리소좀 지질 과산화는 종양 면역을 조절합니다
Sep 19, 2023
DC661과 같은 팔미토일 단백질 티오에스테라제 1(PPT1) 억제제에 의해 유발된 리소좀 억제는 세포 사멸을 일으킬 수 있지만 이에 대한 메커니즘은 완전히 이해되지 않았습니다. DC661의 세포독성 효과를 달성하기 위해 프로그램된 세포 사멸 경로(자가포식, 세포사멸, 괴사, 페롭토시스 및 파이롭토시스)가 필요하지 않았습니다. 카텝신, 철 또는 칼슘 킬레이트화의 억제는 DC661-유발 세포독성을 구제하지 못했습니다. PPT1 억제는 리소좀 지질 과산화(LLP)를 유도하여 리소좀 막 투과화 및 세포 사멸을 유도했으며 이는 항산화제 N-아세틸시스테인(NAC)에 의해 역전될 수 있지만 다른 지질 과산화 항산화제는 그렇지 않습니다. 리소좀 시스테인 운반체 MFSD12는 NAC의 리소좀 내 운반 및 LLP 구조에 필요했습니다. PPT1 억제는 NAC로만 역전될 수 있는 칼레티쿨린의 표면 발현으로 세포 고유의 면역원성을 생성했습니다. DC661- 처리된 세포는 순수 T 세포를 프라이밍하고 T 세포 매개 독성을 강화했습니다. DC661- 처리된 세포로 예방접종을 받은 쥐는 "면역성 고온" 종양에서는 적응 면역 및 종양 거부반응을 일으켰지만 "면역성 저온" 종양에서는 그렇지 않았습니다. 이러한 발견은 LLP가 세포 사멸의 독특한 면역원성 형태인 리소좀 세포 사멸을 유도한다는 것을 입증하며, 임상 시험에서 테스트할 수 있는 면역요법과 리소좀 억제의 합리적인 조합을 제시합니다.
cistanche tubeulosa-항종양의 장점
소개
리소좀 억제제인 하이드록시클로로퀸(HCQ)(1)과 관련된 임상 시험에서 고무적인 활동을 통해 팔미토일 단백질 티오에스테라제 1(PPT1)을 클로로퀸 유도체의 분자 표적으로 확인하고(2) 새로운 PPT1 억제제를 임상에 출시했습니다. 시험(3, 4)에서는 리소좀 억제제가 세포 사멸을 유도하는 메커니즘과 리소좀 억제가 종양 면역에 미치는 영향을 이해할 필요가 있습니다. HCQ에 대해 설명된 리소좀 세포 사멸의 표준 메커니즘은 리소좀 막 투과성(LMP), 카텝신 누출 및 카스파제 매개 세포사멸의 활성화를 포함합니다(5, 6). 우리는 이전에 리소좀 억제제 DC661이 산성 종양 미세 환경의 세포에 침투하여 HCQ보다 더 효율적으로 리소좀에 위치한다는 것을 보여주었습니다(2, 7). DC661은 많은 암 세포주에서 강력한 세포 사멸을 유발합니다(2). DC661은 PPT1에 결합하여 억제하고 리소좀을 탈산성화하며 자가포식을 억제합니다. DC661은 또한 LMP를 유도하고 절단된 카스파제 3의 수준을 증가시킵니다(2, 7). 최근 몇 년 동안 면역원성 결과를 가져오는 세포 사멸의 새로운 메커니즘이 정의되었으며 여기에는 괴사, 페롭토시스 및 파이롭토시스가 포함됩니다(8). 리소좀 의존성 자가포식은 MHC 클래스 I(9)과 면역프로테아좀의 구성 요소(10)를 저하시키는 것으로 나타났으며, 이는 자가포식 억제가 항원 처리를 향상시킬 수 있음을 시사합니다. 그러나 리소좀 억제 및 그에 따른 세포 사멸의 면역원성 효과는 완전히 특성화되지 않았습니다. 이러한 지식 격차를 해결하기 위해 우리는 리소좀 세포 사멸이 세포 사멸의 형태인지 아니면 단순히 다른 확립된 메커니즘 중 하나의 전조인지 확인하기 위해 표준 세포 사멸 메커니즘에 대한 DC661의 영향을 조사했습니다. 우리는 HCQ와 DC661이 흑색종 단백질체에서 소수의 단백질에서만 유의미한 증가를 유도했으며 이들 중 대부분은 자가포식 및 세포사멸 관련 단백질이라는 것을 발견했습니다. 프로그램된 세포 사멸 억제제(apoptosis, necroptosis, ferroptosis 및 pyroptosis)는 DC661에 의한 리소좀 손상 후 세포 독성 효과를 완화하지 못했습니다. 리소좀 지질 과산화(LLP)는 세포 표면의 칼레티쿨린(CALR) 발현과 관련된 LMP 유발 세포 사멸의 주요 동인입니다. 이러한 형태의 세포 사멸은 항산화제인 N-아세틸시스테인(NAC)을 사용해야만 되돌릴 수 있습니다. NAC 활성은 리소좀 시스테인 수입업자 MFSD12의 억제로 인해 손상되었습니다. LLP는 T 세포 매개 살해를 촉진하는 면역원성 표현형을 유도했습니다. 이러한 발견은 리소좀 세포 사멸이 잠재적으로 독특한 형태의 면역원성 세포 사멸임을 입증합니다.
시스탄체 식물의 면역 체계 증가
결과
리소좀 억제는 자가포식 및 세포사멸과 관련된 프로테옴의 중요한 변화를 유도합니다. 리소좀 억제제의 세포독성 효과를 확립하기 위해 우리는 액포성 H+-ATPase 억제제인 bafilomycin-A1(1)로 처리한 A375P 흑색종, RKO 결장암 및 MIA PaCa-2 췌장암 세포주의 생존성을 평가했습니다(1). 00nM); PPT1 억제제 DC661(3μM) 또는 HCQ(10μM 또는 30μM); 팔미테이트 모방 헥사데실 설포닐 플루오라이드(HDSF; 60 μM); 카텝신 억제제 펩스타틴 A(PepA; 10ug/mL), E64(PepA; 10ug/mL) 또는 PepA+E64; 및 리소좀 막 파괴자 Leu-Leu 메틸 에스테르 하이드로브로마이드(20μM)를 48시간 동안 사용했습니다. 바필로마이신-A1과 DC661만이 암 세포주 전반에 걸쳐 세포 생존력을 크게 감소시켰습니다(그림 1A 및 보충 그림 1A, 이 기사와 함께 온라인으로 제공되는 보충 자료, https://doi.org/10.1172/JCI164596DS1). 바필로마이신-A1보다 세포 생존력이 더 크게 감소합니다. 이러한 데이터와 클로로퀸 유도체의 약리학적 약물 유사 특성을 기반으로 우리는 리소좀 세포 사멸을 이해하기 위한 도구로서 클로로퀸 유도체에 대한 연구에 집중했습니다. 24시간 동안 DC661(3μM) 또는 덜 강력한 HCQ(10μM 또는 30μM)로 처리된 A375P 흑색종 세포에 편견 없는 전체 프로테옴 분석을 적용했습니다. 4,264개의 고신뢰도 정량 단백질 중 DC661(3μM) 및 HCQ(30μM)에서는 각각 87개 및 55개 단백질만 유의하게 증가했습니다. 또한 DC661(3μM) 및 HCQ(30μM)에서는 각각 DC661(3μM) 및 HCQ(30μM)에서 14개 및 15개의 단백질이 크게 감소했습니다(2보다 큰 절대 배수 변화, q < 0.05). , 차량 제어와 비교할 때. 더 낮은 용량의 HCQ(10μM)는 비히클 대조군과 비교하여 유의미한 단백질 변화를 나타내지 않았습니다. DC661 치료 후 크게 증가한 상위 50개 단백질은 주로 자가포식 및 세포사멸과 관련이 있었고, 더 높은 용량의 HCQ에서도 유사한 변화가 관찰되었습니다(그림 1B). 이러한 이유로 우리는 더 강력한 DC661에 대한 추가 연구에 집중하기로 결정했습니다. 자가포식 및 세포사멸과 관련된 가장 큰 단백질 변화의 예는 세금1-결합 단백질 1(TAX1BP1; 15-배 증가); BCL2-상호작용 단백질 3(BNIP3; 6-배 증가); BRCA1 유전자 1 단백질의 이웃(NBR1; 12-배 증가); sequestosome-1 (SQSTM1/p62; 5-배 증가); 핵 수용체 보조 활성화제 4(NCOA4; 3-배 증가); 및 LC3B(MAP1LC3B; 3-배 증가). 아포지단백질 B-100(APOB; 66-배 증가)는 송아지 태아 혈청에서 유래되었으며 더 이상 연구되지 않았습니다. Immunoblotting은 DC661 이상의 HCQ 농도로 치료하면 자가포식 화물 수용체 NBR1, TAX1BP1, SQSTM1/p62 및 NCOA4의 발현이 용량 및 시간 의존 방식으로 현저하게 증가한다는 것을 확인했습니다(보충 그림 1, B 및 C). A375P 세포에서 PPT1의 CRISPR/Cas9 KO는 WT 대응물과 비교할 때 이러한 단백질에 대한 DC661의 효과를 표현했습니다(보충 그림 1D). 그러나 자가포식 화물 수용체의 발현과 DC661 치료에 의해 유도된 상대적 증가는 결장암, 췌장암 및 DC661이 세포 독성을 나타내는 기타 흑색종 세포주에 걸쳐 다양했습니다(보충 그림 1E). 이는 자가포식 화물 수용체 자체가 단백질 수준에서 증가하기는 하지만 DC661 치료 후 세포 사멸에 관여할 가능성이 낮다는 것을 시사합니다. 이를 확인하기 위해 우리는 암세포에서 proapoptotic 효과가 알려져 있기 때문에 autophagy 화물 수용체인 TAX1BP1 및 BNIP3에 중점을 두었습니다(그림 1C). TAX1BP1은 자가포식 화물 어댑터이며(11) 또한 암세포에서 단백질 합성 억제제 또는 DNA 손상 물질에 의해 유도된 세포사멸을 조절합니다(12). siRNA에 의한 TAX1BP1의 녹다운(그림 1D)은 단기(그림 1E) 및 장기 생존 분석(그림 1F)에서 DC{119}}유발 세포독성에 영향을 미치지 않았습니다. 이러한 결과는 TAX1BP1이 DC{126}}매개 세포독성에 필수적인 역할을 하지 않는다는 것을 입증했습니다. BNIP3은 미토콘드리아 생체 에너지를 손상시키고 미토파지를 조절하는 세포사멸 촉진 단백질입니다(13). BNIP3의 효과적인 녹다운(그림 1G)은 DC{131}}유발 세포독성(그림 1, H 및 I)에 영향을 미치지 않았습니다. 이러한 결과는 DC661의 세포독성 효과가 BNIP3 발현과 무관하다는 것을 보여주었습니다. 다음으로, 우리는 자가포식 활성화 키나제 1(ULK1) 및 자가포식 관련 유전자 7(ATG7)과 같은 unc{136}}를 쓰러뜨림으로써 자가포식소체 생산에 필요한 표준 자가포식 유전자의 세포 고갈이 DC661 효능에 미치는 영향을 연구했습니다. ULK1 또는 ATG7(보충 그림 2, A 및 B)의 효과적인 녹다운은 자가포식 플럭스(보충 그림 2C)를 억제했지만 DC{146}}유발 세포 독성에는 영향을 미치지 않았습니다(그림 1, J–M). 이러한 결과는 필수 핵심 자가포식 기구가 없어도 DC661의 세포독성 효과가 사라지지 않는다는 것을 보여주었습니다. DC661에 의한 리소좀 억제는 다중 프로그램된 세포 사멸 경로를 유도합니다. 표준적인 관점은 리소좀 세포 사멸이 세포사멸에 의한 것이라는 것입니다(5). 면역블로팅 결과 DC661 처리로 인해 카스파제-3, -7 및 -9가 활성화되고 PARP-1가 절단되어 DC661이 세포사멸을 활성화했음이 확인되었습니다(그림 2A). pan-caspase 억제제 Z-VAD-FMK는 DC661에 의한 카스파제 활성화를 방지했지만 LC3B와 p62의 축적을 억제하지 않았으며 이는 리소좀 억제 후에 세포사멸 활성화와 자가포식 차단이 분리 가능하다는 것을 보여줍니다(그림 2B). ZVAD-FMK로 세포사멸을 차단해도 DC661 세포 독성이 향상되거나 제한되지 않았으며, 이는 리소좀 세포 사멸에 세포사멸이 필요하지 않음을 시사합니다(그림 2, C 및 D). DC661의 세포독성 효과는 세포사멸을 겪을 수 없는 Bax/Bak double-KO 일차 골수 세포와 WT 세포에서 유사했습니다(그림 2E). 세포사멸의 차단은 대장암 및 췌장암 세포의 DC{171}}유도 세포독성에도 영향을 미치지 않았습니다(보충 그림 2, D–F). 우리는 DC{173}} 유도된 세포 사멸에 세포사멸이 필요하지 않다는 것을 발견했기 때문에 DC661이 수용체 상호작용 단백질 키나제(RIPK)와 혼합 계통 키나제 도메인 유사 단백질에 의해 조절되는 또 다른 형태의 프로그램된 세포 사멸인 괴사를 유도하는지 여부를 조사했습니다. MLKL). RIPK 및 MLKL의 인산화 및 활성화된 형태의 수준은 DC661 처리 후 0.1-1 μM에서 증가했습니다(그림 2F). 3μM DC661에서는 인산화된 RIPK1이 없었지만 지속적으로 인산화된 MLKL이 있었는데, 이는 이 더 높은 농도에서 추가적인 형태의 세포 사멸이 관여될 수 있음을 시사합니다. RIPK1 억제제인 necrostatin-1 또는 necrostatin-1 또는 MLKL 억제제 necrosulfonamide를 사용한 전처리는 흑색종 세포에서 DC661(1μM) 처리 후 RIPK1의 인산화를 방지했지만(그림 2G) DC를 구출하는 데는 실패했습니다. }}흑색종 세포(그림 2H) 또는 결장암 또는 췌장암 세포(보충 그림 2G)에서 세포 독성을 유발했습니다. 이러한 발견은 괴사증이 활성화되지만 DC{195}}매개 세포 사멸에는 필요하지 않음을 시사합니다.
그림 1. 리소좀 자가포식 억제는 세포사멸과 자가포식 단백질의 중요한 변화를 유도합니다. (ㅏ)
리소좀은 철분의 주요 저장 장소 중 하나입니다. 감소된 환원 능력과 함께 조절되지 않은 세포내 철분 대사는 페롭토시스(ferroptosis)로 알려진 비세포사멸 세포 사멸을 유발할 수 있습니다. 페롭토시스의 특징은 프로스타글란딘-엔도퍼옥사이드 합성효소 2(PTGS2), 양이온 수송 조절인자 동족체 1(CHAC1) 및 시스테이닐-tRNA 합성효소(CARS)의 상향 조절입니다(14). 이러한 페로프토시스 마커 중 3개는 모두 DC661 처리에 의해 전사적으로 상향조절되었으며(그림 3A), 이는 리소좀 억제가 페로프토시스를 유도함을 시사합니다. DC661은 C11-BODIPY 처리된 A375P 세포에서 형광 이동을 유도했는데, 이는 페롭토시스의 특징인 지질 과산화를 나타냅니다. 이 DC{13}}유발 이동은 페로스타틴 억제제인 페로스타틴-1 또는 립 록스타틴-1을 유효 농도로 투여한 경우 크게 역전되었으며(그림 3B 및 보충 그림 3A), 이는 DC661이 유도된 페로프토시스. 그러나 페로프토시스 억제는 DC661과 관련된 세포독성을 구제하지 못했습니다(그림 3, C 및 D). 철 킬레이터 데페록사민(DFO)과 DC661을 사용한 암세포의 공동 처리는 DC661의 세포 독성을 구제하지 못했습니다(그림 3E). 페로스타틴-1, 립 록스타틴-1 또는 DFO를 사용한 치료는 흑색종, 결장암 및 췌장암 세포에서 DC661의 단기 생존력 또는 장기 클론 생성 성장 억제를 구제하지 못했습니다(보충 그림 3, B –E 및 보충 그림 4, A–D). 이러한 데이터는 페롭토시스가 활성화되지만 DC{31}}매개 세포 사멸에는 필요하지 않음을 보여줍니다. 파이롭토시스는 가스트린(GSDM)을 처리하는 카스파제의 활성화와 관련된 염증 반응과 관련된 프로그램화된 세포 사멸의 한 형태로, 원형질막에 기공이 형성되고 이후 높은 이동성과 같은 손상 관련 분자 패턴이 방출됩니다. 그룹 상자 1(HMGB1). 다중 흑색종 세포주(A375P, A375, WM35 및 WM793)에서 DC661 처리는 개시자 카스파제-8 및 -9와 열분해증에 전형적인 실행자 카스파제-7의 활성화를 가져왔고, 알려진 파이롭토시스 유도제 PLX4720 및 PD0325901과 정도가 유사한 전체 길이 GSDME의 절단(보충 그림 5A). DC661은 알려진 파이롭토시스 유도제인 BRAF 및 1% FBS에서 MEK 억제보다 더 강력한 HMGB1의 세포외 방출을 생성했는데(15), 이는 활성화된 파이롭토시스의 기능적 결과를 반영합니다. 다음으로, GSDME KO에 의한 파이롭토시스 억제가 DC661의 세포독성 효과를 개선하는지 여부를 테스트했습니다. DC661 처리는 LC3II 및 SQSTM1/p62 축적 및 카스파제 활성화를 유도했지만 GSDME-KO WM35 인간 세포에서는 HMGB1 방출이 거의 완전히 폐지되어 파이롭토시스 억제의 기능적 결과가 달성되었음을 입증했습니다(그림 3F). 그러나 DC661 처리는 10% 및 1% FBS 조건 모두에서 YUMM1.7 WT, 빈 벡터(EV), Gsdme KO1 및 KO2 세포에서 동일한 세포 독성을 생성했습니다(그림 3G 및 보충 그림 5B). 여러 형태의 세포 사멸의 일반적인 결과 중 하나는 LDH의 방출입니다. DC661은 LDH 방출을 크게 증가시켰으며 이는 세포사멸, 괴사 또는 페롭토시스 억제에 의해 되돌릴 수 없습니다(보충 그림 5C). 이러한 결과는 DC661이 세포사멸 및 파이롭토시스뿐만 아니라 괴사 및 페롭토시스를 포함하는 다양한 세포 사멸 방식을 유도하지만 이러한 세포 사멸 방식 중 어느 것도 DC661- 유도된 세포 사멸에 필요하지 않음을 보여줍니다. 카텝신 억제 또는 칼슘 킬레이트화는 리소좀 막 투과성으로 인한 세포 사멸을 예방하지 못합니다. 카스파제 활성화(세포사멸 및 파이롭토시스에 필요함)가 DC661- 유도된 세포 사멸에 필요하지 않음을 입증한 후, 우리는 리소좀에서 카텝신 방출이 카스파제 의존성 세포 사멸을 유발할 수 있다는 가설을 세웠습니다. PPT1의 화학적(DC661) 또는 유전적(PPT1 siRNA[siPPT1]) 억제는 리소좀 막 투과성(LMP)을 생성한 반면, 세포 배양에서 빠르게 고갈되는 덜 강력한 PPT1의 비가역적 억제제인 HDSF는 측정된 바와 같이 LMP를 유도할 수 없었습니다. 갈렉틴-3에 의한 –양성 점점(그림 4A). LMP는 카텝신 및 기타 리소좀 내용물을 세포질로 방출하게 하며 리소좀 기반 세포 사멸의 주요 근위 특징으로 생각됩니다. DC661에 의해 유도된 LMP는 세포질 카텝신-L 활성의 상당한 증가와 관련이 있었으며, 이는 시스테인 프로테아제 억제제 E64로 유의하게 차단되었습니다(그림 4B). 이전 보고서에서는 골절된 리소좀에서 카텝신 방출이 카스파제 활성화를 촉진하여 세포사멸을 유도한다고 제안했습니다(16-18). 완전한 카텝신 억제는 카스파제 절단을 예방하지 못했고(그림 4C) 흑색종(그림 4, D 및 E), 결장암 및 췌장암의 단기 및 장기 생존 가능성 분석에서 DC{92}}유발 세포독성을 구제하지 못했습니다. 암세포(보충 그림 6, A-C). 이러한 결과는 카텝신 매개 세포 사멸에 의해 유발되는 리소좀 세포 사멸에 대한 표준적인 견해에 반대됩니다. 새는 리소좀으로부터의 카텝신 방출 외에도 리소좀으로부터의 칼슘 방출은 PPT1이 손상될 때 세포 기능 장애와 관련이 있습니다(19). DC661 처리로 인해 광범위한 칼슘 방출이 발생했으나 이는 세포 영구 칼슘(Ca{101}}) 킬레이터인 BAPTA-AM의 전처리로 인해 중단되었습니다. (그림 4F). 특히, BAPTA-AM은 DC{105}}유발 LMP(그림 4G) 또는 카스파제 절단(보조 그림 6, D 및 E)을 예방하지 못했고 가장 중요한 것은 DC{108}}유발 세포독성을 구제하지 못했습니다( 그림 4H). 이러한 발견은 RKO 및 MIA PaCa{110}} 세포주에서도 관찰되었으며, BAPTA-AM 및 DC661에서 IC50 값에 유의미한 차이가 관찰되지 않았습니다(보충 그림 6F). 이는 LMP 관련 세포 사멸이 칼슘이나 카텝신에 의존하지 않습니다.
그림 2. DC661-유발 세포사멸 및 괴사. (ㅏ)
그림 3. DC661-유발 페롭토시스 및 파이롭토시스. (ㅏ)
LLP는 LMP를 구동합니다. 주요 세포 사멸 경로(apoptosis, necroptosis, ferroptosis 및 pyroptosis), 카텝신(PepA 및 E64) 및 이온 킬레이터(BAPTA-AM [Ca{2}}] 및 DFO [Fe{3} }]) DC661에 의한 세포 사멸을 예방하지 못했고 C-11-BODIPY에 의한 지질 과산화의 증거를 발견하여 DC661 처리 후 2시간과 4시간에 전체 리피도메 분석을 수행했습니다. DC661은 리소인지질의 모든 클래스에서 초기 및 지속적인 3- ~ 10-배 증가를 유도했습니다(그림 5A). 대조적으로, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤 및 포스파티드산을 포함한 인지질 클래스에서는 변화가 최소화되거나 전혀 관찰되지 않았습니다(보충 그림 7A). 리소인지질 종은 ROS에 의해 생성될 수 있으며, 이는 포화 지방산 사슬을 산화시킨 다음 포스포리파제에 의해 절단됩니다(20). 항산화제가 ROS 매개 지질 손상을 예방할 수 있는지 확인하기 위해 우리는 pan-ROS 제거제인 N-아세틸시스테인(NAC)(21, 22)과 추정 지질 과산화 억제제인 Trolox(23)의 존재 하에서 DC{16}}유발 세포 독성을 조사했습니다. ) 및 비타민 C(아스코르브산)(24, 25). 지금까지 테스트한 다른 제제와 달리 NAC와의 공동 치료는 여러 세포주에 걸쳐 DC{24}}관련 세포 독성을 구출했습니다(그림 5B 및 보충 그림 7B). 장기 CFU 분석 결과, NAC는 여기에서 테스트한 모든 세포사멸 억제제, 이온 킬레이트제, 카텝신 억제제와 달리 A375P, RKO, MIA PaCa{30}}, B16F10 및 MC38 세포에서 DC661의 세포 독성 효과를 예방하는 것으로 나타났습니다. 그림 5C 및 추가 그림 7C). 흥미롭게도 Trolox와 비타민 C는 인간 흑색종, 대장암, 췌장암 세포, 쥐 흑색종 및 대장암 세포에서 DC661 세포 독성을 구제하지 못했습니다(그림 5D 및 보충 그림 7, D-H). 이러한 차이로 인해 우리는 NAC, Trolox 및 비타민 C가 LMP에 영향을 미치는지 여부를 테스트하게 되었습니다. 우리의 결과는 NAC가 DC{39}}유발 LMP를 크게 감소시키는 유일한 항산화제임을 보여주었습니다(그림 5E). 우리는 LLP가 DC661에 의해 LMP 생산을 유도한다는 가설을 세웠는데, 이는 NAC에 의해 되돌릴 수 있지만 Trolox와 비타민 C에 의해서는 되돌릴 수 없습니다. LLP 과정을 연구하기 위해 우리는 형광 프로브 FOAM-LPO(26)를 사용했는데, 이는 특히 리소좀에 국한되어 생성됩니다. 과산화지질에 노출되면 스펙트럼이 586nm에서 512nm(빨간색에서 녹색)로 이동합니다. 우리는 DC661이 대조군과 비교하여 LLP를 유도한다는 것을 발견했습니다(그림 5F). NAC는 DC661- 처리된 흑색종 세포의 리소좀에서 지질 과산화를 감소시킨 반면, Trolox와 비타민 C는 LLP를 감소시키지 못했습니다(그림 5F). NAC, Trolox 및 비타민 C 자체는 지질 과산화에 큰 영향을 미치지 않았습니다. PPT1의 녹다운(보충 그림 8A) 또는 고농도의 HCQ(보충 그림 8B)로 처리하면 NAC에 의해 역전될 수 있는 LMP가 유도된 반면, ULK1의 화학적 억제는 LMP를 유도하지 않았습니다(보충 그림 8C). 중요한 것은 siPPT1의 녹다운에는 NAC로 역전될 수 있는 LLP도 포함되어 있다는 것입니다(보조 그림 8D). 이러한 결과는 PPT1 억제가 NAC에 의해 구제될 수 있는 LLP를 유도하고 PPT{58}} 억제 유발 LMP의 원인일 가능성이 있음을 보여줍니다. 또한, 이러한 발견은 LLP가 리소좀 세포 사멸에 중요하다는 것을 시사했습니다.
한약재 시스탄체 식물-항종양
MFSD12에 의해 시스테인이 리소좀으로 유입되면 리소좀 세포 사멸이 약화됩니다. 3가지 지질 과산화 억제제 중 NAC만이 LLP를 예방했습니다. 최근 보고서에 따르면 12를 포함하는 주요 촉진자 슈퍼패밀리 도메인(MFSD12)은 리소좀과 멜라노좀에 대한 시스테인 수입자의 필수 구성 요소인 것으로 나타났습니다(27). 우리는 NAC 또는 NAC의 대사물질인 시스테인이 MFSD12를 통해 리소좀으로 운반되고, 그곳에서 시스테인이 이황화물인 시스테인으로 산화된다고 추론했습니다. 이 가설을 테스트하기 위해 우리는 siNT 및 siMFSD12 A375P-hGal3-EGFP 세포에서 DC661 세포독성을 구제하는 NAC의 능력을 비교했습니다. 우리의 결과는 NAC가 siNT 세포에서 DC{11}}유발 LMP를 구출했지만 siMFSD12 세포에서는 LMP를 구출하지 못한 것으로 나타났습니다(그림 6A). NAC는 DC661-처리된 siNT-A375P 세포의 LLP를 감소시켰지만 siMFSD12 세포는 감소시키지 않았습니다. DMSO 또는 NAC로 처리된 siMFSD12 세포는 siNT 세포에 비해 기본 LLP가 증가했습니다(그림 6B). NAC가 siNT 세포에서 DC661 세포독성을 구출한 반면, DC661 세포독성을 구출하는 NAC의 능력은 siMSFD12 세포에서 완전히 폐기되었습니다(그림 6C). 이는 MFSD12 녹다운이 DC661에 대한 NAC의 세포 보호 효과를 차단한다는 것을 보여줍니다. NAC는 세포질에서 아실라제에 의해 탈아세틸화됩니다(28). NAC 처리가 리소좀 내에 시스테인 또는 시스틴의 축적을 생성하는지 확인하기 위해 우리는 리소좀 면역침전(Lyso-IP) 기술(29)을 사용하여 DMSO 및 NAC 처리 A375P 세포(그림 6D 및 보충 그림 9A)에서 리소좀을 정화하고 수행했습니다. NAC 및 관련 대사산물을 정량화하기 위한 표적 대사체학. 예상한 대로, NAC는 NAC 처리된 전체 세포 용해물 및 관련 미결합 분획에서 검출되었습니다. L-시스테인 수준은 NAC 처리 리소좀 내에서 실질적으로 증가했습니다. L-시스틴은 NAC 처리된 리소좀 내에서만 검출 가능했습니다. 놀랍게도 NAC 처리 그룹에서는 글루타티온(감소)이 크게 증가하지 않았습니다(그림 6E). NAC 처리가 글루타티온 생산 증가를 유도하여 산화환원 균형을 교정한다고 일반적으로 믿고 있기 때문에 이는 놀라운 일이었습니다. 이러한 결과는 MFSD12 수입자를 통해 리소좀으로 수입된 시스테인이 LLP, LMP 및 리소좀 세포 사멸을 구하는 데 중요하다는 것을 시사합니다. LLP는 면역원성입니다. DC661에 의해 유도된 조절된 세포 사멸의 일부 형태(pyroptosis, necroptosis, ferroptosis)는 면역원성인 것으로 확인되었습니다. 이전에는 CALR의 세포 표면 발현과 HMGB1 단백질 및 아데노신 삼인산(ATP)의 방출을 포함한 손상 관련 분자 패턴의 표시를 포함하는 특징적인 특징을 기반으로 화학요법 약물에 대해 면역원성 세포 사멸이 설명되었습니다(30). CALR은 세포 스트레스 동안 세포 표면에 노출될 때 "나를 먹어라" 신호로 작용합니다. HMGB1 및 ATP의 세포외 방출은 식세포에 의해 인식되는 "find-me" 신호로 작용합니다. 우리는 두 가지 모델, 즉 동계 종양 모델에서 종양 침윤 림프구가 거의 완전히 없는 B16F10 세포와 동계 종양 모델에서 종양 침윤 림프구를 갖는 MC38 세포를 비교했습니다. 첫째, 우리는 DC661 또는 siPpt1 처리가 MC38 세포에서 NAC 공동 처리로 완전히 폐지될 수 있는 표면 CALR 발현을 유의하게 유도한다는 것을 입증했습니다(그림 7, A 및 B). B16F10 세포에서도 유사한 결과가 관찰되었습니다(그림 7C). 주요 세포 사멸 경로(apoptosis, necroptosis, ferroptosis 및 pyroptosis)의 억제제는 CALR의 표면 발현을 방지하지 못했습니다(그림 7D). DC661에 의해 유도된 면역원성 세포 사멸이 MHC 클래스 I 상향 조절로 인한 것인지 확인하기 위해 B16F10 및 MC38 세포를 DC661(3μM) 또는 DMSO로 24시간 동안 처리했습니다. 우리는 DC661 치료가 MHC 클래스 I 및 면역프로테아좀 상향 조절의 발현을 증가시키지 않는다는 것을 발견했습니다(그림 7E 및 보충 그림 9, B 및 C).
그림 4. 카텝신 억제 또는 칼슘 킬레이트화는 DC661-로 인한 세포 사멸을 예방하지 못합니다. (ㅏ)
T 세포 프라이밍에 대한 자가포식 억제의 효과를 이해하기 위해, 우리는 이전에 설명한 대로 C57BL6/J 비장 세포를 사용하여 시험관 내 프라이밍 및 공동배양 실험을 수행했습니다(31). 프라이밍을 위해 비장세포를 DC{3}} 또는 DMSO 처리 B16F10 또는 MC38 세포에 노출했습니다. 다음으로, 이러한 프라이밍된 비장세포를 살아있는 B16F10 또는 MC38 세포와 함께 배양하고 세포독성을 측정했습니다(그림 8A). DC{12}} 처리된 B16F10 세포로 프라이밍된 비장세포는 DMSO 처리된 B16F10 세포에 노출된 비장세포와 비교하여 IFN-의 상당한 증가를 나타냈습니다. 증식하는 B16F10 세포의 프라이밍된 T 세포 매개 사멸은 DMSO 프라이밍된 비장 세포와 비교할 때 DC{21}}프라이밍된 비장 세포에서 유의하게 증가했습니다(그림 8, B 및 C). DC661로 처리된 MC38 세포는 B16F10 세포와 비교할 때 훨씬 더 많은 IFN- 및 프라이밍 T 세포 세포독성을 나타냈습니다(그림 8, D 및 E). DC661을 사용한 NAC 공동치료는 비장세포로부터 IFN-방출을 완전히 폐지하고 프라이밍된 T 세포 세포독성을 둔화시킬 수 있었습니다(그림 8, F 및 G). MC38 세포에서 siCalr에 의한 칼레티쿨린의 녹다운(보충 그림 9D)은 DC661 치료의 프라이밍 효능을 폐지하고 프라이밍된 T 세포 세포 독성을 크게 감소시켰습니다(그림 8, H 및 I). 종합적으로 말하자면, 이러한 데이터는 항종양 세포 T 세포 면역 촉진에 있어 LLP 관련 CALR 상향 조절의 기계적 역할을 뒷받침합니다. 다음으로, 우리는 이러한 시험관 내 연구 결과를 면역 능력이 있고 면역 결핍된 마우스 모델을 대상으로 한 생체 내 항종양 예방 접종 연구로 확대했습니다. 이 분석을 위해 시험관 내 동결 해동 또는 DC{40}} 처리된 B16F10 또는 MC38 세포를 왼쪽 옆구리에 피하 주사하여 면역 능력이 있는 C57BL/6 또는 NOD/SCID 마우스가 주입된 동일한 종류의 살아있는 종양 세포에 대한 재공격으로부터 보호했습니다. 7일 후 오른쪽 측면으로 이동합니다(그림 9A). DC661- 처리된 B16F10 세포는 시험관 내 분석에도 불구하고 종양 거부를 예방하지 못했으며, 이는 DC661이 면역원성 세포 사멸을 유도했음을 시사합니다(그림 9B 및 보충 그림 9E). 대조적으로, 한쪽 측면에 DC661- 처리된 MC38 세포를 접종하면 반대쪽 측면에 이식된 살아있는 MC38 세포의 완전한 거부가 촉진되었습니다(그림 9C 및 보충 그림 9F). DC661이 MC38 종양에 미치는 것으로 보이는 백신 효과에 적응성 면역이 중요한지 확인하기 위해 NOD/SCID 마우스에서 실험을 반복했습니다. 놀랍게도, 우리는 DC661- 처리된 MC38 세포가 면역 결핍 NOD/SCID 마우스에서 재공격 종양의 거부를 유도하지 않는다는 것을 발견했습니다(그림 9D 및 보충 그림 9G). 이는 관찰된 백신 효과에 적응 면역이 필요함을 나타냅니다. 이 발견의 견고성을 테스트하기 위해 우리는 잘 알려진 또 다른 면역원성 마우스 암 세포주인 CT26을 선택하고 위와 같이 백신 접종 실험을 수행했습니다. 예상한 대로, 마우스의 한쪽 측면에 DC{67}} 처리된 CT26 세포를 이식하면 백신과 유사한 효과가 발생하고 다른 측면에 이식된 살아있는 CT26 세포의 성장을 방지했습니다(그림 9E 및 보충 그림 9H). 우리의 연구 결과는 DC{73}} 유도된 LLP가 LMP 매개 면역원성 세포 사멸에 중요하며, 이는 리소좀 수송체 MFSD12에 의해 시스테인이 리소좀으로 유입됨에 따라 역전된다는 것을 시사했습니다(그림 9F).
논의
리소좀 억제는 전임상 연구에서 유망한 치료 접근법인 것으로 보이며, HCQ 임상 시험은 고무적이지만 혼합된 결과를 가져왔습니다(1, 32). PPT1은 HCQ의 분자 표적이며 DC661(2) 및 GNS561(3)과 같은 보다 강력한 PPT1 억제제는 시험관 내에서 LMP 매개 세포 사멸을 유도합니다. 리소좀 세포 사멸의 정확한 메커니즘과 종양 면역원성에서의 역할은 완전히 밝혀지지 않았습니다. 자가포식 억제를 면역요법과 결합하면 항종양 면역이 강화됩니다(9, 10, 31). 자가포식 억제 후 세포 고유의 면역원성에 대해 제안된 메커니즘에는 MHC 클래스 I 및 면역프로테아좀 상향 조절이 포함되며, 둘 다 개선된 항원 처리 및 제시를 지원합니다. 또한, 자가포식 단백질의 손실 또는 클로로퀸에 의한 자가포식 억제는 수지상 세포에서 MHC 클래스 I의 표면 수준을 증가시켜 CD{13}} T 세포 반응을 증가시켰습니다(33). 우리는 이전에 전신 PPT1 억제가 대식세포를 M2에서 M1 표현형으로 재분극할 수 있음을 보여주었습니다. PPT1 억제제는 STING 수준을 향상시켜 흑색종 모델에서 IFN 방출 및 T 세포 매개 사멸을 증가시킬 수 있습니다(31). 여기에서 우리는 LLP 자체가 종양 세포 고유의 면역원성 형태의 세포 사멸을 생성한다는 것을 입증했습니다. 우리는 리소좀 억제가 암세포에서 단백질 변화를 거의 유발하지 않았으며, 가장 유의하게 증가된 단백질에는 자가포식 화물 수용체 및 세포사멸 조절제가 포함되어 있음을 발견했습니다. 기능 전반에 걸쳐 이러한 유전자 중 일부를 표적으로 삼는 우리의 접근 방식은 약물 유발 단백질이 세포 사멸의 주요 조절 인자가 아닐 가능성이 있음을 보여주었습니다. ULK1 또는 ATG7의 유전적 억제도 DC661 세포독성을 구제하지 못했습니다. 우리는 리소좀 억제가 세포 사멸, 괴사, 페롭토시스 및 파이롭토시스를 포함한 여러 형태의 프로그램된 세포 사멸을 활성화하지만 이들 각각은 약물 유발 세포 독성에 필요하지 않다는 것을 입증했습니다. 주목할 만한 점은 프로그램된 세포 사멸 메커니즘이 겹칠 수 있으며 다중 세포 사멸 메커니즘의 공동 표적화는 리소좀 막 투과성화 이후 세포 사멸에 대한 세포 보호를 제공할 수 있다는 것입니다. 우리의 연구는 리소좀 세포 사멸에 대한 카텝신 및 칼슘 의존성 메커니즘을 배제하고 세포 사멸의 중요한 결정 요인으로서 LLP의 중요성을 강조했습니다. 우리는 리소좀으로 운반되는 항산화제인 NAC에 의해 가역적이며 리소좀 막 투과성 및 세포 독성에 중요한 LLP의 증거를 발견했습니다. NAC는 DC{27}}로 인한 세포 사멸을 완화하거나 역전시킬 수 있는 유일한 물질이었으며, 이 능력은 리소좀 시스테인 운반체 MFSD12의 존재에 따라 달라졌습니다. 리소좀 침투의 부족은 다른 추정 지질 과산화 억제제인 Trolox와 비타민 C가 DC661 세포 독성을 예방할 수 없는 이유일 가능성이 높습니다. NAC는 시스테인으로 전환되어 리소좀으로 유입되어 이황화물 형태인 시스틴으로 산화됩니다. 시스틴은 또 다른 리소좀 수송체인 시스틴증에 의해 세포질로 내보내지며, 그곳에서 내부 영양원을 재이동하고 라파마이신 복합체 1의 표적을 재활성화하며 자가포식을 촉진하는 시스테인으로 환원됩니다(34). 시스테인이 시스틴(리소좀)으로 그리고 다시 시스테인(세포질)으로 돌아가는 이러한 산화-환원 순환은 NAC가 치료적으로 유용한 것으로 입증된 다른 질병 상황에서 DC661 세포 독성 또는 보다 일반적인 리소좀 손상에 대한 NAC의 가능한 구조 메커니즘일 수 있습니다(35) . NAC는 DC{35}}유발 LLP 및 LMP를 역전시켰을 뿐만 아니라 면역원성 세포 사멸 표지인 칼레티쿨린의 표면 발현도 역전시켰습니다. CALR 단백질의 세포 표면 발현은 DC{36}} 프라이밍된 비장 세포에 의해 유도된 강화된 T 세포 매개 세포독성에 필요하며, 이는 리소좀 억제가 특정 형태의 세포 고유 면역원성을 생성한다는 것을 입증합니다.
이전 연구에서 리소좀 억제가 확립된 옆구리 종양에서 면역 체크포인트 억제의 항종양 활성을 향상시킬 수 있음을 입증한 반면(9, 31), 우리의 연구는 B16 종양이 아닌 MC38 종양에 대한 백신 유사 효과를 입증한 최초의 지식입니다. 이식 전에 DC661로 전처리된 종양 세포. 이는 리소좀 세포 사멸이 세포 고유의 면역원성을 유도할 수 있음을 보여 주지만, 이러한 변화 자체로는 "면역이 차가운" 종양 미세환경을 "면역이 뜨거운" 종양 미세환경으로 반전시키기에는 충분하지 않습니다. "면역 감기" 종양 미세 환경 모델 B16 및 BRafCA PtenloxP Tyr: CreERT2 유전자 조작 마우스 모델(31)에 대한 이전 연구에서는 전신 리소좀 억제가 종양 관련 대식세포 및 골수성 세포 유래 억제 세포에 효과를 나타냄을 입증했습니다. 면역치료의 효능. 세포 고유의 면역원성은 리소좀 억제 이후 ICD에 더욱 반응하게 되는 이러한 면역성 저온 종양에서도 역할을 하는 경우일 수 있습니다. 통제된 실험실 환경에서 관찰된 리소좀 억제의 백신과 유사한 효과는 임상으로 해석될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있지만, 이전에 치료받은 BRAF 돌연변이 흑색종에서 다브라페닙, 트라메티닙 및 HCQ로 치료받은 일부 환자가 왜 그토록 깊고 지속적인 효과를 보였는지 설명할 수 있습니다. 이 요법에 응답하십시오 (32). PPT1 억제가 어떻게 리소좀 ROS와 지질 과산화를 생성하는지 이해하려면 추가 연구가 필요합니다. V-ATPase 및 리소좀 산성화에 대한 PPT1-의존적 조절은 바필로마이신이 리소좀 산성화를 억제하지만 LMP를 생성하지 않기 때문에 충분한 설명이 아닙니다(데이터는 표시되지 않음). 이러한 발견의 의미는 종양 세포 고유의 면역원성을 강화하는 리소좀 억제제가 T 세포 활성화 또는 종양 미세 환경으로의 침투를 강화하는 치료법과 합리적으로 결합되어 잠재적으로 시너지 효과를 낼 수 있음을 시사합니다.
그림 5. N-아세틸 시스테인은 DC661-로 인한 세포 사멸을 예방합니다. (ㅏ)
행동 양식
세포 배양. 인간 A375P(CRL-3224), RKO(CRL-2577), DLD-1(CCL- 221), MIA PaCa-2(CRL-1420 ), A549(CRM-CCL-185) 및 마우스 B16F10(CRL-6475) 세포주는 ATCC에서 구입했습니다. 인간 A375(CRL-1619, ATCC), WM35, WM793 및 마우스 YUMM1.7(WT, Gsdme EV, Gsdme KO1 및 KO2) 라인을 사내에서 확보했습니다. 마우스 MC38 및 CT26 세포는 펜실베니아 대학의 Andy Minn에 의해 제공되었습니다. FL5.12 및 IL-3 의존 Bax-/-Bak-/-(Bax/Bak DKO) 일차 골수 세포는 펜실베니아 대학교의 Kathryn E. Wellen으로부터 입수했습니다. 인간 Panc-1(CRL-1469, ATCC) 세포주는 펜실베니아 대학의 Ben Z. Stanger가 제공했습니다. 마우스 YUMMER 1.7 세포주는 펜실베이니아 대학교의 Xiaowei (George) Xu로부터 입수했습니다. 모든 세포주는 펜실베니아 대학 핵심 시설에서 2년마다 마이코플라스마에 대해 테스트되었으며 Wistar Institute Genomics 코어의 단기 반복 지문 채취를 사용하여 인증되었습니다. A375P, RKO, DLD-1, A549, CT26, FL5.12 및 Bax/Bak DKO 세포주는 RPMI 1640(Invitrogen, 11875)에서 배양되었습니다. A375, MIA PaCa-2, Panc-1, B16F10 및 MC38 세포주를 DMEM에서 배양했습니다(Invitrogen, 11995). 및 YUMMER1.7, YUMM1.7 WT, Gsdme EV, Gsdme KO1 및 KO2) 세포(15)를 DMEM/F12 50/50(Corning, 10-092-CV)에서 배양했습니다. 배양 배지에는 10% 소 태아 혈청(12306C, MilliporeSigma) 및 1X 항생제 항진균 용액(Gibco, 15140-122)이 보충되었습니다. FL5.12 및 Bax/Bak DKO 세포주는 50μM -머캅토에탄올(Life Technologies, 21985-023), 10mM HEPES(H3537, MilliporeSigma), 0.35ng/mL 및 3.5ng가 보충된 완전한 RPMI 배지에서 유지되었습니다. /mL IL-3 각각. YUMMER1.7 및 YUMM1.7(WT, Gsdme EV 및 Gsdme KO) 세포주는 1× MEM NEAA(Gibco, 11140-050)가 보충된 완전 배지에서 유지되었습니다. WM35 및 WM793 세포를 1X Leibovitz L-15 배지(Corning, 10-045-CV)에 10% FBS, 7.5% w/v 중탄산나트륨( Corning, 25-035-CI), 1× 항생제 항진균 용액(Gibco, 15140-122) 및 5 ug/mL 인슐린(MilliporeSigma, I0516). 세포는 5% CO2 존재 하에 37도에서 성장했습니다. 화학물질 및 시약. 구입한 화학물질에는 HCQ Sulfate(Spectrum Chemicals, 747-36-4) 및 DC661(Selleckchem, S8808)이 포함되었습니다. 제조사의 지침에 따라 Fluo{100}, AM(Thermo Fisher Scientific, F14201)을 사용하여 칼슘에 대한 세포 염색을 실시했습니다. 항체 및 억제제 목록은 보충 표 1 및 보충 표 2에 제공됩니다.
그림 6. NAC는 MFSD12-에 따라 LLP를 반전시킵니다. (A~C)
단백질체학을 위한 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법 분석을 위한 단백질 추출 및 분해. {{0}}.7 × 106 A375P 흑색종 세포를 60 mm 배양 접시에서 배양했습니다. 세포를 DMSO(대조군), DC661(3μM), HCQ(10μM) 또는 HCQ(3{{70}} μM)로 24시간 동안 약 5{{ 112}}% 합류. 냉동 세포 펠릿을 50mM Tris pH 7.4, 1% SDS, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 0.15mM PMSF, 1ug/mL 펩스타틴, 및 1 ug/mL 류펩틴. 정화된 용해물(각각 10 ug)을 bis-tris 겔 내로 0.5 cm 전기영동한 후 콜로이드성 Coomassie로 고정하고 염색했습니다. 각각의 0.5cm 겔 레인을 잘라내고 탈색하고 트리스({27}}카르복시에틸) 포스핀으로 환원시키고 요오도아세트아미드로 알킬화한 다음 이전에 설명한 대로 트립신으로 분해했습니다(36). 다이제스트(1ug)는 nanoAQUITY UPLC(Waters)에 맞춰 Q-Exactive Plus 질량 분석기(Thermo Fisher Scientific)에서 액체 크로마토그래피-직렬 질량 분석기(LC-MS/MS)로 분석되었습니다. 분석 분리는 1.7μm × 250mm 펩티드 BEH C18 컬럼(Waters, 186003546)에서 다음과 같이 물(이동상 A) 및 아세토니트릴(이동상 B)에 용해된 0.1% 포름산의 245-분 구배를 사용하여 수행되었습니다. : 225분 동안 5%–30% B, 5분 동안 30%–80% B, 80% B에서 15-분 유지하고 초기 조건으로 돌아갑니다. 전체 MS 스펙트럼은 70,000 분해능, 스캔 범위 400–2,000 m/z, 자동 이득 제어 목표 3 × 106 이온 및 최대 주입 시간으로 획득되었습니다. 50밀리초. 데이터 종속 MS2 스펙트럼은 17,500 분해능, 1.5m/z의 격리 폭, 5 × 104 이온의 자동 이득 제어 목표 및 50밀리초의 최대 주입 시간으로 가장 풍부한 상위 20개 이온에 대해 수집되었습니다. 펩타이드 일치는 우선으로 설정되었으며 할당되지 않은 단일 전하 이온은 거부되었습니다(37). 원시 MS 데이터는 Uniprot 인간 서열 데이터베이스(2019년 10월 10일 액세스) 및 트립신, 케라틴, 소 단백질, 및 마이코플라스마(38). 최대 2개의 누락된 절단, 시스테인의 고정 변형(카르바미도메틸화) 및 가변 메티오닌 산화 또는 N-말단 아세틸화를 갖는 트립신 펩티드 특이성이 검색에 사용되었습니다(39). 펩타이드와 단백질에는 1% FDR 컷오프가 사용되었습니다. 실행 간 일치가 활성화되었습니다. 단백질은 라벨 없는 정량법을 사용하여 정량화되었습니다(40). 통계 분석은 Perseus 1.6.2.3(https://maxQuant.net/perseus/)을 사용하여 수행되었습니다(41, 42). 단백질은 샘플 그룹 내에서 최소 3개의 고유한 펩타이드로 식별되어야 하고 3개의 유효한 값(0이 아닌 정량)을 가져야 하며, 오염물질과 역단백질은 데이터 세트에서 필터링되었습니다. 누락된 값은 정규 분포에서 대치되었습니다. s0=0.1 및 250 무작위화를 사용하는 순열 기반 FDR을 사용하는 2-꼬리 스튜던트 t-검정을 사용하여 조건 간 쌍별 비교를 단백질 수준에서 수행했습니다. 중요한 변화는 지정된 대로 FDR이 5% 미만이고 절대 배수 변화가 1.5 또는 2.0을 초과하는 것으로 정의되었습니다. 리소-IP. A375P 세포를 pLJC5-Tmem192-3xHA 렌티바이러스로 감염시키고 1mg/mL 퓨로마이신(MilliporeSigma, P4512)을 사용하여 선택했습니다. 대략 3 x 106개의 HA-태그된 A375P 세포를 이전에 설명한 배양 조건에서 24시간 동안 10mM NAC 또는 물 비히클 대조군으로 처리했습니다. 처리 후, 세포를 PBS로 세척하고, 0.5mL의 차가운 KPBS에서 수확하고, 2mL Dounce 균질화기에서 20회 스트로크를 사용하여 부드럽게 균질화했습니다. 균질액의 약 2.5%는 전체 세포 용해물 분석을 위해 남겨졌고 나머지는 세포막 잔해를 제거하기 위해 3,{120}}g에서 4도에서 2분간 원심분리되었습니다. 그런 다음 균질액 상청액을 깨끗한 1.5mL 튜브로 옮기고 50μL 항-HA 비드(Pierce, 88836) 또는 항-DDK/Flag 비드(OriGene, TA150042)와 함께 4도에서 15분 동안 배양했습니다. 그런 다음 샘플을 DynaMag(Thermo Fisher Scientific, 12321D)에 튜브를 놓고 침전시키고 실온에서 2분 동안 부드럽게 흔들어주었습니다. 상청액은 결합되지 않은 분획 분석을 위해 예약되었습니다. IP를 8mM CaCl2가 포함된 KPBS로 3회 세척했습니다. 대사체학 분석을 위해 Lyso-IP를 80% MeOH에서 추출했습니다. 글로벌 리피돔에 대해 LC-MS/MS를 사용한 지질 추출 및 분석. 흑색종 A375P 세포를 접시당 0.7 x 106개 세포로 60mm 접시에 접종했습니다. 세포가 약 50% 합류했을 때 DMSO(대조군), DC661(3μM) 또는 HCQ(30μM)로 24시간 동안 처리했습니다. 세포를 HBSS로 2회 세척하고 얼음처럼 차가운 메탄올로 긁어낸 다음 EquiSPLASH 내부 지질 표준(Avanti Polar Lipids)이 포함된 클로로포름/메탄올/0.88% NaCl(2:1:1)을 사용한 지질 추출을 위해 유리 튜브로 옮겼습니다. 샘플을 와동시킨 후 얼음 위에서 5분간 수조에서 초음파 처리했습니다. 500g에서 40도에서 15분간 원심분리한 후, 하부 상을 다른 유리관으로 옮겼다. 상부상은 합성 하부상을 사용하여 재추출되었다. 초음파 처리 및 원심분리 후, 하부 상을 첫 번째 하부 상 수집과 합쳤습니다. 샘플을 질소하에 건조시키고, 10% 클로로포름/90% 메탄올에 재현탁시킨 후 유리 LTQ 바이알에 옮겼습니다. 지질 샘플은 Thermo Fisher Scientific QExactive HF-X 질량 분석기 및 Vanquish Horizon UHPLC 시스템에서 분석되었습니다. 분석 분리에는 50:50 아세토니트릴/물 및 88:10:2 이소프로판올/아세토니트릴/물이 포함된 Accucore C30 컬럼(2.1mm × 150mm, Thermo Fisher Scientific)이 사용되었으며, 각 컬럼에는 5mM 포름산암모늄과 0.1% 포름산이 포함되어 있습니다. LC-MS/MS 데이터는 다음 기기 매개변수를 사용하여 양극 및 음극에서 별도로 획득되었습니다: MS1 스캔 120,000 분해능; 15,{184}} 분해능에서 가장 풍부한 상위 20개 이온에 대한 데이터 종속 MS2; 0.4m/z 절연 폭; 계단형 정규화 충돌 에너지는 20:30:40(43)입니다.
그림 7. N-아세틸 시스테인은 DC661-유발 칼레티쿨린 표면 발현을 방지합니다. (기원 후)
LipidSearch 4.2(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 지질을 식별하고 정량화했습니다. 확인된 지질 종은 클래스에 따라 예상되는 부가물 및 식별 등급에 따라 필터링되었습니다. 피크 영역은 지원되는 클래스에 대해 EquiSPLASH 표준으로 정규화되었으며, 세포 수의 변화를 수정하기 위해 각 샘플의 전체 영역을 기반으로 추가로 정규화되었습니다. Perseus 1.6.2.3(https://maxQuant.net/perseus/)을 사용하여 로그 변환된 데이터에 대한 통계 분석을 수행했습니다(41, 42). Metabalone에 대한 LC-MS/MS를 이용한 대사산물 추출 및 분석. 극성 대사산물은 80% 메탄올을 사용하여 전체 세포, Lyso-IP 비결합 분획 및 Lyso-IP 결합 샘플에서 추출되었으며 액체 크로마토그래피 이전에 -8{{3{39}}}}도에서 보관되었습니다. –질량분석법(LC-MS) 분석. Thermo Vanquish Horizon UHPLC 시스템에 맞춰 HESI II 프로브가 있는 Thermo Scientific Q-Exactive HF-X 질량 분석기를 사용하여 추출물을 LC-MS로 분석했습니다. LC 분리는 유속으로 45도에서 유지되는 ZIC-HILIC 가드 컬럼(2.1mm x 20mm, EMD Millipore)이 있는 ZIC-HILIC 컬럼(2.1mm x 150mm, 입자 크기 5μm, EMD Millipore)을 사용하여 수행되었습니다. 0.2mL/분. 티올기의 반응성을 감소시키기 위해 산성 조건에서 크로마토그래피를 수행했습니다. 이동상 A는 물이었고 B는 아세토니트릴이었으며 둘 다 0.1% 포름산을 함유했습니다. LC 구배는 2분 동안 85% B, 15분 동안 85% B에서 20% B, 0.1분 동안 20% B에서 85% B, 8.9분 동안 85% B였습니다. 자동 샘플러는 4도로 유지되었으며, 각 분석마다 4μL의 샘플이 주입되었습니다. 다음 MS 매개변수가 사용되었습니다: 외장 가스 유속, 40 AU; 보조 가스 유량, 10 AU; 스윕 가스 유량, 2 AU; 보조 가스 히터 온도, 350도; 스프레이 전압, 포지티브 모드의 경우 3.75kV, 네거티브 모드의 경우 3.5kV; 모세관 온도, 375도; 깔때기 RF 수준, 40%. 모든 샘플은 극성 전환 기능을 갖춘 전체 MS로 분석되었습니다. 전체 MS 스캔은 1 × 106 이온의 자동 이득 제어 목표와 100밀리초의 최대 주입 시간을 사용하여 120000 분해능에서 65~975m/z에서 획득되었습니다. 원시 데이터는 TraceFinder 4.1(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 분석되었습니다. 표적 대사산물은 분석 표준을 기반으로 선호하는 극성의 정확한 질량과 머무름 시간을 통해 식별되었습니다. 피크 검출은 평활화 1의 ICIS 알고리즘을 사용했습니다. 상대 정량화는 통합된 피크 면적을 사용하여 수행되었으며, 이 값은 샘플당 총량(총 피크 면적으로 정의됨)으로 보정되었습니다. PPT1-CRISPR/Cas9 편집. A375P PPT1-비표적 및 KO 세포는 이전에 설명한 대로 준비되었습니다(44). pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)는 Feng Zhang(Addgene 플라스미드, 48139)의 선물이었습니다. 가이드 RNA 올리고(IDT)를 어닐링하고 인산화한 다음 Addgene을 통해 이용 가능한 Zhang 실험실 프로토콜에 따라 BbsI 분해 및 탈인산화된 pX459 플라스미드에 연결했습니다. 결찰된 플라스미드를 Stbl3 세포(Invitrogen)로 형질전환시켰다. 플라스미드 준비의 서열 분석을 통해 원하는 가이드 RNA 서열의 존재를 확인했습니다. A375P 세포를 Lipofectamine 3{164}}(Invitrogen, L3000015)을 사용하여 형질감염시킨 후 퓨로마이신을 선택했습니다. Surveyor 분석에서는 CRISPR/Cas9에 의한 PPT1 유전자의 편집을 확인했으며, PPT1 항체(Origene)를 사용한 웨스턴 블롯팅을 통해 PPT1 녹다운을 확인했습니다. 가이드 RNA 올리고의 서열은 다음과 같습니다: 비표적 가이드 RNA 정방향(CACCGTAGCGAACGTGTCCGGCGT), 비표적 가이드 RNA 역방향(AAACACGCCGGACACGTTCGCTAC), 인간 PPT1 가이드 RNA 1 정방향(CACCGTTTGGACTCCTCGATGCCC), 인간 PPT1 가이드 RNA 1 역방향(AAACGGGCATCGAGGGAGTCCAAA), 인간 PPT1 가이드 RNA 3 정방향(CAACCGCCTCGTGCAAGCCGAATAC) 및 인간 PPT1 가이드 RNA 3 역방향(AAACGTATTCGGCTTGCACGAGGC). 본 문서에 사용된 단일 세포에서 성장한 클론에는 다음이 포함됩니다: 클론 C8은 인간 가이드 1이고 클론 B5는 인간 가이드 3입니다. 면역블로팅. 100만 개의 세포를 10 cm 접시에 플레이팅하고 다음날 처리를 실시했습니다. 세포를 긁어서 수집했습니다. 전체 세포 용해물은 SDS 용해 완충액을 사용하여 준비되었습니다. 단백질 농도는 Pierce BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific, 23225)를 사용하여 측정되었습니다. 30-50 ug 단백질을 SDS-PAGE에 사용하고 PVDF 멤브레인(Bio-Rad, 1620177)으로 옮겼습니다. 최적화된 조건에 따라 5% BSA 또는 5% 탈지유를 사용하여 막을 차단하고 4도에서 밤새 1차 항체와 함께 배양했습니다. PVDF 막을 1× TBS-T(Cell Signaling Technology Inc., CS{111}})로 세척하고 종 특이적 HRP 결합 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 배양했습니다. 이후 막을 세척하고 Pierce ECL Western Blotting 기판(Thermo Fisher Scientific, 32106) 및 자동방사선 촬영 필름(Lab Scientific Inc., XAR ALF 1318)을 사용하여 현상했습니다. 파이롭토시스 연구를 위해 단백질 용해물을 SDS-PAGE로 분리하고 PVDF 막으로 옮겼습니다. 5% BSA에서 차단한 후, PVDF 막을 지정된 1차 항체와 함께 4도에서 밤새 배양하고 PBS/Tween에서 세척한 다음 퍼옥시다제 결합 2차 항체와 함께 배양했습니다. HRP 결합 2차 항체(CalBioTech), 화학발광 기질(Thermo Fisher Scientific) 및 ChemicDoc MP 이미징 시스템(Bio-Rad)을 사용하여 면역반응성을 검출했습니다. 상청액을 포함하는 실험의 경우, SDS-PAGE의 왜곡을 피하기 위해 세포를 FBS가 없는 배지에서 배양했습니다. 세포 상층액을 수확하고 4도에서 500g으로 10분간 원심분리하여 세포 잔해를 제거했습니다. 생성된 상층액을 Amicon Ultra 10K(MilliporeSigma)를 사용하여 4도에서 30분 동안 4,500g에서 원심분리하여 10배 농축했습니다. 농축물을 샘플 완충액과 혼합하고 위에서 설명한 대로 웨스턴 블롯팅을 통해 분석했습니다. Ponceau red 염색을 이용하여 단백질 겔 염색을 수행하였다. LMP 및 카텝신 L 활성 분석. 인간 pEGFP-hGal3 플라스미드는 Tamotsu Yoshimori(Addgene 플라스미드, 73080)로부터 선물로 받았으며 A375P-Galectin{139}} 계열을 만드는 데 사용되었습니다. pEGFP-C1 대조 플라스미드 벡터 백본을 구입했습니다(novo prolabs, V012024). 제조업체의 프로토콜에 따라 Lipofectamine 2000(Invitrogen, 11668019)을 사용하여 플라스미드를 A375P 세포에 형질감염시켰습니다(1ug/mL). 형질감염된 세포는 G418(Gibco, 10131035)을 사용하여 안정적으로 선택되었습니다. LMP의 경우 여러 이미지 필드에서 총 25개의 A375P-갈렉틴-3 점점 양성 세포가 계산되었습니다. 점상 양성 세포의 비율은 각 분야별로 별도로 계산하였고, 각 그룹에 대한 평균 비율을 계산하였다. Magic Red Cathepsin L 분석 키트(Abcam, ab270774)는 제조업체의 프로토콜에 따라 사용되었습니다. 세포는 Zeiss Axio Observer 7 역현미경으로 이미지화되었습니다. Magic Red 원시 통합 강도는 Fiji - ImageJ 소프트웨어(NIH)를 사용하여 계산되었습니다. MTT(3-[4, 5-디메틸티아졸-2-yl]-2, 5 디페닐 테트라졸륨 브로마이드) 세포 생존력 분석. 2,000개의 세포를 96-웰 플레이트의 각 웰에 3중으로 플레이팅하고 3-일 MTT 분석은 제조사의 프로토콜에 따라 Cell viability Kit(Roche, 11465007001)을 사용하여 수행했습니다. 억제제 전처리를 1시간 동안 실시한 후 DC661이 있거나 없는 억제제로 세포를 공동 처리했습니다. 비선형 회귀(곡선 맞춤) 방법을 사용하여 IC50을 계산했습니다.
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콜로니 형성 분석. 웰당 2,000개의 세포를 6-웰 플레이트에 접종하고 다음날 처리했습니다. 세포를 총 8일 동안 처리하에 유지하였다. 각 웰에 형성된 콜로니를 PBS로 세척한 후 -20도의 차가운 메탄올로 20분간 고정한 후 크리스탈 바이올렛 0.5% 수용액(V5265; MilliporeSigma)으로 염색하였다.
Trypan blue 염료 배제 분석. Trypan blue 분석을 위한 반응 혼합물은 0.4% Trypan blue(25- 900-CI, Corning) 1부와 희석된 세포 시료 1부를 혼합하여 제조되었습니다. 혼합물을 1분 동안 배양하고 Cellometer Vision(Nexcelom, Vision-310-0208)에서 세포 수를 계산했습니다.
그림 8. DC661- 유도된 칼레티쿨린 표면 발현은 종양 세포에 대해 T 세포를 프라이밍합니다. (ㅏ)
그림 9. DC661- 처리된 세포를 접종하면 특정 상황에서 종양 거부반응이 발생합니다. (ㅏ)
FOAM-LPO. LLP는 형광 프로브인 FOAMLPO를 사용하여 연구되었습니다. FOAM-LPO는 이전에 설명한 대로 합성되었습니다(26). 세포를 8 웰 μSlide(ibid, 80807)에서 배양하고 DC661이 있거나 없는 억제제로 처리했습니다. 세포를 5% CO2 및 95% 공기 분위기에서 FOAM-LPO(1M)를 함유한 배지와 함께 37도에서 5분간 배양했습니다. 세포를 배지로 2회 세척한 후 세포를 현미경(Zeiss Axio Observer 7 도립현미경)으로 관찰하여 LLP에 반응하여 586에서 512 nm로 이동하는 형광을 검출했습니다. qRT-PCR 및 프라이머. A375P(3×105) 세포를 60mm 접시에 배양하고 DMSO 또는 DC661(3μM)로 24시간 동안 처리하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 RNA 분리 키트(QIAGEN, 74134)를 사용하여 전체 RNA를 분리했습니다. 제조업체의 프로토콜(Thermo Scientific, K1642)에 따라 500ng의 정제된 RNA가 포함된 iScript Reverse Transcriptase 키트를 사용하여 cDNA를 합성했습니다. qPCR 반응은 1 μL cDNA가 포함된 SYBR Green PCR Master Mix(BioRad, 1725121)를 사용하여 설정되었습니다. 모든 측정은 3회 반복 수행되었으며 BACTIN은 ΔCT 계산을 위한 내부 표준으로 사용되었습니다. 유전자 발현 분석은 다음 프라이머를 사용하여 수행되었습니다: PTGS2/COX-2 정방향(CGGTGAAACTCTGGCTAGACAG), PTGS2/COX-2 역방향(GCAAAACCGTAGATGCTCAGGGA), CARS 정방향(CTGGACTACTCCAGCAACACCA), CARS 역방향(GACCAGTGATGTCAACAGGAGC), CHAC1 정방향 (GTGGTGACGCTCCTTGAAGATC), CHAC1 역방향(GAAGGTGACCTCCTGGTATCG), BACTIN 순방향(CAACTGGGACGACATGGAGAAAAT) 및 BACTIN 역방향(CCAGAGGCGTACAGGGATAGCAC).
siRNA 형질감염. 인간 ULK1, ATG7, TAX1BP1, BNIP3, PPT1 및 MFSD12에 대한 유전적 녹다운 연구는 A375P 세포주에서 수행되었습니다. 마우스 Ppt1 및 Calreticulin에 대한 유전적 억제 연구를 MC38 세포에서 수행했습니다. 비표적 siRNA(sc{{1{152}}}}), 인간 ULK1(sc-44182), ATG7(sc-41447), TAX1BP1/T6BP(sc-106831), BNIP3 (sc{{20}}), PPT1/CLN1(sc-105216), MFSD12(sc-97888), 마우스 Ppt1/Cln1(sc-142398) 및 Calreticulin /Calregulin(sc-29895) siRNA는 Santa Cruz Biotechnology에서 구입했습니다. 이러한 siRNA는 3~5개의 표적 특이적 siRNA 풀로 구성됩니다. 유세포 분석. Ferroptosis 유도는 C11- BODIPY(BODIPY 581/591 C11, Thermo Fisher Scientific, D3861)를 사용하여 측정되었습니다. A375P 세포를 6-웰 플레이트에 시딩하고 DMSO, 페로스타틴{{4{177}}}}(10 μM), 립 록스타틴-1(2 μM), 엘라스틴(5 μM)으로 처리했습니다. ), DC661(3μM) 또는 조합하여 24시간 동안 사용합니다. 300g에서 5분간 원심분리하여 세포를 수확했습니다. 세포를 1 μM C11-BODIPY가 포함된 500 μL 1X HBSS(Corning, 21-023-CV)에 재현탁하고 37도에서 15분 동안 배양했습니다. 세포를 펠릿화하고 500 μL 1X HBSS에 재현탁시키고, 530/30 Blue(University of Pennsylvania Flow Core Facility)를 사용하여 BD LSRII 세포계측기에서 형광 강도를 측정했습니다. 면역원성 세포 사멸을 위한 칼레티쿨린의 세포 표면 발현 정량은 이전에 설명한 대로(45) 유세포 분석법으로 수행되었습니다. B16F10 또는 MC38 세포를 배양하고 NAC(10mM) 또는 DC661(3μM)로 24시간 동안 처리했습니다. MC38 세포를 10mM NAC의 존재 또는 부재하에 24시간 동안 siPpt1 또는 siNT로 48시간 동안 처리하였다. 세포를 CALR 항체(Cell Signaling Technology, 12238), Alexa Fluor 647 염소 항토끼 2차 항체(Invitrogen) 및 요오드화 프로피듐(PI)(Biolegend, 421301)으로 염색했습니다. 염색된 샘플은 710/50 Blue 및 670/30 Red를 사용하여 각각 PI 및 CALR 형광을 포착하는 BD LSRII 유세포 분석기(펜실베니아 대학 Flow Core 시설)에서 수집되었으며 분석은 CALR 양성 및 PI 음성 세포로 제한되었습니다. 위양성 이벤트를 방지합니다. T 세포 프라이밍 및 세포 독성 백분율. B16 또는 MC38 종양 세포(5×104)를 배양하고 NAC(10mM) 또는 DC661(1μM 또는 3μM)로 각각 24시간 동안 처리했습니다. Calr 유전적 억제를 위해 MC38 세포를 Calr siRNA 또는 비표적 siRNA(siNT)로 48시간 동안 처리한 후 DMSO 또는 3μM DC661로 24시간 동안 처리했습니다. 그런 다음 비장 세포를 IL{102}}(5 IU/mL) 존재 하에 B16 또는 MC38 세포 유무에 관계없이 DC661과 함께 배양하고 72시간 동안 공동 배양했습니다. 상층액의 IFN-ELISA(Biolegend, 430815)를 통해 프라이밍을 확인했습니다. 그런 다음 프라이밍된 비장세포를 B16 및 MC38 세포에 대해 각각 1:20 및 1:50의 표적 대 효과기(B16 또는 MC38 대 비장세포) 비율로 새로 배양된 B16 또는 MC38 세포와 공동 배양했습니다. B16 또는 MC38 세포 사멸과 관련된 LDH 방출 및 세포 독성 백분율을 제조업체의 프로토콜(MilliporeSigma, 4744926001)(31)에 따라 측정했습니다. 확립된 암 모델을 이용한 항종양 예방접종 분석 및 화학요법 연구. 6~8주령 암컷 WT C57BL/6 마우스, NOD/SCID 및 BALB/c 마우스는 The Jackson Laboratory에서 구입했습니다. 항종양 백신접종 실험을 위해, WT B16F10, MC38 및 CT26 세포를 175 cm2 플라스크에서 DC661(3 μM)로 36시간 동안 처리했습니다. 그런 다음, 상층액과 분리된 세포를 50 mL 팔콘 튜브에 수집했습니다. 세포를 원심분리하고 얼음처럼 차가운 PBS로 세척했습니다. 백신 접종을 위해 150 μL 세포 현탁액을 면역 능력이 있는 C57BL/6 마우스, 면역 결핍 NOD/SCID 마우스(1.8 × 104 B16F10 세포, 마우스당 1.5 × 106 MC38 세포) 또는 동계 BALB/c 마우스(3.0 × 106 마우스당 CT26 세포). PBS에 재현탁된 동결-해동 세포를 음성 대조군으로 주입했습니다. 1주일 후, 동일한 부피의 Matrigel(Corning, 354248)을 함유한 동일한 유형의 살아있는 암세포(마우스당 3×104 B16F10 세포, 2×105 MC38 세포 또는 5×105 CT26 세포)를 오른쪽 옆구리에 주입했습니다. 예방접종을 받은 쥐의 모습. 전자 캘리퍼를 사용하여 종양을 측정하고 부피를 L × W2 × 0.5로 계산했습니다. 종양 성장은 다음 날 동안 정기적으로 모니터링되었으며, 종양이 없는 것은 효율적인 항종양 백신접종의 표시로 간주되었습니다. NOD/SCID 마우스에서 DC661-MC38 백신 접종 연구가 반복되었습니다. 통계. 두 그룹을 비교할 때 Student's unpaired, 2-tailed t-test를 사용하여 통계적 유의성을 결정했습니다. 2개 이상의 그룹을 비교할 때는 1-방식 ANOVA 테스트를 사용했습니다. P 값이 0.05 미만이면 귀무 가설이 크게 기각되었습니다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. 연구 승인. 모든 동물 실험은 펜실베이니아 대학의 동물 관리 및 사용 위원회가 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
한약재 시스탄체 식물-항종양
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