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교모세포종 화학면역요법을 위한 종양 미세환경 반응성 나노약물의 CAR-호중구 매개 전달

Nov 27, 2023

교모세포종(GBM)은 인간에게 가장 공격적이고 치명적인 고형 종양 중 하나입니다. 다양한 암을 치료하기 위해 신흥 키메라 항원 수용체(CAR)-T 세포 및 화학요법제와 같은 효과적인 치료법이 개발되었지만 GBM 치료에서의 효과는 주로 혈액뇌장벽 및 혈액뇌종양 장벽으로 인해 방해를 받았습니다. 인간 호중구는 생리학적 장벽을 효과적으로 통과하고 병원체에 대한 이펙터 면역을 나타내지만, 일차 호중구의 수명이 짧고 게놈 편집에 대한 저항성으로 인해 면역 요법에서의 광범위한 적용이 제한되었습니다. 여기서 우리는 CRISPR/Cas9- 매개 유전자 녹인을 사용하여 인간 다능성 줄기 세포를 유전적으로 조작하여 T 특이적 CD3ζ 또는 호중구 특이적 신호 전달 도메인이 있는 다양한 항-GBM CAR 구축물을 발현합니다. 최고의 항종양 활성을 갖는 CAR 호중구는 종양 부위에 추가적인 염증을 유발할 필요 없이 GBM을 표적으로 하는 종양 미세환경 반응 나노 약물을 특이적이고 비침습적으로 전달 및 방출하기 위해 생산됩니다. 이 복합 화학 면역요법은 우수하고 구체적인 항GBM 활성을 나타내고, 표적 외 약물 전달을 감소시키며, 종양이 있는 암컷 쥐의 수명을 연장시킵니다. 이 생체모방 CAR-호중구 약물 전달 시스템은 GBM 및 기타 치명적인 질병을 치료하기 위한 안전하고 강력하며 다재다능한 플랫폼입니다.


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cistanche tubeulosa-항종양의 장점

교모세포종(GBM)은 높은 사망률, 짧은 수명, 높은 재발 경향과 함께 나쁜 예후를 특징으로 합니다1,2. 수술과 화학약물 모두의 치료 효능은 주로 미세 뇌 구조와 생리학적 혈액뇌장벽(BBB) ​​또는 혈액뇌종양 장벽(BBTB)에 의해 방해됩니다3-5. 특히, 뇌종양 치료를 위해 중추신경계(CNS)로 약물을 전달하는 것은 매우 어렵습니다.<1% of administered nanoparticle dose is found to be delivered to a solid tumor based on 376 published datasets6, and 0.8% delivered to brain cancer7. Due to their native capacity to migrate towards inflamed sites, traverse BBB/BBTB, and infiltrate solid tumors, mouse neutrophil-mediated delivery of nanoparticulated chemo drugs has been investigated to enhance targeted drug delivery to the brain tumors for improved therapeutic efficacy8–10. However, an invasive surgical resection of the tumor or tumor microenvironment priming is needed to induce additional inflammation for neutrophil recruitment before neutrophil/chemotherapeutic administration, leading to limited neutrophil recruitment in tumor sites beyond the inflamed surgical margin11. Furthermore, neutrophil-delivered chemotherapeutics were primarily enriched in the spleen, but not in the targeted brain of tumor-bearing mice. While necrosis was not observed in the major organs of experimental mice, there are still concerns regarding off-target tissue toxicity or even systemic toxicity in patients12. Previous studies also focused on mouse neutrophils. The feasibility and safety of using human neutrophils in drug delivery remain elusive since neutrophils have a short lifespan and are prone to apoptosis ex vivo. In addition, massive neutrophil extraction from pre-surgical patients for drug loading may lead to neutropenia or other risks. Thus, a safe and effective human neutrophil-mediated biomimetic drug delivery system that utilizes the natural chemo-attractive GBM microenvironment is urgently needed.

GBM을 포함한 다양한 암에 대한 호중구의 선천적 면역 및 가소성은 약물 전달에서 세포 운반체로서의 적용보다 덜 탐구되었습니다8-10. 저산소 종양 미세환경(TME)이 있는 혈액 내 순환 호중구는 암 진행 및 치료 저항에 기여하는 면역억제 TME의 필수 구성 요소인 이종 종양 관련 호중구(TAN)가 됩니다. 대식세포와 유사하게 TAN의 항종양 N1 및 전종양 N2 표현형이 저산소 TME18-21 내에서 발견되었습니다. 호중구 고갈 또는 억제에 초점을 맞춰 호중구를 직접 표적으로 삼는 다양한 치료 전략이 개발되어12,22 여러 임상 시험으로 이어졌습니다(예: NCT03274804의 CCR5 억제제 Maraviroc). 따라서 치료되지 않은 호중구를 나노캐리어로 직접 적용하면 약물 밀매 호중구가 종양 부위로 이동한 후 TME 내에서 면역억제성 전종양 N2 표현형으로 재프로그램화될 수 있는 암 환자에게 추가적인 위험을 초래할 수 있습니다. 또한, 화학요법제와 함께 약물 전달체로 사용될 때 최적화된 치료 효능을 달성하기 위해 순수 호중구의 본질적인 항종양 활성을 탐구하고 강화해야 합니다.

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시스탄체 튜불로사의 장점-면역체계 강화

키메라 항원 수용체(CAR) 변형은 면역 T 또는 자연살해(NK) 세포의 항종양 활성을 크게 향상시켰습니다. 그러나 고형 종양에서의 효능은 부분적으로 상대적으로 낮은 수송 및 종양 침투 능력으로 인해 여전히 제한적입니다. 생리학적 BBB 및 BBTB의 존재는 뇌의 GBM에 대한 이러한 새로운 치료법의 효능을 더욱 방해합니다. 우리는 CAR 공학과 운동성이 높은 호중구의 조합이 항종양 N1 표현형을 유지하고 GBM 치료에 탁월한 치료 효능을 나타낼 수 있다고 추측했습니다. 일차 호중구는 수명이 짧고 게놈 편집에 저항성이 있어 CAR 지향 면역요법에서의 적용이 제한됩니다. 유전자 편집에 더 쉽게 접근할 수 있고 호중구로 대규모로 분화할 수 있는 인간 다능성 줄기 세포(hPSC)는 화학적으로 정의된 이종 물질이 없는 조건에서 표적 면역 요법을 위한 고품질 CAR 호중구의 무제한 공급원을 제공할 수 있습니다29. 호중구는 또한 S. aureus 및 E. coli30와 같이 표면이 거칠거나 긴 미생물 병원체를 우선적으로 식균하는데, 이는 호중구 매개 약물 전달에서 나노입자 설계를 고려해야 합니다. 실제로 Safari et al. 최근 순환 호중구에 의해 복잡한 표면 변형 없이 정맥 투여된 길쭉한 입자의 선호되는 식세포작용이 보고되었습니다. 약물이 탑재된 나노입자의 이러한 간편하고 생체 영감을 받은 디자인은 호중구의 약물 로딩을 최대화하고 표적 부위에 치료 수준의 약물 전달을 허용할 수 있습니다.

In this work, we design and screen four anti-GBM chlorotoxin (CLTX)-CAR constructs with T or neutrophil-specific signaling domains by knocking them into the AAVS1 safe harbor locus of hPSCs via CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination and identified an optimized CAR, composed of a 36-amino acid GBM-targeting CLTX peptide27, a CD4 transmembrane domain and a CD3ζ intracellular domain, for neutrophil-mediated tumor-killing. The resulting stable CAR-expressing hPSCs are then differentiated into CAR-neutrophils, which sustain an anti-tumor N1 phenotype and exhibit enhanced anti GBM activities under the hypoxic tumor microenvironment. A biode gradable mesoporous organic silica nanoparticle with a rough surface (R-SiO2) is synthesized and employed to load hypoxia-activated prodrug tirapazamine (TPZ) or clinical chemo-drug temozolomide (TMZ) and JNJ-64619187 (a potent PRMT5 inhibitor under clinical trial NCT03573310) into hPSC-derived CAR-neutrophils, which are unharmed by the nanoparticulated cargo and retain the inherent physiological properties of naïve neutrophils. CAR-neutrophils loaded with drug-containing SiO2 nanoparticles display superior anti-tumor activities against GBM, possibly due to a combination of CAR-enhanced direct cytolysis and chemotherapeutic-mediated tumor killing via cellular uptake and glutathione (GSH)-induced degradation of nanoparticles within the targeted tumor cells. In an in situ GBM xenograft model, hPSC-derived CAR-neutrophils precisely and effectively deliver TPZ-loaded SiO2 nanoparticles to the brain tumors without invasive surgical resection for amplified inflammation, significantly inhibiting tumor growth, and prolonging animal survival, representing a targeted and efficacious combinatory chemoimmunotherapy. Notably, Si content measurement suggests that>투여된 나노약물의 20%는 CAR 호중구에 의해 뇌종양으로 전달되는 반면 유리 나노약물은 1%로 전달됩니다. 요약하자면, 당사의 생체모방 CAR-호중구 약물 전달 시스템은 GBM 및 기타 파괴적인 질병을 치료하기 위한 안전하고 강력하며 다용도인 플랫폼입니다.

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cistanche tubeulosa-항종양의 장점

결과

향상된 항종양 활성을 위한 호중구 특이적 CAR 구조 스크리닝

To engineer CAR-neutrophils for targeted drug delivery to brain tumors (Fig. 1a–b), we first designed and tested 4 different CAR structures optimized for anti-tumor activities of hPSC-neutrophils. All CAR structures shared the same extracellular granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor (GM-CSFR) signal peptide (SP), glioblastoma-targeting domain CLTX27, and IgG4 hinge29 (Fig. 2a). CAR #1 is a first-generation T cell-specific CAR that uses the CD4 transmembrane (TM) domain and CD3ζ intracellular signaling domain. CAR #2, CAR #3, and CAR #4 differ from CAR #1 in using a transmembrane domain from neutrophil-specific CD32a (or FcγRIIA), a single-chain transmembrane receptor that is highly expressed in neutrophils (30,000 to 60,000 molecules/cell31) and critical for neutrophil activation31–34. CAR #3 and CAR #4 also include an Fc domain γ-chain of CD32a, which relies on a highly conserved immunoreceptor tyrosine based activation motif (ITAM) to express and signal in neutrophils. Notably, CAR #3 contains a combo signaling domain by fusing CD32aITAM to the CD3ζ intracellular domain. Since primary neutrophils are short-lived and resistant to genome editing, we engineered human pluripotent stem cells (hPSCs) with these different CARs to achieve stable and universal immune receptor expression on differentiated neutrophils by knocking CAR constructs into the AAVS1 safe harbor locus via CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair (Fig. 2b). After nucleofection, single cell-derived hPSC clones were isolated and screened with puromycin for about two weeks. Genotyping identified successfully targeted hPSCs with an average CAR knock-in efficiency of >90%이고 대부분의 표적 클론은 이형접합체입니다(보충 그림 1a-d). 조작된 hPSC에 대한 CAR 발현은 RT-PCR 및 CLTX-IgG4의 유세포 분석을 통해 추가로 확인되었습니다(보충 그림 1e-g). 예상대로 CAR 발현 hPSC는 OCT4, SSEA4 및 SOX2를 포함한 다능성 마커의 높은 발현 수준을 유지했습니다 (보충 그림 1f).

새로운 CAR-호중구를 생산하기 위해 CAR 발현 hPSC를 먼저 다능성 조혈 세포로 분화한 다음 단계별 사이토카인 처리를 통해 골수 전구 세포로 분화했습니다(그림 2c). G-CSF와 레티노산 작용제 AM580의 후속 사용은 강력한 호중구 생산을 촉진했습니다. 말초혈액(PB)의 대응물과 유사하게, hPSC 유래 CLTX-CAR 호중구는 전형적인 호중구 형태와 표면 마커 CD16, CD11b, MPO, CD15, CD66b 및 CD18을 나타냈습니다(보충 그림 2). 다음으로 우리는 시험관 내에서 교모세포종(GBM) U87MG 세포와 공동 배양하여 hPSC 유래 호중구의 항 종양 세포 독성에 대한 CAR 발현의 효과를 결정했습니다. 예상한 대로, hPSC 유래 CLTX-CAR 호중구는 PB 호중구에 비해 향상된 종양 사멸 능력을 나타냈으며(그림 2d), 이는 CLTX CAR-T 세포의 이전 관찰과 일치합니다. 이러한 다양한 CAR 중에서 CAR #1은 hPSC-호중구에서 탁월한 종양 사멸 활성을 매개했습니다. 특히 α-사슬 기반 CAR #4는 호중구 매개 종양 살해를 유발하는 데 가장 효과적이지 않습니다. 이는 ζ-서브유닛보다 ITAM 사본이 적고 세포 표면에서 α-보유 CAR의 발현이 낮기 때문일 수 있습니다28. 호중구는 세포독성 활성산소종(ROS)과 종양괴사인자-(TNF-)를 방출하여 표적 세포를 죽입니다. 서로 다른 호중구에서 ROS와 TNF-(그림 2e, f)의 생산은 증가된 세포용해와 잘 일치했습니다. 예상한 대로, 정상적인 SVG p12 신경교 세포와 공동 배양한 후 다른 호중구에서 ROS 및 TNF-의 생성은 음성 대조군만큼 낮게 유지되었습니다(보충 그림 3a, b). 또한 CAR-호중구의 향상된 항종양 세포독성은 U87MG, 일차 성인 GBM43 및 소아 SJ-GBM2 세포를 포함한 GBM 세포와의 공동 배양에서만 관찰되었으며(보충 그림 3c), 이는 CLTX의 높은 특이성을 입증합니다. -자동차. 특히, CAR 호중구는 정상적인 SVG p12 신경교 세포, hPSC 및 hPSC 유래 세포와 높은 생체 적합성을 나타냈으며(보조 그림 3d), 이는 비활성화된 일차 호중구가 건강한 세포를 죽이지 않는다는 이전 관찰과 일치합니다. 종합적으로, hPSC 유래 CAR 호중구, 특히 CD3ζ 보유 CAR 호중구는 향상된 항종양 세포독성을 나타냈고 시험관 내에서 더 많은 ROS 및 TNF-를 생성하여 표적 면역요법에서의 잠재력을 강조했습니다.

Fig. 1 | Schematic of enhanced anti-glioblastoma efficacy using combinatory immunotherapy of CAR-neutrophils and tumor microenvironment responsive nano-drugs. Human pluripotent stem cells were engineered with CARs and differentiated into CAR-neutrophils that are loaded with rough silica nanoparticles (SiO2 NPs) containing hypoxia-targeting tirapazamine (TPZ) or other drugs, as a dual immunochemotherapy. b Systemically administered CAR-neutrophil@R-SiO2- TPZ NPs first attack external normoxic tumor cells by forming immunological synapses and kill tumor cells via phagocytosis. After apoptosis, CAR-neutrophils could then release R-SiO2-TPZ NPs, which are overtaken by tumor cells. Afterward, nano-prodrugs respond to the hypoxic tumor microenvironment and effectively kill tumor cells. TEOS tetraethyl orthosilicate, BTES bis[3-(triethoxysilyl) propyl] tetrasulfide, TPZ tirapazamine, BTZ benzotriazinyl.


그림 1|CAR 호중구와 종양 미세환경 반응성 나노약물의 결합 면역요법을 사용하여 향상된 항교모세포종 효능의 개략도. 인간 다능성 줄기 세포는 CAR로 조작되었으며 이중 면역화학요법으로 저산소증 표적 티라파자민(TPZ) 또는 기타 약물을 함유한 거친 실리카 나노입자(SiO2 NP)가 로드된 CAR 호중구로 분화되었습니다. b 전신 투여된 CAR-neutrophil@R-SiO2- TPZ NP는 먼저 면역학적 시냅스를 형성하여 외부 정상산소 종양 세포를 공격하고 식세포작용을 통해 종양 세포를 죽입니다. 세포사멸 후 CAR-호중구는 R-SiO2-TPZ NP를 방출할 수 있으며 이는 종양 세포에 의해 대체됩니다. 그 후, 나노 전구약물은 저산소 종양 미세환경에 반응하여 종양 세포를 효과적으로 사멸시킵니다. TEOS 테트라에틸 오르토실리케이트, BTES 비스[3-(트리에톡시실릴) 프로필] 테트라설파이드, TPZ 티라파자민, BTZ 벤조트리아지닐.

CAR-호중구는 면역억제성 종양 미세환경에서 우수한 항종양 활성을 유지했습니다.

대식세포와 유사하게, 종양 관련 호중구의 항종양 N1 및 전종양 N2 표현형이 면역억제 종양 미세환경 내에서 발견되었습니다. 전종양 N2 호중구는 종양 혈관신생, 전이 및 면역억제에서 중요한 역할을 하지만, 이 세포 유형을 치료적으로 표적화하는 것은 어려운 일이었습니다.

체계적 고갈 전략보다는22 여기서 우리는 호중구의 항종양 표현형을 유지하는 데 있어 CAR 공학의 잠재력을 평가했습니다. CAR hPSC 유래 및 PB 호중구를 종양 미세환경의 면역억제에 기여하는 저산소증(3% O2) 및 TGF로 처리하여 지속적인 종양 사멸 활성을 평가했습니다. PB 호중구는 면역 억제 조건 하에서 GBM 세포에 대해 세포 용해가 현저히 감소한 반면, CAR 호중구는 높은 종양 살상 활성을 유지했습니다 (보충 그림 4a). 면역 억제 및 정상 조건 하에서 PB 또는 CAR 호중구로부터의 TNF 방출 및 ROS 생성 (보조 그림 4b, c)에서도 유사한 관찰이 이루어졌습니다. 저산소 및 TGF 조건에서 호중구 표현형을 추가로 확인하기 위해 우리는 유세포 분석법을 통해 분리된 호중구에서 N1-특이적 iNOS 및 N2- N2-특이적 아르기나제의 발현을 측정했습니다(보충 그림 2). 4d–f). 정상산소증과 비교하여, 면역억제성 저산소증 및 TGF는 iNOS의 발현 수준을 유의하게 감소시키고 PB 호중구의 아르기나제 수준을 증가시키는 반면, CAR 호중구는 iNOS의 높은 발현 수준을 유지했습니다. 이전 연구에서는 Syk-Erk 신호 전달 경로의 활성화가 ROS 생산으로 이어진다는 것을 나타냅니다. 따라서 우리는 수정되지 않은 호중구와 CAR-호중구에서 Syk-Erk 활성화를 감지하고 비교했으며, 결과는 저산소 상태에서 CAR-호중구에서 Syk-Erk 경로의 상당히 높은 활성화를 제안했습니다 (보충 그림 5a-d). 저산소 상태에서 CAR 호중구의 변하지 않은 ROS 생산. 종합하면, CAR-호중구는 항종양 표현형을 유지하고 시험관 내 종양 미세환경 모방 조건 하에서 높은 항종양 활성을 유지하여 표적 면역요법에서의 잠재력을 강조합니다.

Fig. 2 | Screening neutrophil-specific chimeric antigen receptor (CAR) structures with enhanced neutrophil-mediated anti-tumor activities. a Schematic of various CAR structures. b Schematic of CAR #1 construct and targeted knock-in strategy at the AAVS1 safe harbor locus of human pluripotent stem cells (hPSCs). The vertical arrow indicates the AAVS1 targeting sgRNA. Red and blue horizontal arrows indicate primers for assaying targeting efficiency and homozygosity, respectively. HDR: homologous recombination repair. c Schematic of optimized neutrophil differentiation from hPSCs under chemically defined conditions. d Cytotoxicity assays against U87MG glioblastoma cells were performed at different ratios of neutrophil-to-tumor target using indicated neutrophils. Data are represented as mean ± SD of five independent biological replicates, two-tailed Student's t-test. Reactive oxygen species (ROS) generation (e) and ELISA analysis of TNFα release (f) from different neutrophils after coculturing with U87MG cells were determined. n = 5 biologically independent samples. The data are represented as mean ± SD, two-tailed Student's t-test. Source data are provided as a Source Data file.


그림 2|향상된 호중구 매개 항종양 활성을 통해 호중구 특이적 키메라 항원 수용체(CAR) 구조를 스크리닝합니다. 다양한 CAR 구조의 개략도. b 인간 다능성 줄기 세포(hPSC)의 AAVS1 안전 항만 유전자좌에서 CAR #1 구조 및 표적화된 녹인 전략의 도식. 수직 화살표는 sgRNA를 표적으로 하는 AAVS1을 나타냅니다. 빨간색과 파란색 가로 화살표는 각각 표적화 효율과 동형접합성을 분석하기 위한 프라이머를 나타냅니다. HDR: 상동 재조합 복구. c 화학적으로 정의된 조건 하에서 hPSC로부터 최적화된 호중구 분화의 도식. d 표시된 호중구를 사용하여 다양한 비율의 호중구 대 종양 표적에서 U87MG 교모세포종 세포에 대한 세포 독성 분석을 수행했습니다. 데이터는 5개의 독립적인 생물학적 복제, 양측 스튜던트 t-테스트의 평균 ± SD로 표시됩니다. U87MG 세포와 함께 배양한 후 다양한 호중구로부터의 TNF 방출(f)에 대한 반응성 산소종(ROS) 생성(e) 및 ELISA 분석을 결정했습니다. n=5 생물학적으로 독립적인 샘플. 데이터는 평균 ± SD, 양측 스튜던트 t-테스트로 표시됩니다. 소스 데이터는 소스 데이터 파일로 제공됩니다.

티라파자민(TPZ) 함유 SiO2 나노입자가 로딩된 hPSC CAR-호중구의 제조 및 특성 규명

PB 호중구는 뇌종양에 영상 및 치료 약물을 전달하기 위한 세포 운반체로 사용되어 왔지만8-10 표적 호중구 침윤에는 수술이나 광 유발 염증이 필요하고 표적을 벗어난 약물 전달이 문제가 될 수 있습니다11. CAR 호중구의 항종양 활성을 더욱 향상시키기 위해 우리는 호중구에 화학요법제나 방사선 약물을 담을 수 있도록 표면이 거칠거나 매끄러운 실리카 나노입자(SiO2-NP)를 준비했습니다. 투과전자현미경(TEM) 이미지는 두 SiO2 나노입자가 모두 잘 분산되어 있고 균일한 크기의 구형 형태를 나타냄을 보여줍니다(그림 3a, 보충 그림 6a). 에너지 분산 X-선 분광법(EDS)을 이용한 스캐닝 TEM(STEM)을 통한 조성 분포 분석은 황(S) 원소가 전체 거친 SiO2 나노입자(R-SiO2) 내에 고르게 분포되어 있음을 보여주었습니다(그림 3b). 질소(N2) 흡착-탈착 등온선과 해당 기공 크기 분포 분석을 사용하여 R- 및 SSiO2 NP의 기공 크기는 각각 25 nm 및 35 nm로 측정되었습니다(그림 3c, 보충 그림 6b). 높은 표면적과 큰 기공 크기를 고려할 때, 저산소증에 반응하는 전구약물 티라파자민(TPZ)의 예에서 볼 수 있듯이 치료 약물은 R- 및 S-SiO2 NP 모두에 효과적으로 로딩될 수 있습니다(그림 3d, 보충 그림 6c). . TPZ 로딩 후 TEM 및 동적 광산란 분석을 사용하여 R-SiO2-TPZ의 분산도, 형태 및 크기에서 중요한 변화가 관찰되지 않았습니다(보조 그림 6d, e). R-SiO2 NP에 통합된 사황화물 결합은 환원 환경에 민감하며 종양 세포 내에 존재하는 다량의 글루타티온(GSH)에 의해 빠르게 분해될 수 있습니다43. 다음으로 우리는 10 mM, 1 mM 및 10 μM GSH 존재 하에서 R-SiO2-TPZ NP의 GSH 반응 분해성을 결정했는데, 이는 각각 암세포, 정상 세포 및 세포외 환경의 세포내 조건과 동일했습니다43. 10mM GSH 처리 시, R-SiO2-TPZ NP의 초기 구형 구조는 24시간 후에 심각하게 파괴되었습니다(보충 그림 6f, g). 나노입자는 48시간 후에 작은 잔해로 완전히 분해되어 GSH 반응 방식으로 TPZ가 방출되었습니다(그림 3e). R-SiO2 NP의 잔해는 시험관 내에서 테스트된 세포에 심각한 세포 독성을 일으키지 않았으며(보조 그림 6h), 이는 R-SiO2 NP의 상대적 안전성을 나타냅니다.

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다음으로 우리는 SiO2-TPZ NP를 사용하여 치료 효능을 높이기 위한 조합 화학면역요법으로 CAR-호중구에 치료 약물을 로드하는 타당성을 평가했습니다. 원심분리 후, 우리는 형광현미경과 유세포 분석(그림 3f, g)을 사용하여 호중구에 의한 SiO2-TPZ NP의 세포 흡수를 측정했으며, S-SiO2-보다 R-SiO2-TPZ NP의 더 중요한 세포 흡수를 감지했습니다. 호중구에 의한 TPZ NP. 호중구의 세포질 Si 함량은 유도 결합 플라즈마 질량 분석법(ICP-MS)을 통해 매끄럽고 거친 SiO2 NPs@TPZ(그림 3h)에 대해 각각 11.3 및 19.1ng Si/ug 단백질로 측정되었습니다. 호중구의 높은 로딩 용량을 고려하여 R-SiO2-TPZ NP는 후속 실험에 사용되었습니다. 그런 다음 R-SiO2-TPZ NP를 로딩한 후 CAR 호중구의 생리학적 기능을 테스트하려고 했습니다. R-SiO2 로딩 전후에 CAR-호중구의 세포 생존력(그림 3i, 보충 그림 6i), 트랜스웰 이동 능력(그림 3j), 주화성 및 해당 속도(그림 3k, l)에는 변화가 관찰되지 않았습니다. –TPZ NP는 높은 생체 적합성을 입증합니다. 시간에 따른 나노 약물 로딩 분석도 수행되었으며 세포 -NP 배양 후 1 시간에 최대 로딩 함량에 도달했습니다 (보충 그림 7a). 95% 이상의 CAR-호중구에 R-SiO2-TPZ NP가 성공적으로 로딩되었습니다(보충 그림 7b). 염증성 분자 자극 시 부착 및 이동 기능을 매개하는 호중구 표면 단백질인 CD11b의 발현 수준은 R-SiO2-TPZ 로딩 유무에 관계없이 CAR 호중구에서는 변경되지 않았습니다(보충 그림 7c, d). 과산화물 또는 활성산소종(ROS)은 활성 호중구에서 방출되어 미생물과 종양 세포를 죽입니다44. 예상대로, CAR-호중구에 의한 ROS 생성은 N-포르밀메티오닌-류실-페닐알라닌(fMLP) 처리 후 크게 증가했으며, R-SiO 로딩 전후에 CAR-호중구에 의한 ROS 생성에는 유의미한 차이가 관찰되지 않았습니다2- TPZ(그림 3m). 종합하면, 우리의 데이터는 R-SiO2-TPZ 로드된 CAR 호중구가 야생형 호중구의 생리적 활동을 유지하고 염증 자극을 향해 적극적으로 이동할 수 있음을 보여주어 표적 암 화학면역요법에서의 잠재력을 강조합니다.

R-SiO2-TPZ 나노입자가 탑재된 CAR 호중구는 교모세포종 세포를 효과적으로 죽입니다.

다음으로 CAR-호중구의 종양 사멸 능력에 대한 R-SiO2-TPZ의 효과를 평가했습니다. 친밀한 이펙터-표적 상호작용은 호중구 매개 세포용해의 전제조건이었습니다. 예상대로 CAR-neutrophils@R-SiO2-TPZ는 2시간 이내에 종양 세포와 면역 시냅스를 형성했으며 약물이 없는 CAR-호중구와 유사한 효과기-표적 상호 작용 수를 나타냈습니다(그림 4a, 보충 그림 8). . 특히, CAR-neutrophils@RSiO2-TPZ와 비암성 체세포 사이에는 관찰 가능한 상호 작용이 발견되지 않았으며(보충 그림 8), 이는 뇌종양에 대한 CLTX-CAR의 특이성을 강조합니다. 또한, R-SiO2-TPZ NP는 공동 배양 12시간 후 호중구에서 배양 배지(보충 그림 9a, b)로 방출되어 나머지 종양 세포로 들어갔습니다(그림 4a). SiO2-TPZ NP가 탑재된 CAR-호중구를 종양 세포와 함께 배양한 지 24시간 후, 종양 세포의 최대 95%에 R-SiO2-TPZ NP가 포함되어 있었습니다(그림 4a, 보충 그림 9c). 효과기 세포 기능을 발휘하고 세포사멸을 겪는 운반체 호중구와 관련된 수송 계통을 통해 R-SiO2-TPZ NP를 표적 종양 세포에 수동적으로 방출합니다. 우리는 또한 TPZ에서 생성된 라디칼의 전자 상자성 공명(EPR) 분광학 분석(보조 그림 9d)과 종양에 대한 TOPRO-3의 유세포 분석을 통해 종양 세포 내 전구 약물 TPZ의 저산소 반응 기능 및 세포 독성을 검증했습니다. 저산소증 및 정상 산소 상태의 세포 (보충 그림 9e). R-SiO2-TPZ NP가 탑재된 CAR 호중구의 세포용해를 결정하기 위해 우리는 시험관 내 정상산소증-저산소증 종양 재도전 모델을 구현했습니다(그림 4b). 정상산소 공동배양 24시간 후, R-SiO2-TPZ NP가 로딩된 CAR-호중구는 유사한 항종양 세포독성을 나타내지 않았으며(그림 4c), 둘 다 R-SiO2가 로딩된 PB-호중구보다 높았습니다. -SiO2-TPZ NP 여부 및 R-SiO2- TPZ NP 단독. 향상된 세포 독성은 주로 CAR 엔지니어링 후 호중구의 종양 표적화 능력이 증가했기 때문입니다. 종양 세포와 추가로 12시간 및 24-시간 저산소 공동배양 후, R-SiO2-TPZ NP가 탑재된 CAR-호중구는 다른 그룹에 비해 우수한 항종양 능력을 나타냈습니다(그림 4d, e). 또한, R-SiO2-TPZ NP가 로딩된 CAR 호중구는 재파종된 신선한 종양 세포에 대해 우수한 세포용해를 나타냈으며(그림 4f), 이는 방출된 R-SiO2-TPZ의 항종양 능력을 나타냅니다. 호중구 세포사멸 후의 나노입자.

그런 다음 CAR 발현 및 R-SiO2-TPZ NP에 의한 호중구의 향상된 항종양 세포용해의 기본이 되는 잠재적인 분자 메커니즘을 밝히기 위해 종양 세포에 대한 RNA 서열 분석(RNA-seq) 분석을 수행했습니다. 유전자 발현 분석에서는 대조군과 R-SiO2-TPZ NP에 비해 R-SiO2-TPZ NP가 있거나 없는 CAR-호중구가 종양 세포에서 세포질과 막 유전자의 발현을 크게 감소시키는 것으로 나타났습니다. 보충 그림 10a, 그림 4g), 공동 배양시 종양 세포의 식균 작용을 추가로 지원합니다. 모든 실험 그룹이 종양 세포의 세포 산화 스트레스를 증가시키는 반면, R-SiO2-TPZ가 탑재된 CAR-호중구는 산화 스트레스 신호를 유발하는 데 있어 다른 그룹보다 성능이 뛰어났습니다. 또한, R-SiO2-TPZ가 탑재된 CAR 호중구는 종양 세포의 세포사멸을 크게 촉진하고 종양 세포의 증식을 감소시켰습니다. R-SiO2-TPZ가 탑재된 CAR-호중구의 향상된 항종양 활성을 더 자세히 이해하기 위해 우리는 식균 작용 억제제인 ​​시토칼라신 D와 반응성 산소종(ROS) 제거제 N-아세틸 시스테인(NAC)을 적용했습니다. 종양-호중구 공동 배양에 대한 ROS 억제제 GSK2795039. CAR 호중구에 의한 종양 세포의 세포 용해는 5 μM cytochalasin D, 5 mM NAC 및 100 nM GSK2795039에 의해 크게 감소되었으며(보조 그림 10b, c), 이는 CAR 호중구 매개 종양 세포에서 식세포 작용과 ROS의 두드러진 역할을 나타냅니다. 죽이는. 호중구와 NAC 또는 GSK2795039가 있는 상태에서 나머지 40%-50% 종양 세포 용해는 추가 조사 가치가 있는 호중구 매개 종양 살해에 ROS 독립적 메커니즘이 관여함을 나타냅니다.

Fig. 3 | Preparation and characterization of hPSC CAR-neutrophils loaded with tirapazamine (TPZ)-containing SiO2 nanoparticles. a–e Transmission electron microscope (TEM) (a) and energy dispersive spectroscopy (EDS) elemental mapping images (b) of rough SiO2 nanoparticles are shown. c Nitrogen adsorption-desorption isotherm of rough SiO2 nanoparticles along with Barrett-JoynerHalenda (BJH) pore size distribution plot is shown. Biological triplicates were performed independently. TPZ loading content in SiO2 nanoparticles (d) and glutathione (GSH)--responsive TPZ release (e) were measured at the indicated time. n = 3 biologically independent samples. One-way analysis of variance (ANOVA) for (e). Fluorescence images (f) and flow cytometry analysis (g) of neutrophils loaded with smooth and rough SiO2-TPZ. Biological triplicates were performed independently. h Cellular SiO2 content in hPSC-derived CAR-neutrophils was measured. n = 5 biologically independent samples, two-tailed Student's t-test. Cellular viability (i), n = 3 biologically independent samples, transmigration (j), n = 5 biologically independent samples, chemoattraction abilities (k, l), n = 20 biologically independent samples, and ROS generation ability (m) of hPSC-derived CAR-neutrophils loaded with or without rough SiO2-TPZ were shown, n = 5 biologically independent samples, two-tailed Student's t-test. PMA: phorbol myristate acetate. All data in this figure are represented as mean ± SD. Source data are provided as a Source Data file.


그림 3|티라파자민(TPZ) 함유 SiO2 나노입자가 로딩된 hPSC CAR-호중구의 제조 및 특성 규명. a-e 거친 SiO2 나노입자의 투과 전자 현미경(TEM)(a) 및 에너지 분산 분광법(EDS) 원소 매핑 이미지(b)가 표시됩니다. c Barrett-JoynerHalenda(BJH) 기공 크기 분포 플롯과 함께 거친 SiO2 나노입자의 질소 흡착-탈착 등온선이 표시됩니다. 생물학적 삼중 실험은 독립적으로 수행되었습니다. SiO2 나노입자(d) 및 글루타티온(GSH)--반응 TPZ 방출(e)의 TPZ 로딩 함량을 표시된 시간에 측정했습니다. n=3 생물학적으로 독립적인 샘플. (e)에 대한 일원 분산 분석(ANOVA). 매끄럽고 거친 SiO2-TPZ가 포함된 호중구의 형광 이미지(f) 및 유세포 분석(g). 생물학적 삼중 실험은 독립적으로 수행되었습니다. h hPSC 유래 CAR 호중구의 세포 SiO2 함량을 측정했습니다. n=5 생물학적으로 독립적인 표본, 양측 스튜던트 t-검정. 세포 생존력(i), n=3 생물학적으로 독립된 샘플, 이동(j), n=5 생물학적으로 독립된 샘플, 화학 유인 능력(k, l), n=20 생물학적으로 독립된 샘플 및 거친 SiO2-TPZ가 있거나 없는 hPSC 유래 CAR 호중구의 ROS 생성 능력(m)이 n= 5 생물학적으로 독립적인 샘플, 양측 스튜던트 t-테스트로 표시되었습니다. PMA: 포르볼 미리스테이트 아세테이트. 이 그림의 모든 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. 소스 데이터는 소스 데이터 파일로 제공됩니다.

시험관 내 생체모방 교모세포종 모델을 사용하여 나노 약물이 탑재된 CAR 호중구의 기능 평가

R-SiO22-TPZ NP가 탑재된 CAR-호중구의 활성을 추가로 평가하기 위해 인간 대뇌 미세혈관 내피 세포를 사용하여 트랜스웰 기반 혈액뇌장벽(BBB) ​​종양 모델을 구현했습니다(그림 5a, 보충 그림 .11a). 예상한 대로 R-SiO2-TPZ NP가 탑재된 CAR 호중구는 시험관 내 BBB 모델에서 우수한 이동 능력을 나타냈고(그림 5b), 정상산소 상태와 저산소 상태 모두에서 이동 후 표적 종양 세포를 효과적으로 죽였습니다(그림 5c). , d) 종양 세포를 죽이기 위해 다른 효과기 세포를 유인할 수 있는 더 많은 염증성 사이토카인을 방출합니다(그림 5e). 또한 CAR 호중구는 이동 후 내피 세포의 생존 가능성에 유의미한 영향을 미치지 않았습니다 (보충 그림 11b). R-SiO2-TPZ NP가 탑재된 CAR 호중구는 두 번째 윤회 실험 동안 우수한 윤회 능력을 유지했으며(그림 5f), 다른 그룹에 비해 우수한 항종양 능력을 유지했습니다(그림 5g). 그런 다음 3차원(3D) 종양 회전 타원체 모델을 사용하여 R-SiO2-TPZ NP 로드 CAR 호중구의 종양 침투 능력을 평가했습니다(그림 5h). CAR-호중구는 점차적으로 종양 회전 타원체의 중심을 향해 이동하여 8시간 배양 후 회전 타원체에 균일하게 분포되었습니다(그림 5i). CAR 호중구와 R-SiO2-TPZ NP 사이의 높은 수준의 공동 위치화가 관찰되었으며(보충 그림 12a-c), 이는 R-SiO2-TPZ NP가 CAR에 안정적으로 캡슐화되었음을 입증합니다. - 세포 용해 전 종양 침윤 중 호중구. 호중구 매개 전달이 없으면 R-SiO2-TPZ NP는 종양 회전 타원체의 외부 층에서만 발견되었습니다. R-SiO2-TPZ NP 및 CAR-호중구와 비교하여 R-SiO2-TPZ NP가 탑재된 CAR 호중구는 3D 종양 모델에서 우수한 항종양 세포용해를 나타냈습니다(그림 5j). CAR-neutrophils@R-SiO2 NP는 또한 임상 테모졸로미드(TMZ) 및 JNJ- 64619187를 포함한 다른 약물을 3D 종양 모델에 전달하고 GBM 세포를 효율적으로 죽이는 데 사용될 수 있습니다(보충 그림 12d-f). 종합하면, 결합형 CAR 호중구와 나노 약물은 시험관 내 조건을 모방하는 생체모방 종양 미세환경에서 우수한 항종양 활성을 나타내어 결합형 호중구 기반 화학면역요법의 치료 잠재력을 강조합니다.

Desert ginseng—Improve immunity (9)

cistanche tubeulosa - 면역 체계를 향상시킵니다.

CAR 호중구 전달 R-SiO2-TPZ 나노입자의 생체 내 분포

In addition to improving the direct tumor-killing ability, we hypothesize that CAR engineering of hPSC-neutrophils will significantly enhance their targeted delivery of therapeutic drugs without additional surgery- or light-induced inflammation11. To test this hypothesis, we employed a mouse xenograft model of glioblastoma and an in vivo imaging system to determine the trafficking and biodistribution of R-SiO2-TPZ NP-loaded CAR-neutrophils. We fluorescently labeled SiO2 NPs with a near-infrared dye Cyanine 5 (Cy5) and then performed fluorescence imaging 3 h and 24 h after systemic administration (Fig. 6a). Three hours after intravenous injection, R-SiO2-TPZ NPs traveled to the whole body of tumor-bearing mice and emitted strong fluorescence with or without neutrophil-mediated delivery (Fig. 6b). CAR-neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs accumulated in the brain tumor site within 24 h, whereas free R-SiO2-TPZ NPs were still evenly distributed across the whole body (Fig. 6b). To further quantify the biodistribution of R-SiO2-TPZ NPs in various organs, inductively coupled plasma-optical emission spectrometry (ICP-OES) analysis of Si content was performed on the harvested organs 24 h post-injection. CAR neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs were significantly enriched in the mouse brain (Fig. 6c), although a low-level delivery to the liver and spleen was observed. Si content measurement also demonstrated that >투여된 나노약물의 20%는 CAR 호중구에 의해 뇌종양으로 전달된 반면 유리 나노약물은 1%로 전달되었으며 이는 이전 보고서와 일치합니다6. CAR-호중구에 의해 BBB를 거쳐 숙주 뇌로 R-SiO2-TPZ NP의 표적 전달도 조직학 분석을 통해 확인되었습니다(그림 6d). 이에 반해 R-SiO2-TPZ NPs 단독으로는 주로 간과 비장에 축적되었다. 종합적으로, 우리의 데이터는 종양 부위에 추가적인 염증을 유발할 필요 없이 CAR 호중구에 의한 R-SiO2-TPZ NP의 향상된 표적 전달을 입증했으며, 이는 암 치료에서 호중구 기반 화학면역요법의 타당성과 안전성을 강조합니다.

CAR-호중구와 R-SiO2-TPZ 나노입자의 결합 화학면역요법은 생체 내에서 탁월한 항교모세포종 활성을 나타냈습니다.

R-SiO2-TPZ NP-로드 CAR 호중구의 치료 효능을 확인하기 위해 U87MG 세포를 발현하는 루시퍼라제를 사용하여 NOD.Cg-RAG1tm1MomIL2rgtm1Wjl/SzJ(NRG) 마우스에서 교모세포종의 현장 이종 이식 모델을 확립했습니다. 종양이 있는 쥐에게 매주 5 x 106 호중구를 정맥 투여하고(그림 7a), 숙주의 종양 부담을 측정하고 정량화했습니다(그림 7b, c). PBS 또는 PB 호중구 처리 마우스와 비교하여 CAR 호중구 및 CAR 호중구@R-SiO2-TPZ NP로 처리하면 종양 성장이 효과적으로 느려졌습니다. CAR neutrophils@R-SiO2-TPZ NP는 다른 실험 그룹보다 훨씬 높은 항종양 세포독성을 나타냈습니다. 반대로, PB-호중구는 뇌의 종양 성장을 크게 촉진하여 빠르면 23일차에 종양이 있는 쥐의 사망을 초래했으며(그림 7d), 이는 조작되지 않은 호중구가 추가적인 위험을 초래할 수 있음을 시사합니다. 다음으로 우리는 다양한 실험 마우스 그룹의 혈장에서 인간 사이토카인 방출을 측정했습니다(그림 7e). 모든 비-PBS 실험 그룹은 5일부터 26일까지 혈장에서 검출 가능한 TNF 및 IL{28}}을 생성했는데, 이는 종양 자극 시 인간 호중구의 활성화를 암시합니다. 관찰된 더 높은 종양 성장률과 일치하게, 변형되지 않은 호중구는 점차적으로 더 많은 IL{31}} 및 TNF를 방출했으며, 이는 환자에게 사이토카인 방출 증후군을 유발할 수 있으며 IL-6 차단제에 대한 보다 심층적인 안전성 연구가 필요합니다46,47 . 특히, CAR-호중구@RSiO2-TPZ NP는 이후 시점(19일 및 26일)에 감소된 사이토카인 생산 능력을 나타냈는데, 이는 CAR-호중구 기반 화학면역요법으로 치료받은 환자에서 사이토카인 방출 증후군의 위험이 잠재적으로 낮음을 시사합니다. 복합 CAR-호중구와 R-SiO2-TPZ NP의 생체적합성은 매주 체중 측정과 생쥐 주요 기관의 병리학적 변화 모니터링을 통해 평가되었습니다. CAR 호중구@R-SiO2-TPZ NP 처리 마우스와 다른 실험 그룹 사이의 체중에는 차이가 관찰되지 않았으며(그림 7f), CAR-호중구@R-SiO2-TPZ NP의 전신 독성이 최소화되고 생체 적합성이 우수함을 나타냅니다(그림 7f). 28일 치료. 30일째에 생쥐에서 잘라낸 주요 기관에 대한 조직학적 분석에 따르면 CAR-neutrophils@R-SiO2-TPZ NP 처리 생쥐는 심장, 간, 비장, 폐 및 신장에 눈에 띄는 이상이나 기관 손상을 일으키지 않은 것으로 나타났습니다. 13), 결합 CAR-호중구와 R-SiO2-TPZ NP의 안전성을 추가로 확인했습니다.

Fig. 4 | CAR-neutrophils loaded with R-SiO2-TPZ nanoparticles effectively kill glioblastoma cells. Representative images of immunological synapses indicated by polarized F-actin accumulation at the interface between CAR-neutrophils and tumor cells at 6, 12, and 24 h were shown. R-SiO2-TPZ nanoparticles released from CAR-neutrophils upon tumor cell phagocytosis were up-taken by tumor cells. Triplicates were performed independently. b Schematic of neutrophil-mediated anti-tumor cytotoxicity assay. Cytotoxicity against U87MG glioblastoma cells was performed at different ratios of neutrophil-to-tumor target using indicated neutrophils at 24 h (c), 36 h (d), 48 h (e), and 72 h (f). n = 3 biologically independent samples. Data are represented as mean ± SD, one-way analysis of variance (ANOVA). g Bulk RNA sequencing analysis was performed on U87MG cells under various conditions. Heatmap shows expression levels of selected cytoplasm, membrane, oxidative stress, apoptosis, and proliferation-related genes in the indicated glioblastoma cells. n = 2 biologically independent samples. Source data are provided as a Source Data file.

그림 4|R-SiO2-TPZ 나노입자가 탑재된 CAR 호중구는 교모세포종 세포를 효과적으로 죽입니다. 6시간, 12시간 및 24시간에 CAR-호중구와 종양 세포 사이의 경계면에서 극성화된 F-액틴 축적으로 표시된 면역학적 시냅스의 대표적인 이미지가 표시되었습니다. 종양 세포 식작용 시 CAR-호중구에서 방출된 R-SiO2-TPZ 나노입자는 종양 세포에 흡수되었습니다. 삼중 실험은 독립적으로 수행되었습니다. b 호중구 매개 항종양 세포독성 분석의 도식. U87MG 교모세포종 세포에 대한 세포독성은 24시간(c), 36시간(d), 48시간(e) 및 72시간(f)에 표시된 호중구를 사용하여 다양한 비율의 호중구 대 종양 표적에서 수행되었습니다. n=3 생물학적으로 독립적인 샘플. 데이터는 평균 ± SD, 일원 분산 분석(ANOVA)으로 표시됩니다. g 다양한 조건에서 U87MG 세포에 대해 대량 RNA 서열 분석을 수행했습니다. 히트맵은 표시된 교모세포종 세포에서 선택된 세포질, 막, 산화 스트레스, 세포사멸 및 증식 관련 유전자의 발현 수준을 보여줍니다. n=2 생물학적으로 독립적인 샘플. 소스 데이터는 소스 데이터 파일로 제공됩니다.

Fig. 5 | Functional evaluation of CAR-neutrophils loaded with R-SiO2-TPZ nanoparticles using biomimetic glioblastoma (GBM) models in vitro. a Schematic of our in vitro tumor model of GBM with blood-brain-barrier (BBB), which is composed of endothelial cells on the cell insert membrane and tumor cells in the bottom of the same transwell. b Transwell migration analysis of neutrophils at 12 h is shown. Anti-GBM cytotoxicity of indicated neutrophils at 24 h (c) and 36 h (d) was measured and quantified. e ELISA analysis of IL-6 and TNFα released from indicated neutrophils at 36 h was performed. f Second migration of different neutrophils at 48 h is shown. g Anti-GBM cytotoxicity of indicated neutrophils at 60 h was measured and quantified. h–j Schematic of neutrophil-infiltrated three-dimensional (3D) tumor model in vitro was shown in (h). Representative fluorescent images of infiltrated neutrophils in the 3D tumor models were shown. DAPI was used to stain the cell nuclear and CD45 was used to stain neutrophils. Scale bars, 200 μm. Biological triplicates were performed independently. j The corresponding tumor-killing ability of indicated neutrophils was measured and quanti- fied using a cytotoxicity kit. Data are represented as mean ± SD of five independent biological replicates, one-way analysis of variance (ANOVA). Source data are provided as a Source Data file.


그림 5|생체모방 교모세포종(GBM) 모델을 사용하여 시험관 내에서 R-SiO2-TPZ 나노입자가 탑재된 CAR 호중구의 기능 평가. 세포 삽입막의 내피 세포와 동일한 트랜스웰 바닥의 종양 세포로 구성된 혈액 뇌 장벽(BBB)을 갖춘 GBM의 체외 종양 모델의 도식입니다. b 12 시간 동안 호중구의 Transwell 이동 분석이 표시됩니다. 24시간(c) 및 36시간(d)에 표시된 호중구의 항GBM 세포독성을 측정하고 정량화했습니다. e 36시간에 표시된 호중구에서 방출된 IL{10}} 및 TNF의 ELISA 분석을 수행했습니다. f 48시간에 다른 호중구의 두 번째 이동이 표시됩니다. g 60시간에 표시된 호중구의 항GBM 세포독성을 측정하고 정량화했습니다. h – j 시험 관내 호중구 침윤 3 차원 (3D) 종양 모델의 도식은 ( h )에 표시되었습니다. 3D 종양 모델에서 침윤된 호중구의 대표적인 형광 이미지가 표시되었습니다. DAPI는 세포 핵을 염색하는 데 사용되었고 CD45는 호중구를 염색하는 데 사용되었습니다. 스케일 바, 200μm. 생물학적 삼중 실험은 독립적으로 수행되었습니다. j 표시된 호중구의 해당 종양 살해 능력을 세포 독성 키트를 사용하여 측정하고 정량화했습니다. 데이터는 5개의 독립적인 생물학적 복제의 평균 ± SD, 일원 분산 분석(ANOVA)으로 표시됩니다. 소스 데이터는 소스 데이터 파일로 제공됩니다.

CAR-호중구@R-SiO2-TPZ NP가 이종 이식 마우스에서 종양 성장을 크게 둔화시키는 반면, CAR-호중구, SiO2-TPZ NP 및 CAR-호중구@R-SiO2-TPZ NP의 실험 그룹에서 동물 생존의 차이는 미미합니다. (p > 0.05), 이는 세포 준비 및 주입 중에 수명이 짧은 호중구의 사망으로 인한 것일 수 있습니다. 다음으로 우리는 이 세 그룹에 초점을 맞추고 세포 준비 시간을 줄이고 CAR-호중구와 나노 약물의 복용량을 늘리면 동물 생존에 차이가 있는지 확인했습니다(그림 7g). 6회 전신 투여했을 때 CAR-neutrophil@R-SiO2-TPZ NP는 종양 보유 마우스의 수명 연장에서 다른 두 그룹보다 성능이 뛰어난 반면(그림 7h), CAR-호중구와 SiO2- 그룹의 동물 생존 차이는 다음과 같습니다. TPZ NP는 미미한 수준으로 유지되었습니다. R-SiO2- TPZ 그룹의 유사한 생존 곡선이 두 개의 독립적인 동물 연구에서 관찰되었지만, 처음 4개의 호중구 동안 세포 분리 및 주사 준비 시간이 총 ~4시간에서 1시간으로 감소했습니다. 복용량은 32일 이전에 CAR-호중구 그룹의 동물 생존율을 향상시켰습니다. 종합적으로, 우리의 데이터는 호중구 치료제의 향후 임상 적용에서 호중구 준비 및 용량 최적화의 중요성을 입증했습니다.

논의

마우스 호중구는 염증이 있는 수술 후 뇌종양에 나노약물을 효율적으로 전달하는 강력한 운반체로 입증되었습니다8,9. 그러나 약물 전달에 인간 호중구를 사용하는 것의 타당성과 안전성은 아직 파악하기 어렵습니다. 치료 효과를 달성하기 위해 이 연구에서 사용된 다량의 마우스 호중구(마우스의 순환 호중구 총 수보다 10배 더 높음11)는 암 환자로부터 많은 수의 호중구를 추출하면 호중구 감소증을 유발할 수 있으므로 임상적 번역을 더욱 방해할 수 있습니다. 다른 위험. 이러한 문제를 해결하기 위해 우리는 자가 재생 hPSC의 힘을 활용하여 무제한의 새로운 인간 호중구를 얻었습니다. 우리는 CAR 공학29을 통해 강력한 생체 영감 호중구 매개 약물 전달 시스템을 개발했으며 조작된 인간 CAR 호중구를 눈에 띄는 항종양 활동을 하는 나노운반체로 사용했습니다. 거친 SiO2 NP는 CAR-호중구 운반체에서 부드러운 SiO2 NP보다 더 잘 작동하며, 이는 호중구가 거친 미생물 병원체를 우선적으로 식균한다는 이전 관찰과 일치합니다30. 호중구는 신경교종 세포의 증식과 진행을 촉진하는 것으로 보고되었습니다. 우리는 동물 연구에서 변형되지 않은 호중구의 유사한 종양 전이 효과를 관찰했으며, 이는 약물 전달 및 기타 치료 응용 분야에서 안전성을 보장하기 위해 CCAR 공학 또는 호중구의 기타 변형의 필요성을 강조했습니다. 특히, CAR 호중구 매개 약물 전달은 GBM의 기본 화학 유인 능력에만 의존하지만 증폭된 수술 후 염증 신호에는 의존하지 않습니다. 이는 깊이 침윤된 신경교종을 근절하는 데 있어 약물 전달 시스템의 높은 특이성과 치료 잠재력을 시사합니다. 수술로 제거할 수 없는 것입니다. 수술적 절제와 보조 화학요법/방사선 요법이 GBM12에 대한 주요 임상 중재이기 때문에 CAR 호중구 나노운반체와 수술/방사선 요법을 사용한 병용 치료는 최적의 치료 효능을 달성할 수 있으며 추가 조사가 가치가 있습니다. T 및 NK 세포 특이적 CAR 구축물은 T 및 NK 세포의 항종양 활성을 강화하기 위해 널리 사용되어 왔지만, 호중구의 항종양 기능을 향상시키는 호중구 특이적 CAR은 기술된 바가 없습니다. CD4ζ 및 CD4 키메라 면역 수용체는 시험관 내에서 HIVenv로 형질감염된 세포에 대한 호중구의 세포용해를 향상시키는 것으로 이전에 보고되었습니다. 그럼에도 불구하고, 용해 효율은 이펙터 대 표적(E:T) 비율이 10:128에서 ~10%에 불과했습니다. Fc RIIA(CD32a)는 호중구(30,{39}} ~ 60,000 분자/세포31)에서 고도로 발현되는 단량체 IgG에 대한 친화도가 낮은 단일 사슬 막관통 수용체이며, 이의 결찰은 Fc - 과립 내용물 방출, Ca{44}} 동원, 항종양 세포독성 및 식세포작용과 같은 호중구의 의존적 기능. 호중구의 활성화 및 기능에서 CD32a의 두드러진 역할을 고려하여 우리는 CD32a 기반 CAR 구조를 설계하고 테스트했습니다. 그러나 우리의 결과는 CD3ζ가 hPSC 유래 호중구에서 발현될 때 CD32a보다 훨씬 더 나은 세포 용해를 매개한다는 것을 보여주었습니다. 이는 부분적으로 CD32a보다 CD3ζ의 ITAM 사본이 더 높기 때문일 수 있습니다. 각각 3개 및 1개 사본, 그리고 더 높은 발현 수준 ζ 호중구의 세포 표면보다. CD32a와 마찬가지로 Fc RIII(CD16b)는 단량체성 IgG에 대한 또 다른 저친화도 수용체이며 호중구에서 CD32a보다 훨씬 높은 수준으로 발현됩니다31. CD16b의 가교결합은 Ca2+ 동원 및 탈과립화만 유도하고 호중구의 식균작용 및 세포용해는 유도하지 않지만28,50 CD3ζ- 및 CD16b의 능력에 대한 체계적인 비교를 수행하는 것은 향후 연구에서 여전히 흥미로울 것입니다. -호중구의 항종양 기능을 촉발하고 강화하는 CAR.

imageFig. 6 | In vivo distribution of CAR neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ nanoparticles (NPs). a Schematic of intravenously administered Cy5-labeled CAR neutrophil@R-SiO2 NPs and R-SiO2 NPs for in vivo cell tracking study. 5 × 105 luciferase (Luci)-expressing U87MG cells were stereotactically implanted into the right forebrain of NRG mice. After 4 days, mice were intravenously treated with PBS, 5 × 106 Cy5-labeled CAR neutrophil@R-SiO2 NPs and R-SiO2 NPs. b Time-dependent biodistribution of Cy5+ neutrophils in the whole body, brain, and other organs was determined and quantified by fluorescence imaging at the indicated hours. c Biodistribution of CAR neutrophil@R-SiO2 NPs and R-SiO2 NPs in mice at 24 h post-injection was analyzed by inductively coupled plasma-optical emission spectrometry (ICP-OES) based on Si element, and data was expressed as the percentage of injected dose per gram of tissue (%ID/g). n = 5 biologically independent samples. Data are represented as mean ± SD. Source data are provided as a Source Data file. d Representative fluorescence images of CD45 and SiO2 in the indicated glioblastoma xenografts isolated from tumor-bearing mice were shown. Scale bars, 100 μm. Biological triplicates were performed independently.

그림 6|CAR 호중구 전달 R-SiO2-TPZ 나노입자(NP)의 생체 내 분포. 생체 내 세포 추적 연구를 위한 정맥 투여 Cy{4}}표지 CAR neutrophil@R-SiO2 NP 및 R-SiO2 NP의 도식. 5 × 105 루시퍼라제(Luci) 발현 U87MG 세포를 NRG 마우스의 오른쪽 전뇌에 정위적으로 이식했습니다. 4일 후, 마우스를 PBS, 5 x 106 Cy5-표지된 CAR neutrophil@R-SiO2 NP 및 R-SiO2 NP로 정맥 내 처리했습니다. b 전신, 뇌 및 기타 기관에서 Cy5+ 호중구의 시간에 따른 생체 분포를 표시된 시간에 형광 이미징으로 결정하고 정량화했습니다. c 주입 후 24시간에 마우스에서 CAR neutrophil@R-SiO2 NP 및 R-SiO2 NP의 생체분포를 Si 원소를 기반으로 한 유도 결합 플라즈마 광학 방출 분광법(ICP-OES)으로 분석하고 데이터를 백분율로 표시했습니다. 조직 1g당 주사량(%ID/g). n=5 생물학적으로 독립적인 샘플. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. 소스 데이터는 소스 데이터 파일로 제공됩니다. d 종양 보유 마우스로부터 분리된 표시된 교모세포종 이종 이식편의 CD45 및 SiO2의 대표적인 형광 이미지가 표시되었습니다. 스케일 바, 100μm. 생물학적 삼중 실험은 독립적으로 수행되었습니다.

Fig. 7 | In vivo anti-tumor activities of combinatory CAR-neutrophils and R-SiO2-TPZ nanoparticles (NPs) were assessed via intravenous injection. a Schematic of intravenously administered PBS, PB-neutrophils, CAR-neutrophils, and CAR-neutrophil@ R-SiO2-TPZ NPs for in vivo tumor-killing study. 5 × 105 luciferase (Luci)-expressing U87MG cells were stereotactically implanted into the right forebrain of NRG mice. After 4 days, mice were intravenously treated with indicated neutrophils weekly for a month. Time-dependent tumor burden was determined (b) and quantified (c) by bioluminescent imaging (BLI) at the indicated days. Data are mean ± SD for mice in (b) (n = 5), one-way analysis of variance (ANOVA). d Kaplan-Meier curve demonstrating survival of indicated experimental groups (n = 5) was shown. Released human tumor necrosis factor-α (TNFα) and IL-6 in the peripheral blood (e) and body weight (f) of different mouse groups were measured at the indicated days. Data are mean ± SD, n = 5 biologically independent samples. g, h Anti-tumor activity of increased dosage frequencies of CAR-neutrophils and RSiO2-TPZ NPs was assessed. g Schematic of intravenously administered CAR-neutrophils, R-SiO2-TPZ NPs, and CAR-neutrophil@ R-SiO2-TPZ NPs for in vivo tumor killing study. h Kaplan-Meier curve demonstrating survival of indicated experimental groups was shown (n = 5). Kaplan–Meier curves were analyzed by the log-rank test. Source data are provided as a Source Data file.


그림 7|복합 CAR-호중구와 R-SiO2-TPZ 나노입자(NP)의 생체 내 항종양 활성을 정맥 주사를 통해 평가했습니다. 생체 내 종양 사멸 연구를 위해 정맥 투여된 PBS, PB-호중구, CAR-호중구 및 CAR-호중구@R-SiO2-TPZ NP의 도식. 5 × 105 루시퍼라제(Luci) 발현 U87MG 세포를 NRG 마우스의 오른쪽 전뇌에 정위적으로 이식했습니다. 4일 후, 쥐에게 한 달 동안 매주 지시된 호중구를 정맥 내 투여했습니다. 시간에 따른 종양 부담은 표시된 날짜에 생물발광 이미징(BLI)에 의해 결정되고(b) 정량화되었습니다(c). 데이터는 (b)(n{17}}), 일원 분산 분석(ANOVA)의 마우스에 대한 평균 ± SD입니다. 표시된 실험 그룹(n{20}})의 생존을 보여주는 d Kaplan-Meier 곡선이 표시되었습니다. 서로 다른 마우스 그룹의 말초 혈액(e) 및 체중(f)에서 방출된 인간 종양 괴사 인자-(TNF ) 및 IL-6를 지정된 날짜에 측정했습니다. 데이터는 평균 ± SD, n=5 생물학적으로 독립적인 샘플입니다. g, h CAR-호중구 및 RSiO2-TPZ NP의 증가된 투여 빈도에 대한 항종양 활성을 평가했습니다. g 생체 내 종양 사멸 연구를 위해 정맥 투여된 CAR-호중구, R-SiO2-TPZ NP 및 CAR-호중구@R-SiO2-TPZ NP의 도식. h 표시된 실험 그룹의 생존을 보여주는 Kaplan-Meier 곡선이 표시되었습니다 (n=5). Kaplan-Meier 곡선은 로그 순위 테스트로 분석되었습니다. 소스 데이터는 소스 데이터 파일로 제공됩니다.

우리는 또한 다른 인간 질병을 치료하기 위한 다른 호중구 기반 노력을 지원하기 위해 향후 재설계 및 조정될 수 있는 모듈식 다용도 hPSC 호중구 약물 전달 플랫폼을 여기에 제시했습니다. 첫째, CAR 엔지니어링은 일차 면역 T 세포 및 호중구보다 hPSC에서 더 접근하기 쉽습니다. 다양한 CAR의 안정적이고 균질한 발현을 달성하려면 일회성 게놈 편집만 필요합니다. CLTX CAR 외에도 우리는 보편적인 항플루오레세인(FITC)51 또는 항PD-L1 CAR52를 발현하는 안정적인 hPSC 라인을 구축했으며, 두 가지 모두 보편적인 고형 종양 표적화 나노운반체 CAR-호중구를 얻기 위해 활용될 수 있습니다. 항-FAP CAR을 표적으로 하는 섬유증53과 같은 다른 유전자 변형을 수행하여 호중구 나노운반체를 사용하여 뇌 외상 및 심장 섬유증을 비롯한 치명적인 퇴행성 질환을 치료할 수도 있습니다. 더욱이, CAR 발현 hPSC는 CAR-T 또는 CAR-NK 세포를 생산하도록 쉽게 적응될 수 있으며, 이러한 면역요법과 CAR 호중구 나노운반체의 조합은 최적의 치료적 항종양 이점을 달성할 수 있습니다. 마지막으로, 우리의 생체 영감을 받은 종양 글루타티온(GSH) 반응성 나노약물 시스템은 임상 TMZ, JNJ64619187 및 전구약물 TPZ의 예시처럼 표적 약물 전달을 위해 유망한 화학요법 또는 방사성 약물을 CAR 호중구에 로드하는 모듈식 다용도 플랫폼입니다. 다른 나노입자 테스트에 대한 향후 연구는 호중구에 최적화된 약물 로딩을 제공하고 최대 생체 내 치료 효능을 달성할 수 있습니다.

우리는 CAR 호중구를 사용하여 BBB를 통해 뇌종양에 화학약물을 구체적이고 효율적으로 전달하는 치료 개념을 입증했지만 이 연구에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 4-일의 종양 세포 접종은 치료 조사를 위한 임상 시나리오를 모방하는 종양을 확립하는 데 충분하지 않을 수 있으며, 교모세포종 발생의 다양한 단계와 치료 반응을 다양한 단계에서 요약하기 위해 다양한 종양 접종 기간을 사용한 향후 연구가 필요합니다. 환자54,55. 둘째, 우리가 여기서 사용한 면역결핍 마우스에는 적응성 면역이 부족하고, 자연 신경교종이 있는 애완견과 같은 온전한 면역 체계를 가진 기타 전임상 모델은 시험관 내에서 생성된 CAR 호중구의 안전성과 효능을 더 잘 평가하는 데 필요합니다. 특히, 짧은 수명에도 불구하고 CAR-T 세포에서 관찰되는 사이토카인 방출 증후군, 신경 독성 및 표적 외 종양 독성을 포함하여 주입된 동물에 나노 약물을 로딩하거나 로딩하지 않은 CAR 호중구의 표적 외 독성 프로파일링이 필요합니다57 호중구의. 저면역원성 보편적 기증자 hPSCs58-61 및 인간 백혈구 항원(HLA)-동형접합성 hPSC 라이브러리 은행62과 같은 실행 가능한 접근법은 이식편대숙주병(GvHD)의 잠재적 위험을 피하기 위해 쉽게 이용 가능하지만, 전임상 동물 모델은 호중구 치료제의 번역 가능성을 평가하려면 손상되지 않은 면역 체계가 여전히 필요합니다. 마지막으로, CAR-호중구 나노약물 치료제의 제한된 항종양 세포독성 및 동물 수명 연장이 관찰되었습니다. 따라서 CAR-호중구 치료제의 최대 항종양 효능을 달성하려면 보다 효과적인 화학요법 약물이나 방사선감작제, 그리고 기존 CAR-T와 수술적 절제를 사용한 병용 요법에 대한 향후 탐색이 필수적입니다. 예를 들어, 메커니즘 기반 설계에 대한 최근 연구를 통해 임상 TMZ 약물에서 관찰된 획득 저항을 극복하고 잠재적으로 모듈형 CAR-호중구 나노 약물 플랫폼에 통합될 수 있는 보다 효과적인 약물 KL-50이 탄생했습니다 더 나은 치료 효능. CLON-G(카스파제-리소좀 막 투과화-산화제-괴사 억제 + 과립구 콜로니 자극 인자64) 처리 및/또는 CAR 호중구에서 장기간 제어된 약물 방출 시스템을 사용하여 호중구의 유효 기간을 5일로 연장하는 것도 가능합니다. 호중구 세포사멸 후 지속적인 생체 내 항종양 효능을 달성합니다. 종합적으로, 우리의 연구 결과는 R-SiO2-TPZ가 탑재된 CAR-호중구가 항종양 N1 표현형을 유지하고 시험관 내 다양한 ​​종양 틈새 유사 조건에서 종양 세포를 효율적으로 죽일 수 있음을 분명히 보여주었습니다. 기능성 CAR-호중구는 또한 생체 내에서 GBM을 표적으로 하는 종양 미세환경 반응 나노 약물을 정확하게 전달하기 위해 조작된 hPSC에서 대량으로 생산될 수 있으며, 이는 강력하고 구체적인 항 GBM 활동과 최소한의 표적 외 약물 전달을 갖춘 복합 화학 면역 요법으로 이어질 수 있습니다. 종양이 있는 쥐의 수명이 연장되었습니다.

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