고속 역류 크로마토그래피에 의한 Cistanches Deserticola YC Ma의 4가지 화합물의 예비 분리 및 정제

연락처: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 이메일:audrey.hu@wecistanche.com

추상적인:

실리카겔 컬럼에서 성분 농축 단계를 거친 후,페닐에타노이드 배당체에서 성공적으로 분리되었습니다.시스탄체스 데저티콜라에틸 아세테이트-n-부탄올-에탄올-물(4{14}}:6:6:50, v/v /v/v). 총 30.9 mg의 악테오시드, 13.0 mg의 이소악테오시드, 12.5 mg의 시린갈리드 A 3'{18}}L-람노피라노시드 및 7.2 mg의 2'-아세틸악티오시드가 HPLC-ELSD에 의해 측정된 바와 같이 순도가 95%를 초과하는 것으로 나타났습니다. 297 mg의 1단계 분리에서 얻은Cistanche 데시 콜라 추출물, 각각. 이들의 구조는 HR-MS, 1H-NMR 및 13C-NMR로 확인하였다.

키워드: 고속 역류 크로마토그래피;Cistanches Deserticola YC Ma;페닐에타노이드 배당체; 악티오사이드; 이소악티오사이드; 시린갈리드 A 3'{1}}L-람노피라노시드; 2'-아세틸락테오사이드.

소개

시스탄체스 데저티콜라YC Ma의 종시스탄체스구기자과에 속하는 한약재로 신장결핍, 여성불임, 병적백반증, 신경증, 노인성 변비의 치료에 잘 알려져 있다[1]. 중국 서북부에 널리 분포하는 기생식물이다. 지금까지 페닐에타노이드 배당체(PhGs), 이리도이드 및 리그난을 포함한 여러 화합물이 이 종에서 분리되었습니다[2]. 일부 PhGs는 항산화, 간 보호 및 신경 보호 활성을 갖는 것으로 보고되었습니다[3-6]. 그러나 PhG의 분리 및 정제 절차는 어렵고 시간이 많이 걸립니다. 또한 기존의 다중 크로마토그래피 방법은 많은 수의 유기 용매를 사용할 뿐만 아니라 시료 회수율도 낮습니다. 지지체가 없는 액체-액체 분할 크로마토그래피 기술인 고속 역류 크로마토그래피(HSCCC)는 일부 기존 방법에 비해 우수한 시료 회수율을 제공하며 다양한 천연 생성물의 분리 및 정제에 널리 사용되어 왔습니다[7-9] . 여러 PhG가 정제되었지만시스탄체스속 및 기타 HSCCC [10-14]에 따르면, 하나의 이상 시스템에서 acteoside, isoacteoside, syringalide A 3'{3}}L-rhamnopyranoside 및 2'-acetylacteoside의 정제를 보고한 논문은 없습니다.

이 논문에서 우리는 C. Deserticola에서 4개의 PhGs를 분리하고 정제하는 간단한 방법을 보고합니다. 최종적으로, 30.9 mg의 악티오시드, 13.0 mg의 이소악티오시드, 12.5 mg의 시린갈리드 A 3'{7}}L-람노피라노시드 및 7.2 mg의 2'-아세틸악티오시드를 한 단계에서 얻었다. 순도가 각각 99%, 95%, 99% 및 98%인 297mg의 분획으로부터 분리. 그들의 구조는 1H- 및 13C-NMR 스펙트럼 데이터와 HR-MS 스펙트럼을 기반으로 특성화되었습니다. 이 조사에서 확인된 4개의 PhGs의 구조는 그림 1에 나와 있습니다.

결과 및 논의

조 추출물의 HPLC 분석

C. Deserticola의 n-부탄산 추출물의 성분 농축 분획을 HPLC-UV로 분석했습니다. 사용된 컬럼은 Accurasil C18(250mm × 4.6mm, id 5μm)(Thermo-Fisher Scientific Instruments, city, state abbrev, USA)이었고, 이동상은 메탄올-물(30:70, v/v)이었습니다. 유속은 1mL/분이었다. 검출기 파장은 254 nm로 설정되었습니다. HPLC 크로마토그램은 그림 2에 나와 있습니다. 피크 1~4는 악테오사이드(1), 이소악테오사이드(2), 시린갈리드 A 3'{19}}L-람노피라노사이드(3) 및 2'-아세틸락테오사이드(4)에 해당하며, 각기.

2상 용매 시스템의 선택

HSCCC에 의한 성공적인 분리는 적절한 2상 용매 시스템의 선택에 크게 좌우되며, 2상 용매 시스템은 각 대상 성분의 분배 계수 값(K)에 따라 선택되었으며 K의 최적 범위는 {{ 2}}.5에서 2.

실험에서 여러 2상 용매 시스템의 대상 구성 요소에 대한 K 값이 표 1에 나와 있습니다(피크 4의 경우 약간 높지만 결과는 허용 가능한 것으로 나타났습니다). 그 중 에틸 아세테이트-n-부탄올-에탄올-물(40:6:6:50, v/v/v/v)은 표적 화합물에 적합한 분배 계수를 제공했습니다. 결국 에틸 아세테이트-n-부탄올-에탄올-물(40:6:6:50, v/v/v/v)로 구성된 용매 시스템을 사용하여 다음 그림과 같이 C. Deserticola의 4가지 화합물을 분리하고 정제했습니다. 그림 3. 그림 2와 같이 각 HSCCC 분획의 HPLC 분석은 4개의 순수한 PhG(acteoside, 99% ; isoacteoside, 95% ; syringalide A 3'- -L-rhamnopyranoside 99% 및 2'- acetylacteoside 98%)는 조 분획에서 얻을 수 있습니다.

실험적

기구

본 연구에 사용된 HSCCC 장비는 TBE{0}}B 고속 역류 크로마토그래피 시스템(Shanghai Tauto Biotech Co., Shanghai, China)으로 3개의 예비 다층 코일 분리 컬럼이 직렬로 연결되어 있습니다(튜브 직경=2.6mm, 총 부피=300mL) 및 20mL 샘플 루프. 회전 반경 또는 홀더 축과 중심 사이의 거리원심분리기의 축(원심분리기(R)의 축은 5cm이고 값은 내부 터미널에서 0.5에서 외부 터미널(= r/R에서 0.8)로 다양합니다. 여기서 r은 코일에서 홀더 샤프트까지의 거리입니다). HX 1{14}}5 항온 순환 기구(Beijing Changliu Lab Instrument Company, Beijing, China)를 사용하여 실험에서 온도를 제어했습니다. HSCCC 시스템에는 모델 TBP{8}} 중간 압력 일정 흐름 펌프, 254 nm에서 작동하는 모델 TBP{11}} UV 검출기, 모델 V4.0 워크스테이션(Jinda Biochemistry Instrument Company, 중국 상하이).

사용된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 장비는 G1312A 바이너리 펌프, G1329A 자동 시료 주입기, G1314A 가변 파장 검출기(VWD), G1316A 항온 컬럼 구획, G1379B 탈기 장치 및 Agilent LC로 구성된 Agilent 1200 시스템이었습니다. 워크스테이션. 순도 검출에는 Alltech 3300 ELSD가 사용되었습니다. Agilent 6520 Q-TOF 및 Bruker AVANCE III 500-NMR 분광기는 화합물의 구조 식별에 사용되었습니다. 1H 및 13C-NMR 스펙트럼(각각 500 및 125MHz에서)은 실온(22도/295.1K)에서 측정되었습니다.

시약 및 재료

에틸 아세테이트, n-부탄올 및 에탄올은 분석 등급이고 메탄올은 HPLC 등급입니다. 모든 용매는 Tianjin Concord Technology Company (Tianjin, China)에서 구입했습니다. Milli-Q 물(18.2MΩ)(Millipore, Bedford, MA, USA)은 모든 용액 및 희석액에 사용되었습니다. C. Deserticola의 뿌리줄기는 2009년 6월 중화인민공화국 내몽고성에서 채집되었다. 식물은 Lijuan Zhang 교수에 의해 동정되었으며, 바우처 표본(No. 20091001)이 우리 연구실에 기탁되었다.

조 시료의 준비

C. Deserticola의 분말형 공기 건조 다육질 줄기(1Kg)를 매회 2시간 동안 수성 에탄올(8L, 60% v/v)로 2회 환류시켰다. 추출물을 에탄올이 완전히 증발할 때까지 감압 및 60도의 온도에서 증발시켰다. 잔류물을 물에 현탁시키고 클로로포름, 에틸 아세테이트 및 n-부탄올로 연속적으로 3회 추출하여 감압하에 증발 건조시킨 후 5.16g의 n-부탄올 추출물을 수득하였다. 그런 다음 n-부탄산 추출물을 점진적 구배 용리(CHCl3-MeOH, 10:1→1:1)를 사용하여 실리카겔 컬럼(200-300 메쉬)에서 분리하여 8개의 분획을 제공했습니다. 분획 6(297 mg)을 추가 HSCCC 분리 및 분리에 사용했습니다.

2상 용매 시스템의 선택

2상 용매 시스템은 C. Deserticola 분획에서 대상 성분의 분배 계수(K)에 따라 선택되었습니다. K 값은 다음과 같이 LC 분석에 의해 결정되었습니다. 적절한 양의 조 추출물 분말(분획 6)을 용매 시스템의 하부 상에 용해시키고 HPLC에 의해 분석하였다. 피크의 면적은 A1으로 기록되었다. 그런 다음 동일한 부피의 상부 상을 용액에 첨가하고 완전히 혼합하여 분배 평형에 도달했습니다. 그 다음, 하부 상을 HPLC로 다시 분석하였다. 후자의 피크 영역은 A2로 기록되었습니다. K 값은 다음 방정식에 따라 계산되었습니다. K=(A1 - A2)/A2 [15,16].

2상 용매 시스템 및 샘플 용액의 준비

본 연구에서는 에틸 아세테이트-n-부탄올-에탄올-물(40:6:6:50, v/v/v/v)로 구성된 2상 용매 시스템을 HSCCC 분리에 사용했습니다. 각 용매를 분별 깔때기에 첨가하고 실온에서 완전히 평형화시켰다. 상부상과 하부상을 분리하고 사용 직전에 30분 동안 초음파 처리하여 탈기하였다. 샘플 용액은 에틸 아세테이트-n-부탄올-에탄올-물(40:6:6:50, v/v/v/v)의 하부상 15ml에 분획 6 297mg을 용해하여 제조했습니다.

HSCCC 분리 절차

HSCCC는 다음과 같이 수행되었다. 다층 코일형 컬럼을 먼저 상부 유기 고정상으로 채웠다. 그 다음, 하부 수성 이동상을 1.5mL/min의 유속으로 컬럼의 헤드 엔드로 펌핑하고, 동시에 HSCCC 장치를 900rpm의 회전 속도로 작동시켰다. 유체역학적 평형이 확립된 후(약 2시간 후) 꼬리 출구에서 용리되는 투명한 이동상으로 표시된 대로, 297mg의 조 추출물(분획 6)을 포함하는 15mL 샘플 용액을 주입 밸브를 통해 주입했습니다. 컬럼의 유출물은 254 nm에서 지속적으로 모니터링되었습니다. 크로마토그램에 따라 4개의 피크 분획을 수집한 다음 감압하에 증발시켰다. 장치의 온도는 25도로 설정되었습니다.

HSCCC 피크 분획의 HPLC 분석 및 식별

HSCCC의 피크 분획을 HPLC-ELSD로 분석했습니다. 사용된 컬럼은 Accurasil C18(250 mm × 4.6 mm, id 5 μm)이었고, 이동상은 메탄올-물(30:70, v/v)이었습니다. 유속은 1mL/분이었다. ELSD는 온도 45도, 가스 1.6L/min의 조건에서 작동되었습니다. 4개의 HSCCC 피크 분획의 구조적 식별은 HR-ESI-MS, 1H 및 13C-NMR 분광법에 의해 수행되었습니다.

구조적 식별

분획 I: m/z 623.2001(MH)-에서 관찰된 HR-ESI-MS, C29H35O15에 대한 계산치, 623.1981. 1H-NMR(500MHz, CD3OD) δ ppm: 1.09(3H, d, J{16}} Hz, 람노스의 CH3), 2.79(2H, t, J{21}}.5 Hz, Ar-CH 2-), 4.37(1H, d, J{28}} Hz, H{29}} 포도당), 5.18(1H, d, J=1 Hz, H{34} } 람노스), 6.27(1H, d, J{38}}.5Hz, Ar-CH{41}}CH-), 7.59(1H, d, J{46}}.5Hz, Ar -CH=CH-), 6.5–7.1(6H, 방향족 H).13C-NMR(125MHz, CD3OD) δ ppm: 131.5(C{62}}), 117.2(C{65} }), 146.2(C{68}}), 144.7(C{71}}), 116.4(C{74}}), 121.3(C{77}}), 72.4(C-), 36.6 (C-), 127.7(카페{86}}), 115.3(카페{89}}), 146.9(카페{92}}), 149.8(카페{95}}), 116.6(카페-2) 98}}), 123.2(Caf{101}}), 168.3(Caf- ), 114.8(Caf- ), 148.1(Caf- ), 104.3(G{113}}), 76.1(Glc{116} }), 81.7(Glc{119}}), 70.5(Glc{122}}), 76.3(Glc{125}}), 62.4(Glc{128}}), 103.1(Rha{131} }), 72.3(Rha{134}}), 72.1(Rha{137}}), 73.9(Rha{140}}), 70.7(Rha{143}}), 18.5(Rha{146} }). 문헌[17]에 제공된 데이터와 비교하여, 분획 I은 액테오사이드에 해당합니다.

분획 II: m/z 623.1987(MH)-에서 관찰된 HR-ESI-MS, C29H35O15에 대한 계산치, 623.1981. 1H-NMR(5{54}}0 MHz, CD3OD) δ ppm: 1.25(3H, d, J{16}}.5 Hz, 람노스의 CH3), 2.78(2H, t, J=7 Hz, Ar-CH2-), 4.33(1H, d, J= 8 Hz, H{29}} 글루코스), 5.17(1H, d, J{{ 33}} Hz, H{34}} 람노스), 6.28(1H, d, J= 15.5Hz, Ar-CH=CH-), 7.56(1H, d, J=15.5 Hz, Ar-CH=CH-), 6.5–7.0(6H, 방향족 H). 13C-NMR(125MHz, CD3OD) δ ppm: 131.5(C{62}}), 117.2(C{65}}), 146.2(C-3), 144.7(C-4 ), 116.5(C-5), 121.3(C{77}}), 72.4(C-), 36.7(C-), 127.8(카페{86}}), 115.2(카페{89) }}), 146.8(Caf{92}}), 149.7(Caf{95}}), 116.6(Caf{98}}), 123.2(Caf{101}}), 169.2(Caf-), 115.0(Caf-), 147.3(Caf-), 104.5(G{113}}), 75.5(Glc{116}}), 84.2(Glc{119}}), 70.1(Glc{122}} ), 75.7(Glc{125}}), 64.7(Glc{128}}), 102.8(Rha{131}}), 72.4(Rha{134}}), 72.4(Rha{137}} ), 74.1(Rha{140}}), 70.5(Rha{143}}), 17.9(Rha{146}}) 1H-NMR 및 13C-NMR 스펙트럼 데이터는 문헌[18]에 보고된 바와 같이 isoacteoside의 스펙트럼 데이터와 일치했습니다.

분획 III: m/z 6{{1{129}}8}}7.2032(MH)-에서 관찰된 HR-ESI-MS, C29H35O14에 대한 계산, 607.2032. 1H-NMR(500MHz, CD3OD) δ ppm: 1.09(3H, d, J{16}} Hz, 람노스의 CH3), 2.84(2H, t, J{21}}.5 Hz, Ar-CH 2-), 4.37(1H, d, J{28}} Hz, H{29}} 포도당), 5.19(1H, d, J=1.5 Hz, H{{ 람노스의 35}}), 6.27(1H, d, J{39}} Hz, Ar-CH=CH-), 7.59(1H, d, J{46}} Hz, Ar-CH =CH-), 6.6–7.1(7H, 방향족 H). 13C-NMR(125MHz, CD3OD) δ ppm: 130.8(C{61}}), 116.2(C{64}}), 130.9(C{67}}), 156.8(C{70}} ), 130.8(C-5), 116.2(C-6), 72.4(C-), 36.4(C-), 127.8(카페{85}}), 114.8(카페{88) }}), 149.8(Caf{91}}), 146.9(Caf{94}}), 116.6(Caf{97}}), 123.2(Caf{100}}), 168.3(Caf- ), 115.4(Caf-), 148.0(Caf-), 104.3(G{112}}), 76.3(Glc{115}}), 81.7(Glc{118}}), 70.4(Glc{121}} ), 76.1(Glc{124}}), 62.5(Glc{127}}), 103.0(Rha{130}}), 72.3(Rha{133}}), 72.2(Rha{136}} ), 73.9(Rha{139}}), 70.7(Rha{142}}), 18.4(Rha{145}}) 문헌[18]에 따르면, 분획 III는 syringalide A 3'{148}}L-rhamnopyranoside에 해당합니다.

분획 IV: m/z 665.21{{2{58}}}}(M−H)-에서 관찰된 HR-ESI-MS, C31H37O16에 대한 계산, 665.2087. 1H-NMR(500MHz, CD3OD) δ ppm: 1.09(3H, d, J{16}}.5Hz, 람노스의 CH3), 2.00(3H, s, OAc), 2.72(2H, t, J{ {25}}.5Hz, Ar-CH2-), 4.55(1H, d, J{32}} Hz, H{33}}의 포도당), 4.90(1H, d, J{ {37}} Hz, H{38}} 람노스), 6.29(1H, d, J{42}}.5Hz, Ar-CH=CH-), 7.62(1H, d, J=15.5 Hz, Ar-CH=CH-), 6.5–7.0(6H, 방향족 H). 13C-NMR(125MHz, CD3OD) δ ppm: 131.9(C-1), 117.3(C-2), 146.1(C-3), 144.7(C-4 ), 116.4(C-5), 121.4(C{81}}), 72.7(C-), 36.4(C-), 127.7(카페{90}}), 115.4(카페{93) }}), 146.9(Caf{96}}), 149.9(Caf{99}}), 116.6(Caf{102}}), 123.2(Caf{105}}), 168.1(Caf- ), 114.7(Caf-), 148.2(Caf-), 101.8(G{117}}), 75.3(Glc{120}}), 80.3(Glc{123}}), 70.8(Glc{126}} ), 76.2(Glc{129}}), 62.3(Glc{132}}), 103.3(Rha{135}}), 72.0(Rha{138}}), 71.8(Rha{141}} ), 73.7(Rha{144}}), 70.8(Rha{147}}), 18.5(Rha{150}}), 171.5(C{153}}O), 20.9(OAC). 1H-NMR과 13C-NMR 스펙트럼 데이터는 2'-acetylacteoside와 일치하였다[17].

결론

3'{1}}L-람노피라노사이드 및 2'-아세틸락테오사이드로부터 악테오사이드, 이소악테오사이드, 시린갈리드 A의 예비 분리 및 정제를 위한 HSCCC 방법Cistanches Deserticola YC Ma설립되었다. 현재 연구는 HSCCC가 식물 재료에서 생리 활성 성분의 예비 분리 및 정제를 위한 매우 강력한 기술임을 나타냅니다. 또한, 화합물은 고순도로 충분히 대규모로 분리될 수 있으며 크로마토그래피 또는 생물 활성 연구를 위한 참조 물질로 사용될 수 있습니다. 이 방법은 복잡한 천연물을 신속하게 분취 분리할 수 있는 실현 가능하고 경제적이며 효율적인 기술입니다.

감사의 말

이 작업은 Changjiang Scholars and Innovative Research Team in University(PCSIRT), 중국 과학 기술부의 국제 협력 계획 프로젝트(2008DFB30070) 및 Alashan의 Left Banner 과학 프로그램({{2 }}).

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