망간(II) 복합체는 DNA 손상을 악화시키고 CGAS-STING 경로를 활성화하여 항종양 면역을 자극합니다.

인터페론 유전자(cGAS-STING) 경로의 순환 GMP-AMP 신타제 자극제를 활성화하는 것은 암 치료를 위한 유망한 면역치료 전략입니다. 망간(II) 복합체 MnPC 및 MnPVA(P= 1,10-페난트롤린, C= 염소 및 VA=발프로산)가 cGAS-STING 경로를 활성화하는 것으로 밝혀졌습니다. . 이 복합체는 DNA를 손상시켰을 뿐만 아니라 히스톤탈아세틸라제(HDAC)와 폴리아데노신 디포스페이트-리보스 폴리머라제(PARP)를 억제해 DNA 손상 복구를 방해해 DNA 단편이 세포질로 누출되는 것을 촉진했다. DNA 조각은 cGAS-STING 경로를 활성화하여 선천적 면역 반응과 종양 세포와 이웃 면역 세포 간의 양방향 통신을 시작했습니다. 활성화된 cGAS-STING은 유형 I 인터페론의 생성과 염증성 사이토카인(TNF-α 및 IL-6)의 분비를 더욱 증가시켜 수지상 세포와 대식세포의 종양 침윤을 촉진하고 세포독성 T 세포를 자극합니다. 시험관 내 및 생체 내에서 암세포를 죽이기 위해. 향상된 DNA 손상 능력으로 인해 MnPC와 MnPVA는 Mn2+ 이온보다 더 강력한 면역 능력과 항종양 활성을 보여 암 치료를 위한 화학면역치료제로서 큰 잠재력을 보여줍니다.

cistanche tubeulosa-항종양의 장점

소개

종양의 재발, 전이 및 약물 저항성은 기존 항종양 약물에 큰 어려움을 안겨줍니다.1 면역요법은 환자의 면역체계를 활용하거나 강화하여 종양 세포를 근절하는 효과적인 전략입니다.2,3 지난 10년 동안 다음을 포함한 여러 암 면역요법이 개발되었습니다. 적응성 항종양 면역을 강화하기 위해 면역 관문 억제제, 종양 용해 바이러스 및 키메라 항원 수용체 T(CAR-T) 세포가 임상 실습에 적용되었습니다.4-6 그러나 일차 및 적응성 약물 저항성, 부적절한 면역 활성화, 종양 특이성 면역의 상실 등이 있었습니다. 항원 표적은 종종 면역요법의 효능을 약화시킵니다.7,8 적응성 항종양 면역은 강력한 선천성 면역에 크게 의존합니다.8 적응성 항종양 면역을 형성하고 유지하는 것 외에도, 숙주 세포를 방어하기 위한 휴식 장벽인 선천성 면역 체계는 다음과 같은 핵심적인 역할을 합니다. 불행하게도 종양이 진행되는 동안 악성 세포는 종종 면역 감시를 회피하여 결국 "차가운" 종양으로 발전합니다.10,11 따라서 선천성 면역을 활성화하고 적응성 항종양 면역과의 상호 작용을 촉진하면 면역 체계가 강화될 수 있습니다. 종양에 대한 반응을 개선하고 면역요법의 치료 효과를 향상시킵니다. 인터페론 유전자의 순환 GMP-AMP 신타제 자극제(cGAS-STING)는 선천성 면역의 필수 구성요소를 구성하며, 이는 암 면역요법의 유망한 표적으로 나타났습니다. cGAS-STING 경로의 활성화는 일련의 하류 면역을 유발합니다. I형 인터페론(IFN-Is) 및 전염증성 인자 IL-6의 방출 및 분비를 유도하는 TANK 결합 키나제 1(TBK1) 및 인터페론 조절 인자 3(IRF3)의 자극 및 동원을 포함한 신호 이벤트 TNF-a. 13,14 IFN은 이후 수지상 세포(DC)의 성숙과 이동을 촉진하고, 자연 살해(NK) 세포 매개 세포 독성 효과를 강화하며, 교차 프라임 종양 특정 T 세포를 강화하여 선천적 및 적응성 면역을 조율하여 행동을 조절합니다. 현재, 소분자 경구 작용제 MSA-2, 천연 작용제 순환 디뉴클레오티드(CDN),18 및 일부 나노 시스템19-23의 치료 과정이 쥐 종양 모델에서 테스트되었습니다. cGAS-STING 경로에 개입합니다. 망간(Mn)은 항종양 면역 반응을 포함한 많은 생리학적 과정에서 중요한 역할을 하는 영양 미량 원소입니다.24,25 최근 Mn2+ 이온이 이중 가닥 DNA(dsDNA) 센서의 감도를 향상시키는 것으로 밝혀졌습니다. cGAS를 생성하고 2차 전달자 cGAMP의 생성을 유발하여 cGAMP-STING 결합 친화력을 증가시켜 STING 활성을 증가시킵니다. 또한 Mn2+ 이온은 CD의 기능을 촉진하여 간접적으로 종양 진행을 억제합니다8+ 생체 내에서 IFN 생산을 유도함으로써 T 세포. 27 그럼에도 불구하고, 생체 내에서 Mn2+ 이온을 직접 투여하는 것은 종양 미세환경23에서 효과적인 농도를 보장할 수 없으며 과도한 Mn2+ 이온은 돌이킬 수 없는 신경 독성 및 심혈관 독성과 같은 시스템 독성을 유발할 수 있습니다.28 Mn 복합체는 더 리간드의 보호 효과로 인해 생체분자에 대해 안정적이고 불활성이므로 Mn2+ 이온의 독성을 완화할 수 있습니다. 그러나 지금까지 cGAS-STING 경로를 활성화하는 데 Mn 복합체가 사용되지 않았습니다. 후생적 변형은 유전자 발현을 가역적으로 변경하여 암의 시작 및 진행과 항종양 면역 억제에 기여할 수 있습니다. 후생적 변형의 가역적 특성으로 인해 악성 세포가 정상 상태로 돌아갈 수 있습니다.29,30 히스톤 데아세틸라제(HDAC)는 단백질 아세틸화, 염색질 역학, 단백질 교체 및 DNA 손상 반응을 중재합니다. HDAC 억제제는 염색질을 표적으로 삼아 대부분의 또는 모든 종양 유형에 작용하는 강력한 후생적 조절제의 일종입니다.31 HDAC의 억제는 적어도 부분적으로 히스톤 아세틸화에 기여하여 DNA 이중 가닥 파손의 형성 및 복구를 변경합니다( DSB)32,33 이는 암세포의 약물 저항성을 없애는데 기여할 수 있습니다.34 HDAC 억제제에 의해 유도된 이완된 염색질 구조는 화학요법제가 DNA에 더 쉽게 접근하도록 촉진하여 DNA 손상을 악화시킬 수 있으며35 이는 암세포의 활성화에 유익합니다. cGAS STING 경로. 발프로산(VA)과 같은 일부 HDAC 억제제는 암세포를 DNA 손상 치료법에 민감하게 만드는 클래스 I 및 II HDAC(HDAC1/2)에 영향을 미칩니다.36

cistanche tubeulosa - 면역 체계를 향상시킵니다.

폴리아데노신 이인산-리보스 중합효소(PARP)는 화학요법에 대한 암 저항성과 관련된 필수 단백질입니다. 이들 효소는 DNA 단일 가닥 파손(SSB)의 복구에 중요하며37 세포사멸, 면역 반응, 유전자 전사 및 염증과 같은 여러 세포 과정에 참여합니다.38-40 PARP 억제제는 DNA 병변의 복구를 방지합니다. 이는 cGAS에 의해 인식되어 cGAS-STING 경로를 활성화하는 세포질 DNA의 농축으로 이어집니다. 백금, 루테늄 및 금을 포함한 일련의 항암 금속 복합체가 PARP 활성을 억제하는 것으로 밝혀졌습니다.43, 44 여기에서 우리는 두 가지 MnII 복합체 MnPC와 MnPVA의 면역 자극 및 항종양 특성을 보고합니다. 복합체의 화학적 및 결정 구조는 그림 1에 나와 있습니다. 이 복합체에서 1,{12}}페난트롤린(P)은 무독성 DNA 삽입제이고 VA는 HADC의 억제제입니다.31 VA는 아세틸화를 촉진할 수 있습니다. DNA 결합 히스톤 단백질의 결합은 완화된 염색질 내 DNA의 접근성을 향상시키고 휴면 종양 억제 유전자를 재활성화합니다.33,35 우리는 1,10-페난트롤린 및/또는 VA를 MnPC 또는 MnPVA에 통합하면 DNA 손상을 유도하고 항종양 면역을 자극하여 항증식 활성을 갖는 복합체입니다. 일련의 실험에 따르면 MnPC와 MnPVA는 DNA를 효과적으로 손상시키고, 종양과 면역 세포에서 cGAS-STING 경로를 활성화하며, IFN과 전염증성 사이토카인의 분비를 증가시키는 것으로 나타났습니다. 특히, MnPVA는 HDAC1/2 및 PARP1의 활성을 억제하여 MnPC보다 cGAS-STING 경로를 더 효과적으로 활성화했습니다. 모든 결과는 in vitro와 in vivo에서 모두 확인되었습니다. 우리가 아는 한, MnPC와 MnPVA는 주로 DNA 손상으로 시작되는 cGAS-STING 경로를 통해 항종양 면역을 활성화하여 종양 세포를 억제하는 다기능 MnII 복합체입니다.

그림 1 MnPC와 MnPVA의 화학 및 결정 구조. 명확성을 위해 수소 원자는 생략되었습니다.

결과 및 토론

화학적 및 물리적 특성

MnPC 및 MnPVA는 문헌 방법45,46에 따라 제조되었으며 원소 분석, IR 분광학(그림 S1†), 전자 상자성 공명(그림 S2,† EPR) 및 X선 결정학을 통해 완전히 특성화되었습니다. 결정 구조 매개변수와 선택된 결합 길이 및 각도는 표 S1 및 S2에 나와 있습니다(ESI† 참조). 이들 복합체의 Mn 원자는 좌표수가 6인 왜곡된 팔면체 기하구조를 나타냈습니다. MnPC는 공간군 P21/c를 갖는 단사정계 결정계에서 결정화되었습니다. MnII는 2개의 두자리 1,{{10}}페난트롤린 리간드와 2개의 Mn-Cl 결합으로 4개의 Mn-N 결합을 형성했습니다. Mn–N 결합 길이는 2.281~2.369 Å 사이에서 다양합니다. 즉, Mn–N1, Mn–N2, Mn–N3 및 Mn–N4의 결합 길이는 2.369(4), 2.281(3), 2.341(3)입니다. ) 및 2.287(3) Å이고 N1–Mn–N2, N1–Mn–N4 및 N2– Mn–N3의 각도는 71.15(11)도, 97입니다.86(11) 도 및 89.00(11) 도입니다. 이 구조는 MnPC가 공간군 P1을 갖는 삼사정계 결정계에서 결정화되는 Abbas et al.(45)에 의해 보고된 것과 다소 다릅니다. 따라서 이러한 경우 해당 결합 길이와 각도가 다릅니다. 보고된 구조와 유사하게, MnPVA는 N2O4 공여체 세트를 갖는 공간군 C2/c를 갖는 단사정계 결정계에서 결정화되었습니다. MnII는 각각 1,10-페난트롤린의 N 원자 2개와 물 분자 1개와 VA 리간드 2개의 O 원자 4개와 배위 결합합니다. VA 중 하나는 한자리 리간드로 반응했고, 다른 하나는 두자리 리간드였습니다. Mn–N1 및 Mn–N2의 결합 길이는 각각 2.265(19) 및 2.298(2) Å이고, Mn–O1, Mn–O2, Mn–O3 및 Mn–O5의 결합 길이는 2.2476(19)입니다. 각각 2.260(2), 2.0639(18) 및 2.1471(17)Å. 강한 N, Nchelating 리간드인 1,10-phenanthroline은 탈금속화에 대해 Mn 복합체를 안정화시킵니다. 인산염 완충 식염수(PBS, 0.5% v/v DMSO, pH 7.4 및 37도) 및 세포 배양 배지(10% FBS 함유)에서 MnPC 및 MnPVA의 안정성을 UV 가시 분광학으로 조사했습니다(그림 S3†). ). 시간 의존적 UV 스펙트럼은 이들 복합체가 72시간 이내에 안정하다는 것을 보여줍니다.

풀 사이즈 테이블 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD, n=3)로 표시됩니다.

항증식 활성

인간 삼중 음성 유방암(MDA-MB-231), 인간 췌장암(PANC{3}}), 인간 간세포암(HepG2), 마우스 유방암(4T1) 세포에 대한 화합물의 항증식 활성 세포주와 인간 정상 세뇨관 상피(HK-2) 세포주를 MTT 분석으로 평가했습니다. MnCl2, VA, 시스플라틴(CDDP) 및 1,{10}}페난트롤린(P)을 기준 화합물로 사용했습니다. 72시간에서의 최대 억제 농도(IC50)의 절반은 표 1에 나열되어 있습니다. MnPC와 MnPVA는 테스트한 모든 암 세포주, 특히 MDA-MB-231 및 PANC-1에 대해 강력한 항증식 활성을 나타냈습니다. CDDP에 둔감한 세포로 각각 약 8- 및 11-배 더 높은 활동을 나타냅니다. HepG2 및 4T1에 대한 MnPC 및 MnPVA의 항증식 활성은 CDDP의 항증식 활성과 유사합니다. 흥미롭게도 MnPC와 MnPVA 모두 HK-2 세포에 대한 독성이 감소한 것으로 나타났으며 IC50 값은 CDDP의 값보다 약간 더 높았습니다. 대조적으로, MnCl2, VA 및 P는 이들 세포주에서 거의 독성이 없었으며 이는 문헌과 일치합니다. 13,36 이러한 결과에 따르면 다음 조사는 MDA-MB에 대한 MnPC 및 MnPVA의 작용에 중점을 두었습니다. -231 셀.

세포 흡수 및 DNA 손상

Mn 측면에서 MDA-MB-231 세포의 복합체 축적은 24시간 동안 ICP-MS 공동 배양을 통해 측정되었습니다. 그림 2A에서 볼 수 있듯이 축적은 MnPVA > MnPC > MnCl2의 순서를 따르며 항증식 활성과 일치합니다. 우리는 ICP-MS를 통해 MDA-MB-231 세포에서 DNA 결합 Mn을 추가로 결정했습니다. 그림 2B에서 볼 수 있듯이 MnPC와 MnPVA는 아마도 세포 흡수가 더 높기 때문에 MnCl2보다 더 큰 DNA 결합 능력을 나타냈습니다. 인산화된 히스톤 g-H2AX는 DNA 이중 가닥 절단(DSB)의 민감한 마커입니다.47 Mn 복합체에 의해 유발된 DNA 손상을 평가하기 위해 우리는 면역블롯팅을 통해 gH2AX의 발현을 검출했습니다. 그림 2C에서 볼 수 있듯이 MnPC와 MnPVA는 24시간에 MDA-MB-231 세포에서 g-H2AX의 발현을 증가시켰습니다. P의 금속 착물은 효과적인 DNA 삽입물질로 알려져 있지만48,49 그러나 P만으로는 DNA 손상을 거의 일으키지 않습니다(그림 S4†). 4T1 종양이 있는 쥐의 종양 조직에서 g-H2AX의 발현은 16일 동안 2일에 한 번씩 각 화합물(kg당 1.3mg Mn)을 사용한 ER 치료 후 면역 반응을 통해 조사되었습니다. MnPC와 MnPVA는 종양 조직의 DNA를 효과적으로 손상시킨 반면, MnCl2와 PBS는 g-H2AX에 거의 영향을 미치지 않았습니다(그림 S5†). MDA-MB- 231 세포에서 배양 배지 상층액으로 방출된 dsDNA는 Mn 복합체를 처리한 ELISA 키트를 사용하여 측정했습니다. 그림 2D에 제시된 바와 같이, MnPC 또는 MnPVA 처리 세포 배양 배지의 dsDNA 함량은 다른 그룹의 것보다 분명히 높았습니다. 결과는 MnPC와 MnPVA가 게놈 DNA의 불안정성과 세포질 DNA 수준을 높일 수 있음을 시사합니다. DNA 손상의 특성은 송아지 흉선 DNA-브로마이드에티듐(EB) 시스템의 형광 변화를 측정하여 처음으로 연구되었습니다. EB는 DNA에 결합할 때 형광을 크게 증가시키는 반면, 위치를 바꾸면 형광이 감소하는 인터칼레이터입니다.50 MnPC와 MnPVA는 형광 강도를 적당히 감소시켰으며(그림 S6†), 이는 이들 복합체가 삽입될 수 있음을 시사합니다. P의 평면 구조로 인해 결합된 EB를 대체하기 위해 DNA 홈에 삽입됩니다. 그러나 상호 작용은 강력한 공유 결합이 아닙니다. 일부 Mn 복합체는 세포 내 활성산소종(ROS)을 생성하고 산화 스트레스를 유발할 수 있으므로,51 우리는 2',7'-디클로로-플루오레세인 디아세테이트를 사용한 공초점 영상화를 통해 MDA-MB-231 세포에서 ROS를 검출했습니다. DCFH-DA)를 Mn 복합체에 18시간 동안 노출시킨 후 ROS 형광 프로브로 사용합니다. 그림 3에서 볼 수 있듯이 MnPC와 MnPVA는 대조군이나 MnCl2, 특히 MnPVA에 비해 세포 내 ROS 형광을 강화했는데, 이는 이들이 세포 DNA에 산화적 손상을 일으킬 수 있음을 시사합니다. DNA 손상은 암세포의 사멸 작용에 기여할 뿐만 아니라 cGAS-STING 경로를 활성화하여 항종양 면역을 자극합니다.14,52

그림 2 ICPMS로 측정한 세포 내 흡수(A)와 DNA에 결합된 Mn(B), 웨스턴 블랏으로 측정한 DNA 손상 마커 g-H2AX의 발현(C), ELISA 키트를 사용하여 측정한 세포외 dsDNA(D) MDA-MB-231 세포를 MnCl2, MnPC, MnPVA 및 VA(6 mM)로 각각 24시간 동안 처리했습니다.

세포주기 정지 및 세포 사멸

세포 DNA 손상 반응(DDR)은 세포 주기의 체크포인트 캡처를 구동하는 신호 전달과 관련이 있습니다.53 MDA-MB-231 세포의 세포 주기에 대한 Mn 복합체의 영향은 유세포 분석법으로 분석되었습니다. 그림 4A에서 볼 수 있듯이 MnPC와 MnPVA는 대조군과 MnCl2에 비해 G1 단계 정지를 약간 증가시키면서 G2 단계의 완전한 붕괴를 유발했습니다. 결과는 MnPC와 MnPVA에 의해 유발된 DNA 손상이 DNA 합성의 후기 단계를 심각하게 차단했음을 나타냅니다. 따라서 MnPC와 MnPVA의 항증식 메커니즘은 MnCl2의 항증식 메커니즘과 다릅니다. MDA-MB-231 세포의 사멸 모드는 복합체를 72시간 동안 처리하고 annexin V-FITC 및 요오드화 프로피듐(PI)으로 염색한 후 유세포 분석을 통해 조사되었습니다. 도 4B 및 S7에 도시된 바와 같이, 대조군 및 MnCl2와 비교하여 MnPC 및 MnPVA에 의해 유도된 세포사멸(초기 + 후기) 비율은 각각 84.0% 및 87.4%에 도달했습니다. 결과는 MnPC와 MnPVA가 강력한 세포사멸 촉진 능력을 가지며, 이는 이들의 항종양 활성과 밀접한 상관관계가 있음을 나타냅니다.

cistanche 보충 혜택 - 면역력 증가

미토콘드리아 막 전위

미토콘드리아는 선천성 면역의 중심 참가자이며, 미토콘드리아 DNA(mtDNA)는 선천성 면역 체계의 작용제로 인식됩니다.54 세포질 DNA와 mtDNA 모두 패턴 인식 수용체에 결합하여 cGAS-STING 신호 전달 경로를 촉발시키는 것으로 보고되었습니다. 55 MnPC와 MnPVA가 존재할 때 미토콘드리아에서 mtDNA 방출 가능성을 조사하기 위해 우리는 JC-1를 형광 탐침으로 사용하여 공초점 이미징으로 미토콘드리아 막의 무결성을 확인했습니다. 정상적인 미토콘드리아는 DJm이 높은 반면, 단량체로 존재하며 DJm이 낮은 손상된 미토콘드리아에서는 녹색 형광을 발산합니다. 56 그림 5에서 볼 수 있듯이, MnPC와 MnPVA는 JC-1로 염색된 MDA-MB-231 세포에서 적색 형광 강도를 크게 감소시켰습니다. MnPC 및 MnPVA 처리 세포의 "녹색(G) 대 빨간색(R)" 형광 비율은 각각 4.91 및 5.66으로 대조군(2.35) 및 MnCl{18}} 처리 세포에 비해 상당히 높습니다( 1.75). 관찰 결과는 미토콘드리아 막의 완전성이 MnPC 및 MnPVA에 의해 손상되었으며, 이는 cCAS-STING 경로를 유발하기 위해 mtDNA가 세포질로 누출되는 것을 촉진할 수 있음을 시사합니다.

그림 3 18시간 동안 배양하고 DCFH-DA(10mM)로 30분간 염색한 후 MDA-MB-231 세포에서 Mn 복합체(12mM)에 의해 생성된 ROS의 형광 공초점 영상.

그림 4 다양한 화합물(6mM)과 함께 24시간 동안 배양한 후 MDA-MB-231 세포의 세포 주기 정지(A) 및 배양 후 유세포 분석을 통한 MDA-MB-231 세포의 세포사멸 분석 72시간 동안 다양한 화합물(6mM)을 사용합니다(B).

HDAC의 활동 및 발현

HDAC 억제제는 염색질 구조를 변경하고 DNA 복구를 방해하여 암세포를 DNA 손상 치료법에 민감하게 만듭니다.33,35 클래스 I HDAC 억제제인 ​​VA는 HDAC1 및 HDAC2 효소를 선택적으로 표적으로 삼아 DNA 손상 신호를 조절하여 게놈 안정성을 파괴하고 종양을 억제합니다. 생체내 증식. 31 MnPVA에 VA를 통합하면 HDAC의 억제와 DDR의 유도를 보다 효율적으로 강화할 수 있습니다. 따라서 우리는 48시간 동안 동시 배양한 후 MDA-MB-231 세포의 전체 HDAC 활성에 대한 Mn 복합체의 효과를 결정했습니다. 그림 6A에서 볼 수 있듯이 MnPVA는 총 HDAC 활성을 크게 억제했으며 억제 활성은 VA보다 약 1.5배 더 높았습니다. 우리는 면역블롯팅을 통해 MDA-MB-231 세포에서 HDAC1/2 단백질의 발현을 추가로 연구했습니다. 그림 6B 및 C에서 볼 수 있듯이 MnPVA는 대조군과 비교하여 HDAC1 및 HDAC2의 발현을 분명히 하향 조절했습니다. MnPC는 HDAC 활성을 억제했지만 HDAC1/2 단백질의 발현에는 거의 영향을 미치지 않았습니다. 예기치 않게 알려진 HDAC 억제제인 ​​VA는 이 농도(6mM)에서 HADC1/2에 대한 명백한 억제를 나타내지 않았으므로 HADC에서 VA의 억제를 강화하는 데 Mn 조정의 필수적인 역할을 강조합니다. 결과는 MnPVA가 DDR을 촉진하고 cGAS-STING 경로를 유발하여 항종양 면역을 자극하는 HDAC1/2의 효과적인 억제제임을 나타냅니다. 우리는 각 화합물을 처리한 후 면역형광을 통해 4T1 종양이 있는 쥐의 종양 조직에서 HDAC의 발현을 추가로 검출했습니다. 그림 6D에서 볼 수 있듯이 MnPVA는 분명히 HDAC1의 발현을 감소시킨 반면 MnPC와 MnCl2는 HDAC1에 약간 또는 거의 영향을 미치지 않았습니다.

cistanche tubeulosa-항종양의 장점

PARP1 및 세포 사멸 단백질의 발현

PARP는 DNA 병변 복구에 중요한 역할을 합니다. PARP 억제제는 DNA 조각이 세포질로 이동하여 cGAS 매개 선천적 면역 반응을 유발하는 DNA 복구를 방지합니다.42 DNA 가닥 절단에 대한 센서 단백질인 PARP1은 DNA 손상 부위에 국한되어 DNA 복구를 지배합니다. 따라서 DNA는 암 치료의 중요한 표적이 됩니다. 카스파제, 특히 카스파제-3의 활성화는 세포사멸의 특징으로 간주되는 PARP1 절단을 통해 세포사멸을 시작할 수 있습니다.38,57 따라서 카스파제-3, PARP1 및 절단된 PARP1의 발현은 세포사멸의 특징으로 간주됩니다. MDA-MB-231 세포를 웨스턴 블랏으로 검사했습니다. 도 7에 도시된 바와 같이, MnPC 및 MnPVA는 대조군 및 다른 화합물에 비해 카스파제-3 및 절단된 PARP1의 발현을 현저하게 상향조절하였다. 활성화된 카스파제-3에 의한 PARP1의 절단은 DNA 결합 도메인을 촉매 도메인에서 분리하여 PARP 활성화 및 DNA 병변 복구를 방지합니다. 또한, PARP1의 억제는 종양 침윤 T 림프구의 수준을 증가시키고 선천성 면역 반응을 조절할 수 있습니다. DNA 복구 기능 장애는 세포사멸을 유발할 수 있는 전반적인 DNA 이상을 유발할 가능성이 있습니다. Proapoptotic Bax와 antiapoptotic Bcl-xL 단백질은 apoptosis에서 중추적인 역할을 합니다.38 따라서 우리는 Western blotting을 사용하여 48시간 동안 다양한 화합물로 처리한 후 MDAMB{23}} 세포에서 이들의 발현을 검출했습니다. MnPC와 MnPVA는 Bax의 발현을 현저하게 상향 조절하고 Bcl-xL의 발현을 하향 조절했습니다. 결과는 MnPC와 MnPVA가 PARP{27}}관련 캐스케이드 효과로서 세포사멸 단백질을 조절함으로써 세포사멸을 촉진할 수 있음을 나타냅니다. VA는 고용량에서 HDAC1/2의 발현을 억제하여 종양 세포의 세포사멸을 유도할 수 있지만58 이 조건에서는 이러한 세포사멸 단백질에 크게 영향을 미치지 않았으며 이는 Mn 복합체의 우수성을 나타냅니다.

그림 5 MnCl2, MnPC 및 MnPVA(6mM)와 각각 36시간 동안 배양하고 JC-1 형광 프로브로 염색한 후 MDA-MB{2}} 세포의 형광 이미지.

cGAS-STING 경로 활성화

PARP1 억제제는 암세포에서 cGAS-STING 신호전달 연속 반응을 유도할 수 있는 것으로 알려져 있습니다.40,59 cGAS는 바이러스, 세포사멸, 엑소좀, 미토콘드리아, 소핵이 포함된 DNA를 포함하여 다양한 세포질 dsDNA 배열을 인식하는 선천적 면역 센서입니다. 및 역요소 기원.60,61 MnPC 및 MnPVA에 의해 유도된 세포질 DNA의 농축은 cGAS-STING 경로를 활성화하는 데 유리한 환경을 만들었으며, 이는 이후 TBK1 및 IRF3의 모집 및 활성화를 통해 하류 신호 전달 이벤트를 시작합니다.12,59 따라서 우리는 24시간 동안 각 화합물에 노출된 후 면역블로팅을 통해 MDA-MB-231 세포에서 이러한 단백질의 발현을 검출했습니다. 도 8A에 도시된 바와 같이, MnPC 및 MnPVA는 cGAS, p-STING, p-TBK1 및 p-IRF3의 발현을 유의하게 증가시켰다. 또한 면역블롯팅을 통해 인간 단핵구 백혈병 THP{21}} 세포에서 cGAS-STING 경로에 대한 복합체의 효과를 조사했습니다. 그림 8B에서 볼 수 있듯이 MnPC와 MnPVA는 cGAS, p-STING, p-TBK1 및 p-IRF3, 특히 MnPVA의 상당한 상향 조절을 유도하여 cGAS-STING 경로를 활성화하여 차단에 대한 선천적 면역을 시작함을 나타냅니다. 종양은 THP-1 세포에 해를 끼치지 않고 탈출하여 적응 면역을 자극합니다(표 S3†). 대조적으로, MnCl2는 대조군과 비교하여 p-STING 또는 p-TBK1의 수준만 증가시켰고 cGAS 및 p-IRF3의 발현에는 거의 영향을 미치지 않았는데, 이는 낮은 농도에서 DNA 손상 및 PARP1 절단을 유도할 수 없기 때문일 수 있습니다. 따라서 p-IRF3 활성화와 같은 다운스트림 신호 이벤트를 트리거할 수 없습니다. 이러한 결과를 바탕으로 우리는 MnPC와 MnPVA가 종양 세포 내 핵 및 미토콘드리아 DNA 손상을 유발하고 DNA 조각을 세포질로 방출하여 cGAS-STING 경로를 활성화했다고 결론을 내렸습니다. 활성화된 cGAS-STING은 암세포의 노화 및 세포사멸 신호 전달 경로를 직접 활성화하여 양방향 항종양 면역 반응을 일으킬 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, MDA-MB-231 및 THP-1 세포에서 STING, TBK1 및 IRF-3의 발현은 거의 영향을 받지 않았습니다(그림 S8†).

그림 6 (A) HDAC 활성, (B) HDAC1/2 단백질의 발현, (C) 각 화합물(6mM)과 함께 배양한 후 MDA-MB{4}} 세포에서 GAPDH에 상대적인 단백질 함량 ELISA 키트와 웨스턴 블랏을 각각 사용하여 48시간을 결정했습니다. (D) 16일 동안 2일마다 각 화합물(kg당 1.3mg Mn)로 처리한 후 마우스의 4T1 종양 조직에서 HDAC1 발현의 면역형광 이미지. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.

인터페론 및 전염증성 사이토카인

TBK1 및 IRF3의 활성화는 IFN 및 IFN-b, TFN-α 및 IL-6과 같은 전염증성 사이토카인의 발현 및 분비를 유도할 수 있습니다.59,63 따라서 THP에 의해 방출된 세포외 IFN-I는 {8}} 세포와 MDAMB-231 세포에 의해 방출된 IFN-b, TNF-a 및 IL-6을 다양한 화합물과 함께 24시간 동안 배양한 후 ELISA 분석으로 측정했습니다. 도 9에 도시된 바와 같이, MnPC 및 MnPVA는 대조군, MnCl2 및 VA에 비해 IFN-I의 분비를 극적으로 향상시켰다. 동시에, 그들은 또한 IFN-b와 TNF-a의 ​​분비를 촉발시켰습니다. 그러나 IL-6 수준은 약간만 증가했습니다. IFN-1(IFN-a 및 IFN-b)은 DC의 성숙 및 항원 제시를 촉진하고 종양 특정 T 세포를 교차 프라이밍하여 선천 면역과 적응 면역을 연결하여 종양 세포를 죽이는 등 항종양 면역에서 다양한 면역자극 역할을 합니다.13 TNF -a는 순환 디뉴클레오티드(CDN) 매개 급성 암 괴사와 면역 팽창 조절에 관여합니다.59 결과는 MnPC와 MnPVA가 항종양 면역 반응을 자극할 수 있으며 다음과 같이 종양의 약물 내성을 극복할 수 있음을 시사합니다. 화학면역요법 메커니즘.

골수 유래 세포(BMDC)의 성숙

BMDC는 골수 전구세포와 미성숙 대식세포, 과립구 및 수지상 세포(DC)로 구성된 골수 기원의 이종 세포를 나타냅니다. 이들은 T 세포 활성화 및 종양 관련 대식세포(TAM) 활성화를 억제함으로써 면역 반응에 관여합니다.64 주요 항원 제시 세포(APC)로서 DC는 선천성 면역 체계와 적응성 면역 체계 사이의 소통을 위한 다리 역할을 합니다. 22

그림 7. 48시간 동안 다양한 화합물(6mM)에 노출된 후 MDA-MB-231 세포에서 DNA 복구 및 세포사멸 관련 단백질의 발현 및 α-튜불린과 관련된 해당 단백질 함량. *p < 0.{{10}}5, **p < 0.01, ***p < 0.001.

그림 8 MDA-MB-231(A) 및 THP-1(B) 세포를 6 및 3mM의 서로 다른 화합물로 처리한 후 웨스턴 블랏으로 결정한 cGAS-STING 경로에 관여하는 단백질의 발현 24시간 동안 각각 GAPDH에 상대적인 단백질 함량을 나타냅니다. *p < 0.{{10}}5, **p < 0.01, ***p < 0.001.

그림 9 (A) THP-1 세포에서 IFN-I, (B) IFN-b, (C) IL-6 및 (D) MDA-MB{{에서 TNF-a의 ​​분비 7}} 24시간 동안 다양한 화합물(6mM)로 처리한 후의 세포. 데이터는 평균 ± SD(n{{1{11}}}})로 표시됩니다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.

성숙하고 활성화된 DC는 T 림프구에 특정 항원을 제시하고 종양에 대한 적응 반응을 시작할 수 있습니다. MnPC 및 MnPVA 활성화 cGAS-STING 경로가 BMDC의 성숙을 유도할 수 있는지 여부를 테스트하기 위해 우리는 다음과 같이 BMDC의 표면 마커를 테스트했습니다. 24시간 동안 다양한 화합물과 함께 배양된 MDA-MB-231 세포의 상청액을 이용한 유세포 분석 후 처리. 도 10A에 도시된 바와 같이, 대조군과 비교하여, MnPC 및 MnPVA는 성숙 마커 CD86 및 CD80의 동시 발현을 각각 36.62% 및 43.15%에 도달하여 현저하게 증가시켰습니다. 그러나 MnCl2는 대조군의 수준을 약간 능가했습니다. 또한, 주요 조직적합성 복합체 클래스 II(MHC-II)는 T 세포에 항원성 펩타이드를 제시하는 APC에 의해 구성적으로 발현됩니다. 그 결과, 적응성 면역 반응이 시작되고, 유지되고, 조절됩니다.8 그림 10B와 C에서 볼 수 있듯이, MnPC와 MnPVA는 MHC-II의 발현을 대조군의 약 1.{21}}배로 증가시켰습니다. . 데이터는 이러한 복합체가 BMDC의 성숙을 크게 유도하여 세포독성 T 림프구의 면역 반응을 유발할 수 있음을 시사합니다.

그림 10 (A) CD86와 CD80의 동시 발현, (B) BMDC에서 CD11c+CD86+CD80+의 정량 분석, (C) MHC-II의 발현 BMDC 표면에서의 (D) 24시간 동안 다양한 화합물(6mM)과 함께 배양된 MDA-MB-231 세포의 상등액으로 처리한 후 유세포 분석에 의해 결정된 MHC-II의 평균 강도.

PBMC와 암세포의 공동 배양

복합체의 면역 조절 효과를 추가로 평가하기 위해 약물 활성화 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 존재 하에서 MDA-MB{1}} 세포의 생존 가능성을 문헌 방법에 따라 MTT 분석으로 평가했습니다.66 암세포 또는 PBMC가 있는 암세포를 대조군으로 설정했습니다. 도 11에 도시된 바와 같이, PBMC가 없는 경우 MnPC와 MnPVA는 세포 생존율을 각각 64.98%와 62.02%로 억제했다. Mn 복합체가 없는 PBMC와 세포의 공동 배양은 평균 세포 생존율이 81.49%인 기본 세포독성만을 나타냈습니다. 그러나 PBMC가 있는 경우 MnPC와 MnPVA는 세포 생존율을 각각 38.19%와 36.98%로 억제했습니다. 이 농도(6mM)에서는 대부분의 PBMC가 여전히 살아 있습니다(그림 S9†). 결과는 MnPC와 MnPVA가 PBMC의 면역 반응을 활성화하여 MDA-MB-231 세포에 세포 독성 효과를 발휘하여 암세포에 대해 상당한 시너지 효과를 나타낼 수 있음을 보여줍니다.

급성 독성 및 생체 내 항암 활성

MnII 복합체의 급성 독성은 암컷 Balb/c 마우스에서 평가되었습니다. 각 복합체의 정맥 주사 후 중앙 치사량(LD50)과 체중 변화를 측정했습니다. MnPC와 MnPVA의 LD50는 각각 16.08 ± 2.16 및 25.16 ± 3.19 mg kg−1(그림 S10†)로, 이는 그보다 훨씬 높습니다. CDDP(4.{{60}}6 ± 1.02 mg kg−1 ).67 MnPC 및 MnPVA 처리 마우스에서는 체중에 큰 변화가 관찰되지 않았습니다. 결과는 MnPC와 MnPVA가 포유동물에 대한 독성이 낮다는 것을 나타냅니다. 흥미롭게도 VA를 Mn 복합체에 연결하면 일반적인 독성이 약화되거나 생체 적합성이 증가했습니다. 또한, 생체 내에서 MnPC 및 MnPVA의 항암 활성을 평가하기 위해 4T1 유방암을 보유한 마우스 모델이 확립되었습니다. 도 12에 도시된 바와 같이, 마우스에 PBS, MnCl2, MnPC 및 MnPVA(1.3 mg Mn/kg)를 각각 16일 동안 처리한 후 MnPC 및 MnPVA가 MnCl2보다 종양 성장을 더 효과적으로 억제하는 것으로 나타났습니다. 16일째 평균 종양 부피(A, B)는 MnPC 및 MnPVA 처리 마우스에서 각각 554.78 ± 43.76 및 348.01 ± 39.61 mm3로 감소한 반면, PBS 및 MnCl 처리 마우스의 경우에는 감소했습니다.2- 처리된 마우스의 크기는 각각 1182.01 ± 95.87 및 784 ± 64.93 mm3였습니다. 평균 종양 무게(C)는 PBS-, MnCl{67}}, MnPC- 및 MnPVA 처리 마우스의 경우 각각 1.41 ± 0.13, 0.95 ± 0.19, 0.82 ± 0.19 및 0.59 ± 0.1 g이었습니다. 분명히, MnPVA의 종양 억제 효과는 MnPC 및 MnCl2의 효과보다 우수했는데, 이는 MnPVA에 의한 HDAC 발현의 효과적인 억제 때문일 수 있습니다. 또한 체중(D), 생존율 및 전체 장기 해부학적 측면에서 명백한 병리학적 이상이나 병변은 관찰되지 않았습니다(그림 S11†). 이러한 결과는 MnII 복합체가 암 치료를 위한 유망한 약물 후보임을 시사합니다.

그림 11 화합물 활성화 PBMC(6mM)와 48시간 동안 공동 배양한 후 MDA-MB-231 세포의 평균 생존율(%). 데이터는 평균 ± SD(n= 3)로 표시됩니다. **p < 0.01 및 ***p < 0.001.

생체 내 항암 면역 반응

MnII 복합체의 생체내 면역 자극 능력은 4T1 종양이 있는 Balb/c 마우스에서 테스트되었습니다. 종양, 비장 및 종양 배수 림프절(LN)의 면역 세포 상태를 유세포 분석법으로 분석했습니다.21 CD{5}} T 세포는 면역 체계에서 암 발생과 악성 진행을 제한하는 데 필수적입니다. 세포독성 T 림프구(CTL)의 유도에는 미성숙 DC가 성숙한 DC로 활성화되어야 하며8,9 이는 CD11c+ CD80+ CD86+ 세포로 표시됩니다.68 그림 13A 및 B에 표시된 대로 , MnPVA 처리 마우스에서 공동 자극 수용체 CD80+ 및 CD86+(참조 69)의 발현으로 표시되는 성숙한 DC의 비율은 LN에서 그보다 더 높았습니다(45.59%). 각각 PBS, MnCl2 및 MnPC로 처리되었습니다. 대식세포는 종양 미세환경을 조절하는 면역체계의 필수적인 부분입니다.70 기능에 따라 대식세포는 종양성 M1 표현형 활성화 상태와 종양성 M2 표현형 활성화 상태로 분류될 수 있습니다.71 M1 대식세포는 TNF-a, IL로 표시됩니다.-12 , CD80, CD86 및 종양 세포의 직접적인 사멸,70 M2-유사 TAM은 다음과 같이 대식세포 만노스 수용체 1(MMR 또는 CD206)의 높은 발현과 종양 세포 성장 촉진을 특징으로 합니다. 강력한 면역억제 활성도 나타냅니다. HDAC 억제제는 대식세포 분극화에서 이동 촉진 이동을 강화하고 DNA 복구를 방지할 뿐만 아니라 M1 표현형을 향상시킬 수 있는 것으로 알려져 있습니다.72 따라서 우리는 유세포 분석을 통해 비장과 종양에서 대식세포의 분극화를 감지했습니다. Mn 착물로 처리한 후. 도 13C-E 및 S12A-C에 나타난 바와 같이, CD206+로 표시된 M2 표현형은 유의하게 억제되었으며 CD86+로 표시된 M1 표현형은 MnPVA 처리 마우스에서 현저하게 증가했습니다. 결과는 MnPVA가 M2 표현형에서 M1 표현형으로 대식세포의 분극을 효과적으로 유도했음을 나타냅니다. MnCl2와 MnPC도 CD86의 발현을 증가시켰지만 PBS에 비해 CD206에는 약간만 영향을 미쳤습니다. 한편, 성숙 DC 및 대식세포에서 분비되는 IFN-b, IL{52}} 및 TNF-a를 ELISA로 측정하였다. 도 13F 및 G에 도시된 바와 같이, MnPVA는 T 세포가 종양 세포를 사멸하도록 유도할 수 있는 PBS, MnCl2 및 MnPC보다 IFN-b 및 TNF-α의 수준을 더 효과적으로 향상시켰습니다. 그러나 IL-6에는 큰 변화가 관찰되지 않았습니다(그림 S13†).

그림 12 PBS를 대조군으로 사용한 4T1 종양 보유 마우스에 대한 MnPC, MnPVA 및 MnCl2의 치료 효과. (A) PBS, MnCl2, MnPC 및 MnPVA를 각각 kg당 1.3mg Mn으로 처리한 후 생쥐의 절제된 종양 이미지, (B) 종양 부피, (C) 종양 무게 및 (D) 체중 16일 동안 2일마다. **p < {{10}}.01 및 ***p < 0.001.

그림 13 성숙한 DC(CD11c+에 게이트된 CD80+CD86+) 및 종양 배출 림프절(A 및 B), 대식세포의 분극화(CD206+CD{ {7}} 유세포 분석법으로 측정한 마우스(C-E)의 4T1 종양 조직에서 CD11b+)에 게이팅됨, 및 처리 후 마우스의 혈청 내 IFN-b(F) 및 TNF-α(G)에 대한 ELISA 분석 각 화합물(kg당 1.3mg Mn)을 16일 동안 2일마다 1회 투여합니다. 데이터는 평균 ± SD(n= 3)로 표시됩니다. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001.

MnPC 및 MnPVA에 의해 DC 및 대식세포에서 cGAS-STING 경로가 활성화되면 분비된 IFNs-I 및 전인성 사이토카인이 세포독성 림프구를 프라이밍할 수 있습니다.59 따라서 우리는 세포독성 T 세포(CD8+)의 활성화를 추가로 평가했습니다. ) 및 보조 T 세포(CD4+ )는 각각 종양 및 비장 조직에 있습니다. 그림 14A 및 S12D-F†에 표시된 대로 종양의 CD{7}} T 세포(파란색 사각형)는 PBS로 처리한 마우스(3.53%)에 비해 MnPVA로 처리한 마우스에서 효과적으로 활성화되었습니다(9.18%). ), MnCl2(4.48%) 및 MnPC(6.05%); CD4+ T 세포(빨간색 사각형)도 약간 활성화되었으며 결과는 복합체 처리 후 비장에서의 결과와 반대였습니다. 도 14B는 활성화된(CD69+) 종양 침윤 CD8+ T 세포의 빈도가 극적으로 증가했음을 보여준다. 이러한 모든 결과는 MnPVA가 cGAS-STING 경로의 활성화로 인해 생체 내에서 강력한 면역 반응을 자극할 수 있음을 나타냅니다.

그림 14 CD8+(파란색 사각형) 및 CD4+ T(빨간색 사각형) 세포(A)와 CD8+ T 세포 중 CD69+ 하위 집합의 비율( B) 16일 동안 2일마다 1회 각 화합물(kg당 1.3 mg Mn)로 처리한 후 마우스의 4T1 종양 조직에서 유세포 분석에 의해 결정됩니다.

행동의 메커니즘

그림 15에 표시된 Mn 복합체에 대한 조치가 제안되었습니다. 종양 세포에서 MnPC 또는 MnPVA는 핵 및/또는 미토콘드리아 DNA를 손상시켜 g-H2AX의 상향 조절을 유도합니다. 한편, 복합체는 HDAC1/2 및 PARP1의 활성을 억제하여 DNA 복구 능력을 손상시키고 DNA 손상을 강화했습니다. 축적된 DNA 단편은 핵 및/또는 미토콘드리아에서 세포질로 방출되고 cGAS에 의해 인식되어 STING을 활성화합니다. STING은 차례로 TBK1과 IRF3의 인산화와 핵으로의 전위를 자극하여 IFN, IL{9}} 및 TNF-a의 ​​생성을 유도했습니다. 이러한 IFN과 전염성 사이토카인은 핵에서 세포질로, 나아가 종양 미세환경으로 분비되어 DC와 대식세포의 성숙과 항원 제시를 촉진하고 세포독성 T 세포를 더욱 활성화시켜 암세포를 죽였습니다. 대식세포와 같은 면역 세포에서도 유사한 사건이 발생했으며 cGAS-STING-TBK1 경로가 활성화되었습니다. cGAS-STING 경로의 활성화는 선천적 면역 반응을 시작하고 종양 세포와 주변 면역 세포 사이의 양방향 통신을 시작하여 종양에 대한 살상 효과를 향상시켰습니다. 결과적으로 Mn 복합체는 화학 요법과 면역 요법의 시너지 효과로 인해 강력한 항종양 활성을 나타냈습니다. . 이러한 과정의 대부분은 시험관 내 또는 생체 내에서 입증되었습니다.

그림 15 망간 복합체에 대해 제안된 작용 메커니즘.

결론

증가하는 증거는 많은 금속 복합체가 종양 세포와 면역 세포 모두와 상호 작용하여 종양 세포에 직접적인 세포 독성 효과를 발휘하는 것 외에도 면역 억제 미세 환경을 리모델링한다는 것을 보여줍니다.73 이 연구에서 우리는 두 가지 MnII 복합체 MnPC 및 MnPVA를 자극을 통해 암을 억제하는 잠재적인 화학 면역 치료제로 제시합니다. 선천적 면역 반응뿐만 아니라 DNA 이중 가닥을 파괴합니다. 이러한 다기능 복합체는 DNA를 손상시킬 뿐만 아니라 휴면 면역 반응을 재활성화하여 암세포를 죽입니다. 첫째, DNA 차단제 역할을 하여 산화성 DNA 손상을 유도하고 DNA 단편을 생성합니다. 둘째, HDAC 및 PARP1의 억제제로 작용하여 DNA 손상 복구를 방지하고 DNA 병변을 강화합니다. 셋째, 이들은 cGAS-STING 경로의 작용제로 작용하여 IFN 및 전염증성 사이토카인의 분비를 유도하여 DC 및 대식세포의 성숙을 촉진하고 종양 특이적 T 세포를 자극하여 종양 세포를 죽입니다.

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전체적으로 MnPC와 MnPVA는 cGAS-STING 경로를 효과적으로 활성화하고 시험관 내 및 생체 내에서 암세포의 성장을 억제했습니다. VA를 MnII 복합체에 연결하면 HDAC에 대한 억제가 극적으로 강화되고 복합체의 항증식 활성이 강화되었으며, Mn 복합체의 형성은 MnCl2와 1,{3}}페난트롤린의 항증식 활성을 크게 감소시킵니다. Jiang 등. 는 cGAS-STING 경로에 대한 Mn2+의 자극 활성을 처음으로 보고했지만,12 Mn 복합체에서는 그러한 특성이 발견되지 않았습니다. 이 연구는 cGAS-STING 경로에 대한 MnPC 및 MnPVA의 자극 능력이 종양 세포와 면역 세포 모두에서 MnCl2 또는 Mn2+보다 훨씬 높다는 것을 보여줍니다. 왜냐하면 cGAS를 활성화하기 위해 세포질에서 더 많은 DNA 단편을 유도했기 때문입니다. -스팅 경로. 이번 연구 결과는 DNA 손상 또는 DNA 복구 차단 리간드를 사용하여 MnII 복합체를 구성함으로써 보다 강력한 cGAS-STING 작용제를 얻을 수 있음을 나타냅니다.

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