니다(Singh and Panda, 2005). 이러한 어려움에도 불구하고 미생물 발현 시스템은 광범위하고 비용 효율적인 백신 제조를 위한 이상적인 시스템을 제공할 수 있으므로 VZV 백신 설계를 위해 대장균 발현 시스템에서 항원을 조사하는 것이 필요합니다. 이전 연구에서 우리는 곤충 세포에서 재조합 gE(rgE) 단백질의 성공적인 발현을 보여주었고 마우스 면역화 및 mAb 생산을 위한 정제된 단백질을 얻었습니다(Liu et al., 2015). 이 연구를 바탕으로 여기서는 gE 단백질이 대장균에서 발현될 수 있는지 여부를 조사합니다. 우리는 대장균에서 C 말단 잘림(이하 잘린 gE(tgE) 또는 tgE라고 함)을 사용하여 gE 후보 항원의 비융합 용해성 발현을 조사하고 정제된 tgE 단백질을 특성화했습니다. 우리는 정제된 tgE가 천연 gE와 유사한 항원성을 가지며 마우스에서 vOka 중화 활성을 통해 높은 항체 역가를 유도할 수 있음을 보여줍니다. 우리 연구에서 생성된 tgE 항원의 면역원성을 LAV 및 Shingrix와 비교하면 우리 항원이 효율적인 체액 반응을 나타낼 뿐만 아니라 항원 특이적 CMI를 유도한다는 사실을 발견했습니다. 전반적으로, tgE 단백질 생산을 위한 우리의 대장균 전략은 수두와 HZ 예방접종 모두에 대해 산업적으로 생산된 대체 면역원의 길을 열어줄 수 있습니다.

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결과

대장균에서 재조합 tgE의 발현 및 정제

VZV gE 세포외 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 다양한 N- 또는 C-말단 절단을 갖는 구조물로 제조하고, E. coli에서의 단백질 발현을 위해 pTO-T7 벡터에 클로닝했습니다. gE의 전체 길이 세포외 도메인은 발현 중에 대장균에서 봉입체를 형성하는 경향이 있으며 이는 C 말단 절단으로 개선될 수 있습니다. 다양한 잘린 단백질 중에서 최고의 용해도는 gE(aa 31-358) 구조(그림 1A)에서 얻어졌으며, 이하에서는 잘린 gE 또는 tgE라고 합니다. 후보 tgE는 가용성 재조합 단백질로 성공적으로 발현되었으며 잠재적인 백신으로서의 추가 평가 및 개발을 위해 실험실 규모에서 3단계 크로마토그래피를 사용하여 박테리아 용해물의 상청액으로부터 정제되었습니다. 강력한 음이온 교환 크로마토그래피를 캡처에 사용한 다음 세라믹 수산화인회석 및 소수성 크로마토그래피 단계를 사용했습니다(그림 1B). 정제 공정의 연속 단계에서는 SDS-PAGE에서 tgE의 순도가 증가하는 것을 확인했습니다(그림 1C). tgE는 약 40 kD 밴드로 이동했으며 특정 항체 1B11과 좋은 반응성을 보였습니다(그림 1D). 전체 수율은 박테리아 그램당 약 500ug의 정제된 tgE였습니다.

잘린 gE의 특성

고성능 크기 배제 크로마토그래피(HPSEC)와 분석 초원심분리(AUC)를 사용하여 정제된 단백질의 균질성과 침강 계수를 분석했습니다. 곤충 세포 시스템(Liu et al., 2015)에서 정제된 rgE 단백질을 대조군으로 사용했습니다. HPSEC에서 tgE는 16.1분의 주요 유지 시간에서 날카로운 피크를 나타냈으며(그림 2A), 이는 정제된 tgE 단백질에 대한 높은 균질성을 반영합니다. AUC 실험에서 ~2.3S(그림 2B)에서 주요 침강 피크가 관찰되었으며, 이는 ~39.4kD에 해당하며, 이는 tgE가 용액에서 단량체로 존재함을 나타냅니다. 열 전개 과정 동안 열 용량을 모니터링하여 tgE 단백질의 열 안정성을 테스트하기 위해 시차 주사 열량계(DSC)를 사용했습니다. DSC 프로파일은 tgE에 대해 63.80도의 전이 온도(Tm) 값에서 단백질이 전개되는 동안 단 하나의 열 전이를 보여주었으며, 이는 rgE(63.64도)의 값과 유사합니다(그림 2C). 정제된 tgE 단백질의 구조적 완전성을 조사하기 위해 우리는 ELISA 분석을 사용하여 tgE의 항원성을 분석했으며, 대조군 역할을 하는 곤충 세포에서 발현된 정제된 rgE 단백질을 사용했습니다. 구조적 에피토프(mAb 1B11, 4G4, 14G1) 또는 선형 에피토프(4A2, 11B11, 11B12, 6H6, 10H6, 11E3)를 인식할 수 있는 9개의 mAb가 ELISA 테스트에 사용되었습니다(그림 3). 우리는 1B11을 제외하고 대부분의 항체에 대해 tgE 및 rgE 단백질에 대해 유사한 중앙값 유효 농도(EC50, ng mL-1) 값을 발견했는데, 1B11은 거의 10-배 더 낮은 반응성을 갖고 있어 항원성이 유사함을 시사합니다. 이러한 결과는 rgE의 주요 에피토프가 tgE 단백질에 잘 보존되어 있음을 시사합니다.

그림 1(Color online) 단백질의 발현 및 정제. tgE 구성 설계의 도식적 표현. 대장균 세포는 gE(aa 31-358) 잘린 유전자를 운반하는 재조합 플라스미드로 형질전환되었습니다. B, tgE 정제 공정의 도식적 표현. tgE는 3단계 크로마토그래피를 사용하여 용해된 상청액으로부터 정제되었습니다. C, 정제 과정 중 tgE의 SDS-PAGE 프로필. tgE의 분자량은 약 40kD입니다. M: 분자량 마커. 레인 1: 세포 용해물로부터 분리된 상청액; 레인 2: Q-FF 크로마토그래프에서 얻은 tgE 함유 분획; 레인 3: CHT 크로마토그래프에서 얻은 tgE 함유 분획; 레인 4: 순도가 높은 tgE 단백질을 함유한 부틸 크로마토그래프의 분획. D, 정제된 tgE의 면역블로팅.

생쥐에서 tgE에 의해 유도된 면역 반응 분석

tgE와 rgE의 면역원성을 비교하기 위해 우리는 연구 작업에 일반적으로 사용되는 두 가지 보조제인 알루미늄 기반 보조제 Al-001와 프로인트 보조제를 사용하여 단백질을 제제화했습니다. 마우스를 0주, 2주 및 4주차에 보조제 tgE 및 rgE 모두에 대해 1ug의 용량으로 3회 면역화시켰습니다. 첫 번째 면역화 후 5주차의 gE-특이적 항체 역가 및 T 세포 반응을 사용하여 다양한 보조제 제제의 면역원성을 결정했습니다. Al-001로 제제화된 tgE 백신으로 면역화된 마우스는 rgE 그룹의 마우스와 유사한 항체 프로파일을 보였으며, 프로인트 보조제는 rgE보다 tgE로 제제화되었을 때 더 나은 자극 효과를 보여주었습니다(그림 4A). 중화 역가는 tgE 또는 rgE 백신으로 면역화된 마우스에서 차이를 나타내지 않았으며, 다양한 보조제로 제제화된 tgE의 중화 역가는 ~103이었습니다(그림 4B). 그러나 세포내 사이토카인 염색(ICS)에 의한 비장세포의 CD4+ T 세포 분석에서 tgE 및 rgE 백신 모두 식염수 그룹과 비교하여 유사한 수준의 gE 특이적 IFN-을 유도했습니다(그림 4C, ~{ {22}}백신 그룹 또는 식염수 그룹의 경우 .1%), gE 특이적 IL의 중간 정도 시뮬레이션만 있음{{2{24}}}}(그림 4D, 백신 그룹의 경우 ~0.2% 대 ~0.1 식염수 그룹의 경우 %). 종합해 보면, 이들 결과는 tgE/Al-001 및 tgE/Freund의 보조제가 rgE에 의해 유도된 것과 비교할 만한 gE 특이적 면역 반응을 유도하며, 특히 강한 체액성 반응을 유도한다는 것을 보여줍니다.

LAV와 비교한 tgE 수두 백신 후보의 평가

다음으로 우리는 BALB/c 마우스에서 항체 생산과 알루미늄 보조제 tgE 단백질의 지속성을 평가했습니다. 두 그룹의 마우스(그룹당 n=5)를 0주, 2주, 4주차에 서로 다른 용량의 0.5 ug 및 5 ug의 tgE/Al{{로 3회 면역화했습니다. 8}}(그림 5A 및 B). 항체 반응 프로파일은 tgE 단백질의 1차 접종이 높은 항체 역가를 유도했으며, 2주차와 4주차에 2회 추가 면역화 후에 지속적으로 증가하고 6주차에 최대 수준에 도달한 후 천천히 1차 이상으로 감소함을 보여주었습니다.{{ 모니터링 기간 동안 20}}4. 다양한 투여군은 모니터링 기간 동안 유사한 항체 역가 프로파일을 공유했으며, 6주차에는 비슷한 높은 중화 역가를 보였습니다. tgE의 면역원성을 평가하고 보드카와 비교했습니다. 마우스에서 절반 유효 용량(ED5{24}})을 혈청전환의 척도로 사용했으며, ED50가 낮을수록 면역원성이 더 우수하다는 것을 나타냅니다. Balb/c 마우스를 그룹으로 분리하고 알루미늄 보조제 tgE(1, 0.5, 0.25, {{50}}.125, {{ 54}}.0625 또는 0.03125 ug; n{{30}}) 또는 vOka 백신(1,000, 500, 250, 125 또는 62.5 pfu; n=6) 연속 희석. 4주 후에 혈청을 수집하고 ELISA를 사용하여 테스트했습니다. 혈청전환은 Reed and Muench 방법에 따라 분석되었습니다(그림 5C). 연령 그룹에서 생쥐의 혈청 전환율은 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625 및 0.03125 ug 용량에서 각각 83%, 100%, 100%, 100%, 50% 및 17%였습니다. 보드카 그룹에서 생쥐는 1,000, 500, 250, 125 또는 62.5 pfu 용량에서 각각 67%, 50%, 33%, 17% 및 0%의 낮은 혈청 전환율을 보였습니다. ED50 값은 tgE의 경우 0.063 ug, vOka의 경우 449.425 pfu였으며, 이는 0.3 ug의 더 낮은 용량에서 tgE의 면역원성이 vOka가 포함된 수두 백신의 단일 용량(보통 2,{78} } 복용량 당 pfu).

그림 2 tgE 및 rgE 단백질의 특성 분석. A, 정제된 tgE의 HPSEC 프로파일. gE의 머무름 시간이 표시됩니다. B, 정제된 tgE 단백질의 침강 속도 분석. tgE의 침강 계수 및 분자량은 c(s) 및 c(M) 방법에 의해 독립적으로 결정되었습니다. (A)와 (B)에서 tgE는 검은색으로, 빨간색은 파란색으로 표시됩니다. C, 정제된 tgE 및 rgE 단백질의 시차 주사 열량측정 프로파일.

그림 3 mAbs에 대한 tgE 및 rgE의 반응성. mAb는 연속 희석되었으며 ELISA 분석에서 코팅된 tgE 또는 rgE 단백질과 반응했습니다. HRP-표지된 항-마우스 항체를 사용하여 반응을 검출하였다. 각 희석에 대해 동일한 플레이트에서 중복 웰을 측정했습니다. GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 시그모이드 추세 피팅으로 EC50 값을 계산했습니다.

그림 4 3회 용량 면역화 1주 후 BALB/c 마우스에서 테스트한 tgE 및 rgE의 면역원성. A, 다양한 보조제로 제형화된 tgE 및 rgE에 대한 마우스에서의 항체 생산. B, 다양한 보조제로 제제화된 tgE 및 rgE에 대한 마우스의 중화 항체 역가. C 및 D, tgE 또는 rgE 백신에 의해 유도된 gE 특이적 IFN- 및 IL{4}} 반응의 평가.

그림 5 BALB/c 마우스에서 알루미늄 제제 tgE 백신의 면역원성 테스트. A 및 B, tgE/Al-001의 항체 지속성 및 중화 항체 반응. 역가는 최대 16주 동안 모니터링되었습니다. 알루미늄 제제 tgE 및 보드카에 대한 마우스의 C, ED50.

Shingrix와 비교한 tgE 대상포진 백신 후보의 평가

당사의 tgE 백신과 Shingrix의 면역원성을 비교하기 위해 동결건조된 tgE 단백질을 Shingrix 면역보조제 AS01B와 함께 제제화했습니다. C57BL/6 마우스는 0주차와 4주차에 경골 근육에 2회 용량의 tgE/AS01B 또는 Shingrix를 근육 내로 면역화했습니다. 첫 번째 면역화 후 항체 수준은 Shingrix를 사용한 면역화가 높은 수준의 항-gE 항체를 유도하기에 충분하다는 것을 시사했습니다. tgE/AS01B에 의해 생성된 것보다 상당히 높으며; 그러나 두 번째 면역화 후에는 두 그룹 간의 항체 생산에 큰 차이가 없었습니다(그림 6A). 중화항체 수준은 tgE/AS01B의 단회 투여로 싱그릭스에 비해 현저히 낮은 수준의 중화항체가 생성되는 것으로 나타났다. 그러나 다시 추가 면역을 실시한 후에도 두 그룹 간의 중화 항체 생산 측면에서 유의미한 차이를 볼 수 없었습니다(그림 6B). 면역화가 CMI에 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위해 ELISPOT(Enzyme-Linked Immunosorbent Spot) 분석 및 세포내 사이토카인 염색을 사용하여 1차 및 2차 면역 후 gE 특이적 IFN- 및 IL{14}} 수준을 검출했습니다. tgE/AS01B 면역화는 Shingrix의 단일 투여와 비교하여 낮은 체액성 면역 반응을 유발했지만 IFN{17}} 및 IL{18}}생성 비장 세포 유도 측면에서는 비슷한 효능을 보여주었습니다(그림 6C). 실제로 2차 면역 후 tgE/AS01B 군에서는 식염수 대조군과 비교하여 유의미한 수의 gE 특이적 사이토카인 생산 세포가 검출되었으며, 이는 Shingrix 군과 동등하거나 그 이상 수준이었다(Fig. 6D). ). 비슷한 비율의 IFN- -발현 CD4+ T 세포(그림 6E), IL-2-발현 CD4+ T의 관찰과 함께 유세포 분석에서도 유사한 결과가 관찰되었습니다. 단일 또는 추가 용량 면역화와 관계없이 tgE/AS01B- 및 Shingrix 면역화된 마우스 사이의 세포(그림 6F) 및 IFN- -CD8+ T 세포(그림 6G). 이러한 결과는 박테리아 발현 시스템에서 유래된 tgE 단백질이 적절한 보조제와 함께 제제화될 때 체액성 및 세포성 면역 반응을 모두 유도할 수 있으며 따라서 VZV에 대한 백신 생성을 위한 후보 항원으로 간주될 수 있음을 입증합니다.

그림 6 C57BL/6 마우스에서 tgE의 면역원성. 50 μL AS01B 보조제와 함께 제형화된 5 ug tgE의 용량을 투여했습니다. 이는 싱그릭스 백신 용량의 1/10 수준이다. 면역화는 0주차와 4주차에 수행되었습니다. A, Shingrix와 비교하여 tgE/AS01B 백신에 의해 유도된 항체 생산의 비교. 혈청 역가는 rgE 코팅 플레이트를 사용하여 ELISA 분석으로 결정되었습니다. B, tgE/AS01B 백신 또는 Shingrix 백신 접종 후 vOka에 대한 중화 항체 반응의 비교. 2주차(왼쪽 패널) 및 6주차(오른쪽 패널)의 항혈청 중화 역가는 혈청 희석률의 역수로 표시되어 50% 억제를 초래합니다. C, 2주차에 tgE/AS01B 백신 또는 Shingrix에 의해 유도된 gE 특이적 IFN- 및 IL-2 반응의 평가. IFN- - 및 IL-2- 생산 비장세포의 수는 gE 펩타이드 풀로 재자극한 후 ELISPOT 분석. D, 8주차에 tgE/AS01B 백신 또는 Shingrix에 의해 유도된 gE-특이적 IFN- 및 IL{25}} 반응의 평가. IFN- - 및 IL-2- 생산 비장세포의 수는 gE 펩타이드 풀로 재자극한 후 ELISPOT 분석. E–G, gE 특이적 사이토카인 발현 CD4+ 및 CD8+ 세포에 대한 유세포 분석 분석. IFN{34}}생성 CD4+ T 세포, IL-2-생성 CD{37}} T 세포, IFN- -생성 CD8+ T 세포의 비율 비장 세포 중 세포가 결정되었습니다.

논의

VZV gE는 자연 수두 감염 중 및 VZV Oka 백신 접종 후 체액성 및 세포 매개성 면역 반응의 주요 표적입니다. Shingrix(GSK)는 CHO 세포에서 발현되는 VZV gE와 리포솜 기반 면역보강제 AS01B로 구성된 재조합 서브유닛 백신입니다. 다른 연구에서는 CHO에서 생성된 gE 단백질이나 새로운 보조제로 제제화된 곤충 세포를 사용하여 HZ에 대한 하위 단위 백신을 조사하려고 했습니다(Cao et al., 2021; Lee et al., 2020; Luan et al., 2022a, Luan et al., 2022b; Wang 외, 2021; Wui 외, 2019; Wui 외, 2021). 여기에서 우리는 gE 단백질이 대장균에서 가용성으로 발현되고 정제된 다음, 강력한 중화 역가뿐만 아니라 강력한 CMI 반응을 유도하기 위해 적절한 보조제와 함께 하위 단위 백신 후보로 제제화될 수 있음을 조사하고 보여주었습니다.

시스탄체 식물의 면역 체계 증가

발현 시스템으로서의 E. coli는 빠른 세포 성장 속도, 저렴한 배양 조건, 재조합 단백질 생산을 위한 효율적이고 다양한 도구 등 여러 가지 장점을 제공합니다. 헤르페스 바이러스 관련 항원 연구는 대장균 기반 발현 시스템을 사용하여 여러 가지 성공을 거두었습니다. 중화 선형 에피토프 gE(aa 121-135)는 B형 간염 바이러스 코어(HBc) 단백질의 149 aa와 융합되어 마우스에서 VZV 특이적 중화 항체를 유도할 수 있는 키메라 VLP를 생성했습니다(Zhu et al., 2016). 또 다른 연구에서는 gE 항혈청 생성을 위해 GST 융합 태그를 사용하여 유인원 수두 바이러스(SVV)의 상동 gE 단백질을 E. coli에서 발현시켰습니다(Gray et al., 2001). 아직까지 대장균으로부터 정제된 융합 태그가 없는 VZV gE 단백질이 백신 후보로 보고된 바는 없다.

gE는 세 가지 영역, 즉 신호 펩타이드(aa 1~30)가 있는 544-aa 친수성 엑토도메인, 17-aa 소수성 막횡단 영역 및 62-aa 세포질 꼬리 영역으로 구성됩니다. 우리는 gE 엑토도메인의 N- 또는 C-말단 영역에서 서로 다른 잘림이 있는 여러 후보 분자를 조사한 결과 E. coli에서 이러한 단백질의 외인성 발현이 잘린 부분을 사용하는 것이 가장 좋다는 것을 발견했습니다(데이터는 표시되지 않음). 융합 태그가 없는 손상되지 않은 gE 엑토도메인은 E. coli에 의해 발현될 때 봉입체를 형성하는 경향이 있으며 정제가 어렵습니다. 테스트된 절단 후보 중 gE(aa 31-358) 단백질은 정제의 어려움이 거의 없이 높은 가용성 발현을 보였을 뿐만 아니라 고순도 및 높은 균질성을 나타냈습니다(그림 1). 따라서 이 절단 구조는 이상적인 후보 백신으로 간주되었습니다. 항원. 이러한 절단 전략은 단백질의 특성, 특히 항원성에 잠재적인 영향을 미칠 수 있습니다. 우리는 이전에 곤충 세포에서 재조합 gE를 발현하고 이 구조물을 정제하여 BALB/c 마우스를 면역화하여 에피토프 분석을 위한 70 gE 단일클론 항체를 얻었습니다(Liu et al., 2015). 분석을 통해 우리는 aa 1-194를 면역 우세 영역으로 식별했습니다 (데이터는 표시되지 않음). 유사한 결과가 다른 곳에서도 얻어졌는데, aa 109-123 및 160-316 영역을 가리키는 gE 특이적 mAb는 변이체 분리물 사이에서 항체의 안정적인 항체 결합을 담당하는 영역입니다(Vafai, 1994). 재조합 하이브리드 gE 단편-VLP를 사용한 또 다른 연구에서 저자는 잔기 1-134가 gE 단백질의 가장 항원성이 높은 영역으로 확인되었으며 여러 시스테인 잔기를 포함하는 gE의 C-말단(잔기 303-623)이 입자를 생성하지 못함을 보여주었습니다. 효모에서(Fowler et al., 1995) 이는 gE의 이종 발현이 항원성뿐만 아니라 발현의 용이성도 고려해야 함을 시사합니다. 여기서 우리는 항원성의 감소를 최소화하면서 효율적인 가용성 발현을 위해 gE 단백질의 길이를 최적화했습니다. tgE는 곤충 세포에서 생산된 rgE와 마찬가지로 그림 3의 대부분의 항체와 유사한 반응성을 나타냈으며, 이는 주요 에피토프가 대장균에서 정제된 tgE 단백질에 잘 보존되어 있음을 시사합니다. 그러나 한 연구에서는 Shingrix 백신 기증자가 인식하는 면역우세 CD{28}} T 세포 에피토프가 gE 단백질 전체에 분산되어 있음을 보여주었습니다(Voic et al., 2020). 우리 연구에서 tgE의 면역원성은 항원이 AS01B 보조제와 결합되었을 때 Shingrix의 CHO 세포에서 유래된 gE에서 발견된 것과 동일했으며, 그림 5에 표시된 것처럼 유사한 효율적인 체액 반응 및 CMI 반응을 보였습니다. 이러한 결과는 잘린 gE가 원핵 시스템에서 유래된 gE 엑토도메인은 항원성 측면에서 진핵 시스템의 온전한 gE 엑토도메인만큼 우수했습니다.

cistanche tubeulosa - 면역 체계를 향상시킵니다.

서로 다른 발현 시스템에서 파생된 gE 단백질 간에는 상당한 차이가 있습니다. 가장 두드러진 차이점은 번역 후 변형, 특히 글리코실화에서 나타납니다. 막 당단백질의 O-연결 글리칸은 바이러스 글리코펩티드 에피토프의 T 세포 및 항체 인식 측면에서 관련성이 있으며, 이 인식은 하위 단위 백신을 사용하여 바이러스에 대한 면역 보호를 중재하려는 시도에서 높은 생물의학적 중요성을 가질 가능성이 있습니다. CHO-K1 세포에서 생산된 gE의 글리칸을 제거하면 VZV 양성 혈청과의 반응성이 17% 감소했습니다. 대조적으로, O-글리코실화는 B 세포 에피토프의 면역반응성을 방해할 수 있습니다. 일부 중요한 에피토프는 추가적인 O-연결 글리칸에 의해 차단됩니다(Nordén et al., 2019). 우리 연구에서 E. coli에서 생성된 tgE는 면역반응성과 면역원성 측면에서 곤충 세포 유래 rgE와 마찬가지로 행동하는 것으로 보이며, 이는 "네이키드" tgE 단백질이 백신 후보로서 가능성이 있음을 시사합니다. tgE를 항원으로 하는 백신은 바이러스 잠복기의 위험이 없는 하위 단위 수두 백신으로서의 잠재력을 나타내는 높은 IgG 역가뿐만 아니라 대상포진 백신으로서의 잠재력을 암시하는 높은 CMI도 유도할 가능성이 높습니다. 전반적으로, 본 연구의 박테리아 발현 시스템에서 유래된 gE 항원은 VZV 백신 개발을 위한 훨씬 더 경제적인 전략을 제공합니다.

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