낮은 농도의 Paraquat는 세포외 신호 조절 키나아제 1/2, 단백질 키나아제 B 및 C-Jun N-말단 키나아제 1/2 경로의 조기 활성화를 유도합니다: Paraquat 유도 세포 사멸에서 C-Jun N-말단 키나아제의 역할

연락처: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 이메일:audrey.hu@wecistanche.com

Mireia Niso-Santano, Jose´ M. Mora´n, Lourdes Garcı´a-Rubio, Ana Go´mez-Martı´n, Rosa A. Gonza´lez-Polo, Germa´n Soler,§ 및 Jose´ M. Fuentes

추상적인:

Paraquat는 입증된 신경독성과 유사한 임상 증후군을 유발하는 잘 알려진 신경독소인 1-메틸{1}}페닐피리디늄(MPP 플러스)과 강력한 구조적 유사성으로 인해 파킨슨병을 유발할 수 있는 잠재적 위험이 있는 제초제입니다. 에게파킨슨 병(PD). 그러나 현재로서는 모든 세포 시스템에서 파라콰트에 의해 활성화되는 신호 전달 경로에 대해 알려진 바가 거의 없습니다. 이 연구에서 우리는 E18 세포에서 세포외 신호 조절 키나제 1 및 2(ERK1/2), c-Jun N-말단 키나제(JNK) 및 단백질 키나제 B(PKB) 활성화에 대한 파라콰트의 효과를 조사했습니다. 낮은 농도의 파라콰트는 ERK1/2, JNK1/2 및 PKB 인산화의 매우 초기 증가를 자극했습니다. 포스파티딜이노시톨 3-키나제(PI{13}}K) 억제제 wortmannin 및 LY 294002(2-({16}}모르폴리닐)-8-페닐{18}}H{{ 19}}benzopyran{20}}one)은 초기 파라콰트 유도 PKB 인산화 증가를 억제했습니다. 또한 ERK1/2 활성화의 초기 파라콰트 매개 증가는 미토겐 활성화 단백질 키나제 키나제 1(MEK1) 억제제 PD 98059(2#-아미노{31}}#-메톡시플플라본)에 민감한 반면 JNK1/2 반응은 JNK1/2 억제제 SP 600125(anthra[1-9-cd]pyrazol-6}(2H)-one)에 의해 차단됩니다. Wortmannin, LY 294002 또는 PD 98059를 사용한 전처리는 E18 세포에서 파라콰트 세포 사멸에 영향을 미치지 않았습니다. 대조적으로, SP 600125는 E18 세포에서 파라콰트 유발 세포 사멸을 유의하게 감소시켰다. 결론적으로, 우리는 낮은 농도의 파라콰트가 E18 세포에서 ERK1/2, JNK1/2 및 PKB 인산화의 강력한 초기 증가를 자극한다는 것을 보여주었습니다. 또한, 제시된 데이터는 JNK1/2 경로의 억제가 파라콰트에 의한 세포 사멸로부터 E18 세포를 보호하고 JNK1/2의 조기 활성화 억제가 PD 치료에서 잠재적인 전략을 구성할 수 있다는 사실을 뒷받침함을 시사합니다. 핵심어: paraquat; 낮은 농도; JNK; 세포 사멸; 파킨슨병.

항파킨슨병 약초:시스탄체

소개

파킨슨병(PD)루이소체(Lewy body)로 알려진 세포질 내 봉입체와 함께 흑질아세포(sub-Constantia nigra)에서 도파민성 뉴런의 죽음을 특징으로 하는 신경퇴행성 장애입니다(Olanow and Tatton, 1999). 파킨슨병 환자의 5-10%만이 상염색체 우성 유전 방식을 가진 이 질병의 가족 형태를 가지고 있습니다(Gasser, 2001). 유전적 요인은 젊은 발병 환자에서 중요하지만 더 흔한 산발성 PD에서는 중요한 역할을 하지 않을 것 같습니다. 대조적으로, 역학 연구는 PD 발병 위험을 증가시키는 몇 가지 환경 요인을 나타냅니다.파킨슨 병). 여기에는 살충제, 제초제, 산업용 화학 물질, 농업 및 농촌 환경에서의 생활이 포함됩니다(Cory-Slechta et al., 2005; Gasser, 2001; Landrigan et al., 2005; Tanner 및 BenShlomo, 1999). PD의 환경적 요인을 뒷받침하는 가장 설득력 있는 주장은 MPTP(1-메틸{6}}페닐{7}},2,3,{10}} 테트라키-드로피리딘). 이 중추 신경계 독소는 PD와 임상 및 해부학적으로 유사한 증후군을 생성합니다(Kopin and Markey, 1988; Langston et al., 1983). 이러한 의미에서 널리 사용되는 제초제 paraquat(1,1#-dimethyl{17}},4#-bypiridinium)는 MPTP의 활성 대사산물인 MPPþ와 구조적 상동성을 기반으로 추정 위험 인자로 제안되었습니다. Tanner와 Langston, 1990), 파킨슨병에 대한 노출과 약물 노출과 관련이 있다는 보고(Hertzman et al., 1990; Hubble et al., 1993; Jimenez-Jimenezet al., 1992; Liou et al., 1997; Wang et al., 1997) 알., 1992). 그러나 MPPþ 세포 사멸과 관련된 신호 전달 경로는 잘 알려져 있지만(Halvorsen et al., 2002; Gomez-Santos et al., 2002; Gonzalez-Polo et al., 2003) 활성화된 신호 경로에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. (Cheng et al., 2003; Chun et al., 2001; Peng et al., 2004) 어쨌든, 낮은 농도의 파라콰트에 노출된 후 관찰된 초기 사건에 대한 연구는 없습니다.

MPPþ 및 paraquat를 포함한 여러 자극은 세포 사멸 및 세포 생존 경로와 밀접하게 관련된 세포 내 신호 전달 계단식 배열을 활성화할 수 있습니다. 예를 들어, MPPþ(Gomez-Santos et al., 2002; Halvorsen et al., 2002)는 미토겐 활성화 단백질 키나제(MAPK) 계열과 단백질 키나제 B(PKB)의 구성원을 활성화합니다. TheMAPK 계열 구성원은 MPPþ 또는 paraquat에 의해 활성화되며 세포외 신호 조절 키나제 1 및 2(ERK1/2), c-Jun N-말단 키나제(JNK1 및 JNK2) 및 p38 MAPK가 포함됩니다. 일반적으로 ERK1/2 PKB 활성화는 항-세포자멸사 신호 전달 경로를 활성화함으로써 세포 생존을 촉진하는 반면, JNK1/2 및 p38 MAPK의 활성화는 신경 세포 사멸과 관련이 있습니다(Harper and LoGrasso, 2001; Shin et al., 2001; Xia et al., 1995). . 포스파티딜이노시톨 3-키나제(PI{24}}K)/PKB 경로의 활성화는 뉴런 생존에 관여합니다(Shin et al., 2001). 특히, JNK1/2 경로의 활성화는 MPP 및 파라콰트 독성(Cassarino et al., 2000; Halvorsen et al., 2002; Peng et al., 2004)과 결과적으로 영향을 받는 세포 과정에서 중요한 역할을 할 수 있습니다. PD(파킨슨 병).

허브 시스탄치: 항파킨슨병

재료 및 방법

세포주 및 배양.

자발적으로 불멸화된 쥐의 뇌 신경아세포인 E18 세포가 이 연구에서 사용되었습니다. E18 세포주는 18-일 된 태아 쥐 대뇌 피질의 배양물로부터 자발적 불멸화에 의해 얻었고 Dr. A. Mun~oz(Instituto de InvestigacionesBiome'dicas, CSIC, Madrid, Spain)가 친절하게 제공했습니다. . E18 세포는 NF 68 및 원시 신경 마커 네스틴을 발현하지만 성상교세포 마커인 신경교 섬유성 산성 단백질이 없는 원시 신경아세포를 나타냅니다. 디부티릴-cAMP로 부분 분화 유도 후, 세포는 NF 145, NF 220 및 뉴런 특이적 에놀라제(Mun~oz, 개인 통신)와 같은 추가 뉴런 마커를 발현합니다. 세포를 Hanks' F{10}}(Hyclone, Brevieres, France)에서 성장시키고 10% FCS(Hyclone), 스트렙토마이신(100mg/ml) 및 페니실린(100U/ml)을 보충했습니다. 세포를 75-cm2 조직 배양 플라스크(TPP, Trasadingen, Switzerland)에 5 3 10 5로 시딩하고 5% CO2/95% 공기 분위기에서 37C에서 배양했습니다. 트립신-EDTA 용액(Hyclone)을 사용한 트립신 처리에 의해 일주일에 한 번 배양을 계대하였다.

세포 치료.

75-cm2 조직 배양 플라스크의 융합 세포(~ 80%)를 트립신 처리하고 5 3104 cells/cm2의 농도로 조직 배양 접시에 접종했습니다. 24시간 후, 배지를 흡인하고 새로운 배지 단독 또는 지시된 농도의 파라콰트를 함유하는 배지로 교체하였다. 추가 실험에서 다양한 농도의 키나제 억제제(LY 294002, wortmannin, SP 600125 및 PD(파킨슨 병)98059, 모두 Tocris, Bristol, United Kingdom) 파라콰트 노출 30분 전에 추가되었습니다. 키나제 억제제가 디메틸 설폭사이드에 용해됨에 따라 사용된 최고 농도(0.2% vol/vol)로 대조군을 만들었습니다. Dimethyl sulfoxide 첨가는 대조군 플레이트의 생존율에 영향을 미치지 않았습니다.

세포 생존력 분석.

세포 생존율은 colorimetricMTT 분석에 의해 결정되었습니다(Mosmann, 1983). 살아있는 세포에서 미토콘드리아 효소 숙시네이트 탈수소효소는 MTT를 57{6}} nm에서 빛을 흡수하는 포르마잔 염료로 대사할 수 있습니다. 이러한 실험에는 24-웰 테스트 플레이트가 사용되었습니다. 각 처리가 끝날 때마다 PBS에서 5mg/ml 농도로 제조된 MTT 1{8}}0 ㎕를 각 플레이트에 첨가했습니다. 3시간 동안 배양한 후, 배지를 경사분리하고, formazan 침전물을 산성 이소프로판올(절대 이소프로판올 중 0.04-0.1N HCl)로 용해시켰다. 변환된 염료의 흡광도는 630-690 nm에서 배경 빼기로 570 nm의 파장에서 측정되었습니다. 처리되지 않은 배양물의 흡광도는 100%로 설정되었습니다.

MTT 분석으로 얻은 결과를 확인하기 위해 제조사의 지침에 따라 비색 LDH 분석 키트(Roche, Indianapolis, IN)를 사용하여 세포질 효소 젖산 탈수소효소(LDH)의 배양 배지로의 방출을 측정하여 세포 사멸도 평가했습니다. . LDH 누출은 웰당 총 활성에 대한 배양 배지의 LDH 활성 비율(3100)로 정의되었습니다. 두 가지 방법을 사용하여 비교 가능한 데이터를 얻었습니다.

세포 추출물의 제조 및 웨스턴 블롯 분석.

실험 처리 후, 세포({0}}mm 접시에서 배양)를 차가운 PBS로 두 번 헹구고 스크랩으로 제거한 다음 4C에서 5분 동안 900 3g에서 원심분리했습니다. 세포를 완충액에서 용해했습니다. 50mM HEPES, pH 7.5, 300mMNaCl, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 5mM MgCl2, 25mM NaF, 1mMNa3VO4 및 프로테아제 억제제 칵테일(Sigma, St Louis, MO)을 포함합니다. 세포를 4C에서 5분 동안 13.}g에서 원심분리했습니다. 상청액은 웨스턴 블롯으로 분석할 때까지 80C에서 보관했습니다. 단백질 농도는 BSA를 표준으로 사용하여 Bradford(1976)에 따라 측정되었습니다.

동일한 양의 단백질(조건당 1{12}}LG)을 12% SDS 겔 전기영동에서 분리하고 기존의 부분적으로 변형된 방법에 따라 PVDF 막으로 옮겼습니다(Fuentes et al., 2000). 간단히 말해서, Mini Trans-Blot Cell 장치(Bio-Rad, Hercules, CA)를 사용하여 단백질을 PVDF 막으로 옮겼습니다(60분 동안 250mA). 면역검출 절차에는 10% 무지방 분유가 포함된 TTBS(10mM Tris/HCl, pH 7.5, 150mM NaCl 및 0.2% Tween{14}})를 사용한 멤브레인(실온에서 60분)의 이동 및 차단이 포함됩니다. 그런 다음 멤브레인을 TTBS - 10% 무지방 분유 또는 5% BSA에서 토끼 다클론 1차 항체(모두 Cell Signalling, Beverly, MA, 희석 1:1000)와 함께 실온에서 60분 동안 배양했습니다. 세척 후(TTBS로 2분 5-), 막을 퍼옥시다제 결합 항토끼 이차 항체(10% 무지방 분유가 포함된 TTBS에서 1:5000)와 함께 배양(실온에서 60분)했습니다. 세척 후(2개의 5-min 기간 및 1{30}}min 기간 동안), 결합된 항체의 검출은 ECL-plus 시약(Amersham Biosciences, Orsay, France)을 사용하여 화학발광에 의해 가시화되었고 Quantity에 의해 분석되었습니다. 하나의 소프트웨어(Bio-Rad). 10% 무지방 분유가 포함된 TTBS에 1:2500으로 희석된 토끼 다클론 항체(Sigma)를 사용하여 대조군으로 액틴 함량을 분석했습니다.

통계 분석.

각 실험은 개별 실험의 결과 사이에 만족스러운 상관 관계를 가지고 최소 3번 반복되었습니다. 표시된 데이터는 대표적인 실험의 데이터입니다. 각 그룹은 평균 3~4개의 문화 요리였습니다. 모든 데이터는 평균 ±SEM으로 표시됩니다. 결과는 ANOVA로 분석되었습니다. 0.05보다 작은 p 값은 유의미한 것으로 간주되었습니다.

항파킨슨병:시탕슈 추출물

결과

E18 세포에서 파라콰트의 세포독성 효과

이전에 보고된 바와 같이(Cappelletti et al., 1998; Chun et al., 2001; Gonzalez-Polo et al., 2004), 몇몇 세포주는 파라콰트의 독성 특성에 민감합니다. 파라콰트에 노출되면 세포 생존력이 용량 의존적으로 감소했습니다. (그림 1.) 이 연구에서 24시간 동안 25lM 파라콰트로 처리된 E18 세포는 세포 생존력의 50% 손실을 나타냈습니다. 570 nm에서 빛을 흡수하는 포르마잔 염료로 MTT로의 변환을 측정하여 세포 생존율을 평가했습니다. 이 분석은 E18 세포(Donaire et al., 2005; Garcia-Roman et al., 2001)와 파라콰트(Chun et al., 2001; Gonzalez)를 포함한 다양한 손상을 포함한 여러 세포주에서 세포 사멸을 모니터링하는 데 광범위하게 사용됩니다. -Polo et al., 2004).

E18 세포에서 ERK1/2의 파라콰트 유도 활성화

파라콰트로 처리된 E18 세포에서 ERK1/2 활성화의 증가는 phosphospecific ERK1/2(Thr202/Tyr204) 항체를 사용한 웨스턴 블로팅에 의해 모니터링되었습니다. 25lM 파라콰트를 사용한 E18신경모세포의 노출은 ERK1/2(44/42kDa)의 인산화(Thr202/Tyr204) 상태의 현저한 증가를 생성했습니다(그림 2A). 인산화의 최대 증가는 5분 후에 발생했으며, 그 후 인산화 수준은 기본 수준에 가깝게 천천히 감소합니다. 또한, 파라콰트에 의해 유도된 ERK1/2 인산화의 증가는 농도 의존적이지 않았습니다(그림 2B). MEK1 억제제 PD 전처리(파킨슨 병)98059(50lM; Dudley et al., 1995)는 ERK1/2 인산화의 파라콰트 유도 증가를 완전히 억제했습니다(그림 3).

E18 세포에서 파라콰트 유도 PKB 활성화

E18 세포에서 PKB 활성화는 phospho-specific (Ser473) 항체를 사용하여 Western blotting에 의해 감지되었습니다. 25lM 파라콰트로 E18 세포를 자극하면 PKB 인산화가 현저하게 증가합니다(그림 4A). 이 증가는 인산화 수준이 기본 수준 근처로 천천히 감소한 후 ERK1/2 인산화와 유사한 20분 후에 발생합니다(그림 4A). 더욱이, 파라콰트 매개 PKB 인산화 증가는 농도 의존적이었고 파라콰트 25lM에서 최대치였다(그림 4A). PI{14}}K는 PKB 활성화에 필요하므로 E18 세포에서 파라콰트 유도 PKB 활성화에서 PI{15}}K의 역할은 PI{18}}K 억제제 wortmannin 및 LY 294002.

PKB 인산화의 Paraquat 매개 증가는 100nM wortmannin 및 30lM LY 294002로 E18 세포를 전처리(30분)한 후 완전히 차단되었습니다(그림 5). 이러한 관찰은 PI-3K 의존성 경로가 E18 세포에서 파라콰트 유도 PKB 인산화 증가를 매개한다는 것을 보여줍니다.

E18 세포에서 JNK1/2의 Paraquat 유도 활성화

이전 연구에서는 파라콰트가 뉴런(Chun et al., 2001; Peng et al., 2004)과 비뉴런 세포(Bennett et al., 2001; Cheng et al., 2003)에서 JNK1/2를 활성화시키는 것으로 나타났습니다. 그러나 사용된 농도는 이 작업에 사용된 농도보다 훨씬 높습니다. 또한 JNK1/2 활성화를 시각화하기 위해 선택한 시간도 더 깁니다. E18 세포에서 JNK1/2 활성화는 phosphospecific JNK(Thr183/Tyr185) 항체를 사용한 웨스턴 블로팅에 의해 검출되었습니다. 251M 파라콰트로 E18 세포를 자극하면 JNK(46/54 kDa) 인산화가 현저하고 초기에 증가했습니다(그림 6A). 이러한 증가는 인산화 수준이 기저 수준으로 감소한 후 5분 후에 최대였습니다(그림 6A). 그러나, JNK1/2 인산화의 파라쿼트 매개 증가는 농도 의존적이지 않았다(도 6B). JNK1/2 인산화의 Paraquat 매개 증가는 JNK1/2 억제제 SP 600125(10lM; 그림 7; Bennett et al., 2001)에 민감했습니다. 마지막으로, 파라콰트(25lM)는 동일한 시간 경과 실험에서 E18 세포에서 p38 MAPK 인산화의 측정 가능한 증가를 자극하지 않았습니다(데이터는 표시되지 않음). 이러한 실험은 phosphospecific p38 MAPK(Thr180/Tyr182) 항체를 사용하여 수행되었습니다.

파라콰트 및 키나제 억제제로 E18 세포 처리 후 세포 생존율 측정

파라콰트는 모든 경우에 E18 세포에서 초기 활성화 ERK1/2, PKB 및 JNK1/2를 생성한다는 것을 보여주었고, 우리는 후속적으로 약리학적 특이성을 사용하여 낮은 농도의 파라콰트에 의해 유도된 세포 사멸에서 이러한 키나제 경로의 빠른 활성화 역할을 결정했습니다. 억제제. 그림 1에서 볼 수 있듯이 E18 세포를 25lM 파라콰트에 노출시키면 세포 생존율이 크게 감소했습니다(약 50%). 파라콰트 유도 세포 사멸에서 ERK1/2, PKB 및 JNK1/2의 역할을 조사하기 위해 E18 세포를 다음 키나제 억제제와 함께 30분 동안 사전 인큐베이션했습니다. PD(파킨슨 병)98059(50lM; MEK1/2 억제제), LY 294002(30lM; PI{6}}K 억제제), 워트만닌(100nM; PI{8}}K 억제제) 및 SP 600125(10lM; JNK1/2 억제제). 그림 8(표 1에 요약되어 있음)에서 볼 수 있듯이 wortmannin, LY 294002 및 PD 98059는 25lM paraquat에 의해 유도된 세포 생존력의 손실에 큰 영향을 미치지 않았습니다.

논의

최근 다양한 연구에서 농약과 같은 환경적 신경독이 비유전성 파킨슨병의 발병과 관련이 있을 수 있다는 가능성에 대한 관심이 높아지고 있습니다.(파킨슨 병)(Cory Slechta et al., 2005; Landrigan et al., 2005; Norris et al., 2004; Ritz and Yu, 2000; Sherer et al., 2001). PQ는 MPPþ와 유사한 화학 구조와 질병의 발병률과 사용된 PQ의 양 사이의 강한 상관 관계 때문에 PD와 관련된 가능한 제초제 중 하나입니다(Lanska, 1997; Liou et al., 1997; Ritz 및 유, 2000). 그러나 낮은 수준의 파라콰트에 대한 노출 부족으로 발생하는 신경 독성의 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았습니다. 어쨌든 전작들은 파라콰트 전시 이후 입증된 초기 과정에 관심이 없다. 본 연구의 주요 발견은 낮은 농도의 paraquatrapidly에 노출된 E18신경모세포가 일반적으로 항세포자멸사 신호전달 경로 PI-3K/PKB 및 MEK ERK와 또한 일반적으로 세포자멸사 JNK1/ 2 맵. 대조적으로, 파라콰트는 p38 MAPK 인산화의 시간 또는 농도 의존적인 측정 가능한 증가를 자극하지 않았습니다. 위에서 언급했듯이 우리는 낮은 농도의 파라콰트를 사용했습니다. 파라콰트가 하전된 분자이기 때문에 뇌에 들어갈 수 있는지 여부에 대한 관련성은 논쟁의 여지가 있습니다. 그러나 최근 발견(Shimizu et al., 2001)에 따르면 파라콰트는 중성 아미노산 펌프를 사용하여 뇌에 들어갈 수 있습니다. 이 연구에서 제시된 발견은 세포 사멸 과정에 연루된 NK를 포함한 여러 신호 경로를 빠르게 자극하기 위해 세포에서 낮은 농도의 파라콰트만이 필요하다는 것을 나타냅니다. 파라콰트의 낮은 농도로 인한 이러한 초기 활성화는 본 연구에서 처음으로 제안되었습니다.

파라콰트에 의해 유도된 PKB 또는 ERK1/2의 인산화 수준의 변화를 연구하는 데 거의 관심을 기울이지 않았습니다(Cheng et al., 2003; Peng et al., 2004). 어쨌든 이전 보고서(Peng et al., 2004)는 노출 12-18시간 후 ERK의 인산화 정도를 측정하는 비교적 높은 농도의 파라콰트(400lM)를 사용합니다. 이 때 그들은 p-ERK 수준의 변화를 관찰하지 못했습니다. 우리 작업에서 우리는 ERK1/2의 초기(5-10분) 및 중요한 활성화를 감지했습니다(그림 2A). 이 활성화는 기초 수준으로 천천히 감소합니다. 우리의 조건에서 인산화된 ERK1/2의 수준(12-18시간 후)은 대조군과 동일하며 Peng et al. (2004). 이 활성화는 농도 의존적이지 않으며, 이는 매우 낮은 농도의 파라콰트로 ERK의 강력한 자극이 얻어지고 유지된다는 결과를 나타냅니다. 파라콰트 노출 후 인산화된 PKB 수준의 변화는 아직 설명되지 않았습니다. 그림 4에서 결과는 시간과 농도에 따라 달라지며 25lM paraquat로 20-분 노출 후 최대 효과를 나타냄을 보여줍니다. 즉, PKB 인산화의 초기 파라콰트 매개 증가는 ERK1/2에서 관찰된 것과 비슷합니다. 이러한 데이터는 PKB 및 ERK 생존 경로 모두의 인산화 활성화의 초기 증가를 보여줍니다. 파라콰트 유발 세포 사멸에서 PKB 또는 ERK의 조기 활성화에 대한 데이터는 없습니다. 그러나 이전 연구(Halvorsen et al., 2002)는 MPPþ에 노출된 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에서 두 경로 모두에서 유사한 초기 증가를 설명합니다. 이 경우 인산화 수준은 기저 수준으로 감소하지 않습니다. 이러한 데이터는 paraquat와 MPPþ 사이에 이전에 관련된 유사한 구조로 인해 특히 흥미로웠으며, 이는 두 분자의 효과에 관련된 세포 기계의 다른 시작을 나타냅니다.

파라콰트 유도 세포 사멸에 기여하는 신호를 매개하는 JNK1/2경로의 역할에 더 많은 관심을 기울였습니다. 이 연구에서 우리는 파라콰트의 낮은 농도(25lM)가 인산화된 JNK1/2의 상당한 증가를 유발한다는 것을 보여주었습니다(그림 6). PKBor ERK1/2에서 발생하는 것처럼 이 활성화는 시간에 따라 매우 일찍 시작되고(5분) 기본 수준으로 천천히 돌아갑니다. 이전 연구(Cheng et al., 2003; Chun et al., 2001; Peng et al., 2004)는 상대적으로 높은 농도의 파라콰트(400lM에서 [Peng et al., 2004] ~ 800lM [Chunet al., 2001]). 우리의 조건에서 표시된 시간에 JNK1/2의 인산화 정도는 대조군과 비슷합니다. 전반적으로, 이러한 결과는 매우 낮은 농도의 파라콰트에 대한 세포 노출이 PKB, ERK1/2 및 JNK1/2 경로의 조기 활성화를 생성한다는 것을 처음으로 나타냅니다.

파라콰트가 E18 세포에서 초기 PKB, ERK1/2 및 JNK1/2 활성화를 유발한다는 사실을 확인한 후, 우리는 여러 약리학적 억제제를 사용하여 파라콰트 유도 세포 사멸에서 이러한 단백질 키나제 경로의 역할을 조사했습니다. 570 nm에서 빛을 흡수하는 포르마잔 염료로 MTT로의 변환을 측정하여 세포 생존력을 모니터링했습니다. MTT 분석은 MPPþ 또는 paraquat를 포함한 다양한 손상 후 신경 손상을 정확하게 측정하는 데 사용되었습니다(Gonzalez Polo et al., 2003, 2004; Schmuck et al., 2002; Sheng et al., 2002; Storch et al., 2004). ), 세포 사멸을 결정하는 데 가장 많이 사용되는 방법입니다. 도 8에 나타난 바와 같이, 선택적 JNK1/2 억제제 SP 600125로의 전처리는 파라콰트 유발 세포 사멸을 유의하게 감소시켰다. 이 농도의 SP 600125는 JNK1/2의 paraquat 유도 활성화를 완전히 차단했습니다(그림 7). 이러한 데이터는 JNK1/2 경로의 조기 활성화 억제가 파라콰트에 의한 세포 사멸로부터 세포를 보호한다는 것을 시사합니다. 이러한 데이터는 JNK1/2가 파라콰트에 의해 유발된 신경 세포 사멸에 관여한다는 이전 연구(Chun et al., 2001; Peng et al., 2004)와 일치합니다. 그러나 이 연구에서는 이 연구에서 사용된 것보다 15~30배 더 많은 농도의 파라콰트를 사용합니다. 우리는 또한 낮은 농도의 파라콰트가 활성화뿐만 아니라 이 경로의 초기 활성화를 생성할 수 있음을 보여줍니다. SP600125로 관찰된 보호는 또한 JNK1/2 경로가 파라콰트에 의해 유도된 세포 사멸에 관여한다는 것을 나타냅니다. 또한 JNK1/2 억제는 PD 치료의 잠재적 전략으로 설계되었습니다.(파킨슨 병)생체 내 및 시험관 내 여러 모델에서 (Wang et al., 2004).

시스탄치의 신경보호 효과

이전 연구에서는 PKB와 ERKpathways가 모두 신경 생존에 관여하는 것으로 나타났습니다(Guyton et al., 1996; Shin et al., 2001). 이 연구에서 우리는 낮은 농도의 파라콰트가 PKB와 ERK 경로를 조기에 생성하고 자극한다는 것을 보여주었습니다. 이러한 관찰은 파라콰트 유도 PKB 및 ERK 활성화가 파라콰트 유도 세포 사멸로부터 세포를 보호하는 데 관여할 수 있음을 시사합니다. 이 가능성을 조사하기 위해 구조적으로 관련이 없는 PI{4}}K 억제제 wortmannin 및 LY 294002와 ERK1/2 억제제 PD를 사용했습니다.(파킨슨 병)98059. 흥미롭게도, PKB와 ERK 억제는 파라콰트가 있을 때 세포 생존력을 변화시키지 않았으며, 이는 우리의 조건에서 PKB와 ERK 활성화 증가가 E18 세포에서 파라콰트에 의해 유발된 세포 사멸의 생존에 필수적이지 않다는 것을 시사합니다.

파라콰트 신경독성의 메커니즘은 다른 요인들 중에서도 산화 스트레스를 통해 매개된다는 것은 잘 알려져 있습니다(Gonzalez-Polo et al., 2004; Mollace et al., 2003). 이러한 의미에서, 최근 파라콰트 유도 세포 사멸과 관련된 초기 세포자멸사 사건에서 매우 빠른 세포질 산화 스트레스가 설명되었습니다(Gonzalez-Polo et al., 2004). 산화 스트레스가 MAPK 계열(예: ERK1/2 및 JNK1/2) 및 PKB(Kamata 및 Hirata, 1999)의 구성원을 활성화함에 따라 ERK1/2, JNK1/2 및 PKB의 이러한 조기 활성화는 급속 산화에 기인할 수 있습니다. 파라콰트 노출 후 스트레스 유발.

요약하면, 우리의 결과는 처음으로 낮은 농도의 파라콰트가 E18 세포에서 PKB, ERK1/2 및 JNK1/2 인산화의 매우 초기에 강력한 증가를 자극한다는 것을 보여줍니다. 또한, 우리는 JNK1/2 경로의 초기 활성화를 억제하면 E18 세포가 파라콰트에 의해 유도된 세포 사멸로부터 보호된다는 것을 보여주었습니다. 이 결과는 낮은 농도의 파라콰트에 의해 유도된 세포 사멸에 필수적인 역할을 하는 일부 초기 사건(빠른 JNK1/2 활성화와 같은)의 존재를 가리킵니다. 이 결과는 또한 파라콰트 독성 연구에 새롭고 흥미진진한 영역을 열어주며 PD의 발달에 대한 가능한 함의를 나타냅니다.(파킨슨 병).

노트: 시스탄체신경 세포와 뇌 세포에 영향을 미치는 전통적인 중국 허브입니다. cistanche는 사막 인삼으로도 알려져 있으며, 다음과 같은 신경 질환에 대한 잠재적인 치료제입니다.파킨슨 병현대의 약리학 연구를 바탕으로