뇌실내-퀴놀린산 쥐 모델에서 디오스민으로 유발된 신경 보호 및 기억력 개선에 대한 기계적 통찰: 미토콘드리아 기능 및 항산화제의 부활 3부
Aug 09, 2024
2. 재료 및 방법
2.1. 실험동물. .is 연구는 프로토콜 번호에 따라 IAEC에 의해 허용되었습니다. ASCB/IAEC/14/20/145. AlbinoWistar 쥐(암수, 200g ~ 250g, 8개월 ~ 9개월령)를 인위적인 온도 설정(23 ± 2도), 12:12시간 어둡고 밝은 순서로 일반 크기의 폴리프로필렌 직육면체 인클로저에 보관했습니다. 기관 동물 사육장 내 습도(40 ± 10%). 설치류에게 표준 영양 식품(Ashirwad Manufacturer, Punjab)과 정제수를 마음대로 먹였습니다.
남성과 여성의 관계와 기억은 늘 많은 관심을 끌었습니다. 남성호르몬이 신체발달, 건강유지, 성발달 및 성기능 증진에 중요한 역할을 한다는 것은 잘 알려져 있습니다. 또한 최근 연구에서는 남성 호르몬이 기억력과 밀접한 관련이 있는 것으로 나타났습니다.
연구에 따르면 특정 기억 작업에서는 남성이 여성보다 더 나은 수행을 하는 것으로 나타났습니다. 예를 들어 공간 기억력에서는 남성이 여성보다 일반적으로 더 좋은 능력을 발휘하는데, 그 이유는 남성 호르몬이 해마에 미치는 영향 때문이다. 해마는 공간 기억을 처리하는 뇌의 영역입니다. 남성 호르몬은 해마의 기능을 촉진시켜 남성의 공간 기억 능력을 향상시킬 수 있습니다.
그러나 여성 호르몬은 기억력에도 긍정적인 영향을 미칩니다. 여성호르몬이 뇌의 기억 관련 유전자 발현을 촉진하고 해마 신경세포의 수와 기능을 증가시켜 여성의 기억력을 향상시킬 수 있다는 연구 결과가 나왔다. 또한 여성호르몬은 스트레스 해소, 신경세포 사멸 억제, 뇌 신경세포 보호 등 여성의 기억력을 더욱 향상시킬 수 있다.
이는 남성호르몬과 여성호르몬 모두 기억력 향상에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 보여준다. 남성과 여성의 기억력은 서로 다르며 각각 장점과 단점이 있지만, 남성이 여성보다 기억력이 좋다거나 여성이 남성보다 기억력이 좋다는 의미는 아닙니다. 그러므로 우리는 성별을 기억의 척도로 사용해서는 안 됩니다. 모든 사람은 자신의 장점을 최대한 활용하고 지속적으로 기억력을 향상시켜야 합니다.
마지막으로, 남성이든 여성이든 우리는 신체 건강과 정신 상태에 주의를 기울이고 기억력을 향상시키는 올바른 방법을 선택해야 합니다. 예를 들어, 끊임없이 새로운 것을 배우고, 규칙적인 생활 습관을 기르고, 정서적 안정을 유지하는 것은 기억력 향상에 긍정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 기억력을 향상하고 더 나은 미래를 만들기 위한 방법을 지속적으로 탐구하고 실천하기 위해 함께 노력합시다. 기억력을 향상시켜야 함을 알 수 있습니다. 시스탄체는 많은 독특한 효과를 지닌 전통 한약이기 때문에 기억력을 크게 향상시킬 수 있습니다. 그 중 하나는 기억력을 향상시키는 것입니다. 시스탄체의 효능은 탄닌산, 다당류, 플라보노이드 글리코사이드 등 포함된 다양한 활성 성분에서 비롯됩니다. 이러한 성분은 여러 가지 방법으로 뇌 건강을 증진할 수 있습니다.
모든 동물 실험은 CPCSEA, GOI, New Delhi의 지침에 따라 독점적으로 수행됩니다. .e 동물 관리인과 취급자는 동물 집단에 도움이 되는 다양한 치료 요법에 대해 눈이 멀었습니다. 조사 동물 실험이 실행되어 최소 2주간의 친숙화 기간을 거쳤습니다.
동물을 이용한 모든 조사는 하루에 0900-에서 1600-시간 사이에 수행되었습니다.2.2. 약물 및 화학물질. Diosmin(DSM: 520-27-4), 퀴놀린산(QA: 89-00-9) 및 표준 분석물질은 Merck(인도)에서 구입했습니다.
인산이수소나트륨(NaH2PO4), 수산화나트륨(NaOH), 이염기인산칼륨(K2HPO4), 니트로블루테트라졸륨(NBT), 페나진 메토황산염(5-메틸페나지늄 메틸황산염), 에틸렌디아민사아세트산(EDTA), 보비세럼 알부민(BSA), {{ 5}}[4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-일]에탄술폰산(HEPES), 1,2-비스[2-[비스(카르복시메틸) 아미노]에톡시]에탄(EGTA), 리보플라빈, 시안화나트륨(NaCN), 나트륨아지드(NaN3), 피로인산사나트륨,과산화수소(H2O2), NADH 이나트륨(DPNH),NADPH 사나트륨(코엔자임 II 환원 사나트륨염), 인산, Folin 및 Ciocalteu의 페놀(FCR) 및 설포살리실산(5-SSA) 시약(HiMedia Laboratories, Maharashtra, India); 디글리신, 빙초산(CH3COOH), Ellman 시약(3-카르복시-4-니트로페닐디설파이드, DTNB), 아자벤젠(C5H5N) 및 라우릴황산나트륨(SLS)(LobaChemie, 인도 뭄바이); 4,6-디히드록시-2-메르캅토피리미딘(2-TBA), 탄산이나트륨(Na2CO3) 및 (2-메르캅토에틸)트리메틸암모늄 요오드화물 아세테이트(TCI Chemicals, 인도); 황산아연(ZnSO4), 로셸염(칼륨 L(+)-주석산염), 2-(1-나프틸아미노)에틸아민 이염산염, 아질산나트륨(NaNO2) 및 p-아미노벤젠술폰아미드(SiscoResearch Laboratories, 인도) ); 부틸알코올(Fisher Scientific, India)을 사용하였다.2.3. 퀴놀린산의 뇌실내 주사.
주사용 멸균수를 이용하여 케타민(90 mg/kg)과 자일라진(10 mg/kg) 칵테일을 복강내(ip) 투여하여 동물을 마취시켰다. .e 신체를 따뜻한 온열쿠션 위에 엎드린 자세로 눕히고 머리를 정위수술 기구 마운트에 위치시켰습니다. .e 두피는 시상 중앙 지점에서 절개되었고, 피부를 당겨서 두개골을 드러냈습니다.
두 개의 측면 심실 중 어느 하나가 임의로 선택되었으며 두개골에서 두정골은 천공되었습니다(정위 좌표 -0. 브레그마에서 전후방 8mm, 정중 시상 봉합에서 ±1.5mm 내외측, 두정골 표면에서 ±3.6mm 배배쪽) ) 버 구멍을 만듭니다 [21].
첫째 날, 퀴놀린산(QA) 용액을 PBS(Na+-K+ [PO4]2- 완충 식염수, pH 7.4)에 새로 구성하고(240nmol) 유속으로 해밀턴 마이크로주사기를 사용하여 점차적으로 주입했습니다. 5 µl ICV 차량 주입량으로 쥐의 왼쪽 또는 오른쪽 뇌실에 5~6분 동안 1 µl/분을 주입합니다 [22].
약물을 전량 접종한 후 마이크로니들이 4~5분 동안 떨어지지 않도록 하여 약물이 뇌척수액 내로 확산되도록 하고 역류를 방지하였다. 동일한 용량(10μl)의 PBS 차량에 ICV를 동일하게 작동된 shamrat에 투여했지만 QA는 주입하지 않았습니다.
약물 주입 후 접착제(아연 인산염, PYRAX®)를 사용하여 구멍을 복원하고 피부를 봉합했습니다. 오염(세균증식)을 방지하기 위해 Neosporin®을 전처리 적용하였습니다.
수술 후 패혈증을 예방하기 위해 Orizolin(Zydus Cadila)을 30mg/kg(ip) 용량으로 투여했습니다. 수술 후 저체온증을 예방하기 위해 각 쥐에게 따뜻한 환경(37 ± 0.5도)을 제공했습니다. 각 쥐는 수술 후 7일 동안 반고체 음식(우리 내부)과 물을 무료로 섭취할 수 있었고 별도의 우리(30 x 23 x 14 cm3)에 별도로 수용되었습니다.
2.4. 실험 프로토콜. DSM은 일반 식염수에 포함된 0.5% 디메틸설폭사이드 운반체를 사용하여 복강내(ip) 경로를 통해 쥐의 체중(bw)당 5{4}} 및 100mg/kg(용량-부피 5ml/kg)으로 주입되었습니다[17].
동물은 단일 맹검 모드(n=5)에서 5개 클러스터로 무작위로 할당되었습니다: (i) 가짜(S), (ii) QA, (iii) QA + DSM50, (iv) QA + DSM100 및 (v) QA + DNP. 쥐에게 1일째 QA(QA-ICV)를 뇌실내 투여하거나 가짜 수술을 실시했습니다.
DSM은 첫날부터 QA-ICV 후 120분 동안 매일 21일 연속으로 투여되었습니다. 도네페질(DNP)은 본 연구에서 표준 약물로 사용되었으며 연속 21일 동안 QAICV를 주사한 쥐에게 주사했습니다(용량 3 mg/kg, ip).
Thesham 및 QA 대조군의 동물에는 1일부터 21일까지 비히클(생리 식염수 내 멸균 0 0.5% 디메틸술폭시드, 투여량 5 ml/kg)을 투여했습니다. 전체 연구는 도 1에 도시된 계획에 따라 수행되었습니다. 그림 1.2.5. 운동 활동.
모든 쥐 클러스터에서 평균 운동 활동은 5분 동안 Actophotometer 장치를 사용하여 기록되었습니다. 별도의 동물을 3분 동안 순응시키기 위해 흡광도계에 배치했습니다. .e 쥐에게 5분이 주어졌고 결과는 5분당 개수로 표시되었습니다[11].2.6. 로타로드 테스트.
In rodents, the rotarod test typically evaluates the equilibrium and muscle synchronization facets of sensorimotor functions. .e rats were presented to acquisition trials until their ability to run reached >막대가 분당 9회전(rpm)으로 회전하면 60초입니다.
획득 실험 후 별도의 쥐를 원통형 축에 위치시키고 50초에 걸쳐 6rpm(예비 속도)에서 30rpm(종료 속도)까지 10초 간격으로 일정한 간격으로 회전 속도를 높였습니다. .e 회전 원통형 샤프트의 평균 감소 대기 시간(초)이 결과에 명시되어 있습니다.2.7.
발자국 분석. 쥐의 발자국 분석을 수행하는 원리는 보행 이상을 평가하는 것입니다.
발자국의 경우, 쥐의 발을 4가지 다양한 색상의 무독성 식품 염료에 담그고 경사진 통로(70cm × 10cm × 8cm)에서 달리도록 허용했습니다. 활주로 베이스는 흰색의 셀룰로오스 시트로 둘러싸여 있었습니다. .e 쥐들은 깨끗한 발자국을 얻기 위해 활주로 끝의 희미한 오르막 구간으로 동기를 부여받았습니다. 실험 후 미지근한 물을 사용하여 각 동물의 염료를 부드럽게 제거했습니다. .e 발자국을 스캔하고 표준 눈금자를 사용하여 "보폭"을 측정했습니다. 보폭은 동일한 쥐 발의 순차적 배치 사이의 거리를 계산하여 정량화되었습니다 [11].
2.8. 새로운 객체 인식 작업(NORT). Kumar와 Bansal이 제시한 표준 프로토콜을 따랐습니다[23].
ORT는 설치류의 충동적인 탐색 행위를 통해 활용되는 작업 유형 기억 기억을 평가하기 위해 사용되는 수익성이 없고 적대적이지 않은 외인성 원형입니다. 조사는 용기의 일관된 밝기를 관리하기 위해 60W LED로 조명되는 조용한 지역에 위치한 옥상 오픈 합판 직육면체 용기(80cm × 42cm × 62cm)에서 수행됩니다.
원기둥(흰색), 피라미드(빨간색) 및 입방체(검은색) 모양(높이 12cm)의 나무 항목(동일한 세 쌍)은 견고하고 설치류가 움직일 수 없을 만큼 무게가 충분했습니다. NORT는 16일차 순응(S1), 획득(S2), 신규 물체 인식 검사(보유) 단계(S3)의 3단계(S)로 수행되었습니다.
S1 동안, 3일 연속으로 쥐가 용기의 빈 바닥 바닥(5분)을 발견하기 위한 시험을 실시했습니다. S1이 완료되면 개별 동물은 학습 단계(S2)에서 특정 항목 세트에 익숙해졌습니다.
쌍둥이 같은 것들은 용기의 임의로 선택된 2개의 반대 각도(측면 성벽에서 9cm ~ 11cm 간격)에 배치되었습니다. 별도로 설치류를 두 개의 고체 항목과 반대되는 용기 중앙에 위치시키고 5분 동안 두 개의 유사한 항목을 발견하도록 허용했습니다. 2~3cm 이내의 거리에서 물체 근처로 주둥이를 유도하거나 총구로 물체와 물리적 접촉을 하는 것은 조사 행위로 간주됩니다.
S2 이후, 설치류는 60분의 ITR(Intertrial recess)이 추적되는 홈 케이지에 보관되었습니다.
S2에서 제공되는 모든 단일 고체 항목은 다른 고체 항목으로 교체되었으며 설치류는 다시 쌍둥이 항목, 즉 익숙한 항목과 다른 항목의 복제품으로 제시되었습니다. 항목의 전체 융합 및 위치가 다음과 같이 상쇄되었습니다. 특정 설정이나 항목에 대한 선호로 인해 발생할 수 있는 편견을 줄입니다. .e 용기 및 고체 품목은 냄새 징후를 억제하기 위해 매 조사 후 꼼꼼하게 닦아냈습니다(에틸 알코올 15% 및 마른 천). .e S2 및 S3의 각 항목을 발견하는 데 소요된 기간은 스톱워치를 사용하여 문서화되었습니다. .e S2(I1 � Ii1 + Ii2)에서 일치하는 두 항목을 조사하는 데 시간이 소요되고 S3(I2 � Ii3 + Ib)에서 서로 다른 두 항목, 즉 아는 항목과 다른 항목을 조사하는 데 시간이 소요됩니다. 녹음되었습니다. .e 다른 항목을 조사하는 데 소요되는 시간과 아는 항목을 조사하는 기간(Ib–Ii3 � DI)의 차이는 회상 기억의 보존을 나타냅니다.
아는 항목과 새로운 항목을 모두 조사하는 DI(차별 지수)/S3 기간(수정된 DI)은 전체 조사의 분산에 의한 편파성을 향상시키고 익숙한 항목과 대조적으로 다른 항목에 대한 성향을 나타냅니다. {DI � (Ib–Ii3 )/(Ii3 + Ib)}. 기억 기억은 S3에서 친숙한 항목/새로운 항목을 골라내는 설치류의 기술을 정량화하여 평가되었으며 DI로 명시되었습니다(S3의 전체 조사 기간에 대해 수정됨)[24].
2.9. MorrisWater Maze (MWM). .e Kumar 및 Bansal [25]이 제시한 표준 프로토콜을 따랐습니다. MWM은 설치류가 숨겨진 연단으로의 탈출 경로를 찾는 수영 시험을 통해 공간 기억을 판단합니다.
검정색 원형 탱크(직경 2m, 높이 0.6m)에 물(25 ± 1도)이 0.3m 깊이까지 채워져 있었습니다. 수조는 탱크 상부 둘레에 수직으로 고정된 두 개의 나일론 섬유를 사용하여 시계 방향으로 4개의 유사한 영역(R1, R2, R3 및 R4)으로 분리되었습니다.
데이지(10.5cm × 10.5cm)는 저수지 지역 R4의 수중(물 아래 1cm)에 배치되었습니다. .단의 자리는 취득 기간 내내 그대로 유지되었습니다.
모든 단일 쥐에게는 매일 4번의 연속 획득 라운드(5분 ITR)가 제공되었습니다. .e 설치류는 R1-R4, R2-R1, R3-R2 및 R{{의 모든 단일 시험마다 다양한 위치에서 탱크 벽을 향한 수생 저장소로 부드럽게 방출되었습니다. 7}}R3은 1일부터 4일까지 각각 진행되었으며 수중 시상대를 감지하는 데 120초가 허용되었습니다. .e 설치류는 20초 동안 계속해서 연단 위에서 휴식을 취했습니다.
120초 이내에 플랫폼을 감지하지 못하면 플랫폼에 쥐를 수동으로 배치한 것으로 간주되며 플랫폼에서 20초 동안 허용됩니다. 탈출 대기 시간(ELT)은 저수지에서 숨겨진 데이지를 발견하는 기간(초)입니다.
공간 학습은 1일차와 4일차 ELT로 표시되었습니다. 탐사시험(5일차)에서 설치류는 120초 동안 저수지를 조사했으나 시상대를 박탈당했다. .e 전체 저장소(4개 지역)에서 소비된 평균 지속 시간이 기록되었습니다. .e 숨겨진 포디움에 대한 R4 탐색에서 소비된 평균 시간(TSTQ:대상 사분면에서 소비된 시간)은 참조 메모리의 지표로 간주되었습니다. .시각적 신호로 작용하는 실험실의 항목과 조사자의 위치가 방해받지 않은 상태로 유지되는 탱크의 환경을 비교합니다[26].
2.10. 생화학적 매개변수 추정. 행동 검사를 마친 후, 쥐의 뇌 전체를 모아 분쇄된 얼음 위에 올려놓은 후, 냉동 멸균 식염수(등장성 308 mOsmol/l NaCl)로 목욕시켜 잔여물과 혈액을 제거했습니다.
전체 뇌의 균질화는 215mM D-만니톨, 20mM 2-[4-(2-하이드록시에틸 구성으로 구성된 동결 분리 완충액(pH 7.4)에서 즉시 이루어졌습니다. )피페라진-1-일]에탄설폰산, 1mM 1,2-비스[2-[비스(카르복시메틸)아미노]에톡시]에탄, 75mM 사카로스 및 0.1% BSA. .e 균질화물을 13000 x g 힘을 사용하여 4도에서 5분간 원심분리했습니다. .e 펠렛은 제거되었고 상청액은 두 부분으로 분리되었으며 13000 x g 힘에서 5분 동안 원심분리(4도)되었습니다. .e 조 미토콘드리아 펠릿을 분리하고 1,2-비스[2-[비스(카르복시메틸)아미노]에톡시]에탄이 포함된 분리 완충액에서 12,500 × g에서 11분(4도)으로 다시 원심분리했습니다. .e 오염되지 않은 미토콘드리아를 포함하여 이렇게 얻은 반고체 침전물을 75mM 사카로스, 20mM 2-[4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-을 함유하는 분리 완충액(pH 7.4)에 재현탁시켰습니다. yl]에탄술폰산, 및 215mM D-만니톨[27].
나중에, 전체 뇌 균질액의 미토콘드리아 분획을 사용하여 표준 방법을 사용하여 생화학적 마커를 결정했습니다.2.11. 미토콘드리아 복합체의 추정.
2.11.1. NADH: 유비퀴논 옥시도리덕타제 활성. King and Howard의 기술에 따라 복합체 I(NADH 탈수소효소) 활성의 속도를 정량화했습니다(nmol NADH 산화/분/mg 단백질). .NADH로부터 NAD+의 산화적 생성은 시토크롬 C 환원을 동반합니다. .e 분석 혼합물은 2 mM 디글리신 완충액을 사용하여 용해된 시토크롬 c(10.5 mM), 6 mM -니코틴아미드 아데닌디뉴클레오티드(DPNH) 및 디글리신 완충액(0.2 M, pH 8.5)으로 구성되었습니다.
용해 가능한 미토콘드리아 분획이 분석 혼합물에 통합되어 반응을 유발했습니다. .e λmax ± 550 nm에서의 광밀도(OD) 변화는 120초 동안 관찰되었습니다.
2.11.2. 숙신산염: 유비퀴논 산화환원효소 활성..e 숙신산염 탈수소효소(복합체 II) 활성의 비율은 King의 기술에 따라 정량화되었습니다(nmol 숙신산염 산화/분/mg 단백질).
숙신산산화는 모의 전자 수용체인 칼륨시아노철산염(K3Fe(CN)6)에 의해 유발됩니다. .e 숙신산(0.63 M), 1% BSA, K3Fe(CN)6(0.036 M) 및 Na+-K+로 구성된 분석 혼합물 [PO4]2- 완충액(0.23M, pH 7.6). 용해 가능한 미토콘드리아 분획이 분석 혼합물에 통합되어 반응을 유발했습니다. .e λmax ± 420 nm에서의 OD 변화는 120초 동안 관찰되었습니다.2.12. 산화 스트레스 바이오마커의 결정2.12.1. 이오바르비투르산 반응성 물질(TBARS).
TBARS(단백질 mg당 nmol) [30]를 평가하기 위해, 0.10 ml 균질화된 뇌, 1.51 ml 4,{{ 7}}디하이드록시-2-머캅토피리미딘(0.8%), 200μl SLS(8.18%), 1.49ml glacialacetic acid(21%, pH 3.51) 및 0.71ml 탈이온수를 96도 수욕 가열에 적용했습니다. 60분.
15:1 비율의 부틸알코올/아자벤젠(5.1ml)을 분석 혼합물에 첨가하고 4000×gpower(10분)로 원심분리하고 상등액을 분리했습니다.
트윈 빔 UV1700 분광 광도계(일본 Shimadzu)를 사용하여 발색단 말론디알데히드-4,6-디하이드록시-2-메르캅토피리미딘 OD를 파장(λmax � 532 nm), ε � 1.56 ×에서 평가했습니다. 4,6-디하이드록시-2-머캅토피리미딘 부가물을 계산하기 위해 105/M/cm(몰 흡광 계수)가 적용되었습니다.
2.12.2. 글루타티온(Lc-글루타밀-L-시스테이닐-글리신) 수준 감소. Ellman의 [31] 절차는 L-글루타티온(GSH) 함량을 평가하기 위해 구현되었습니다. .e 균질액(1.1ml)과 4% 2-히드록시-5-술포벤조산(5-SSA) 1ml를 포함하는 시험 혼합물을 2,500 × g 출력에서 11분간 원심분리(4도)했습니다. .
나중에 2.8 ml Na+-K+[PO4]2- 완충액(51.2 mM, pH 7.77) 및 {{10}}.21 ml 3-카르복시{{13 }}니트로페닐디설파이드(0.12 mM, pH 7.89)를 위에서 분리한 상등액(0.12 ml)에 혼합하였다.
트리펩타이드(단백질 mg당 μmolGSH)를 트윈 빔UV1700 분광 광도계(λmax ø 412nm)를 사용하여 정량화했습니다. ε � 1.36 ×104/M/cm.2.12.3을 적용합니다.
글루타티온 퍼옥시다제 활성. .e 글루타티온 퍼옥시다제(GPx)(EC 1.11.1.9)의 활성은 Mohandas 등의 기술을 구현하여 평가되었습니다. [32]. .eanalyze 혼합물은 10% 균질액 100 µl, 아지드화나트륨(1.11 mM) 100 µl, EDTA(1.13 mM) 100 µl, 글루타티온-이황화 환원효소 40 µl로 구성되어 있습니다. (GSR, 1 IU/ml) (EC1.8.1.7), 10 µl H2O2 (0.28 mM), 40 µl Lc-글루타밀-L-시스테이닐-글리신 (1.2 mM), 100 µl 코엔자임 II 환원 사나트륨 염 (0.22 mM) ) 및 0.12 M 1.49 ml Na+-K+ [PO4]2- 완충액(pH 7.4)(전량 2000 µl). .e λmax ± 340nm에서 조효소 II로 환원된 사나트륨의 손실은 25도 온도에서 문서화되었습니다. GPx 비율은 6.22 x 103/M/cm의 ε 를 사용하여 nmol NADPH 산화/분/mg 단백질로 계산되었습니다.
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