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NAD(P)(H) 정량 결과의 메타 분석은 포유류 조직에 걸친 가변성을 보여줍니다 Ⅱ

Jun 01, 2023

NAD(P)(H) 수준에 대한 사후 조직 수집 대 사후 조직 수집의 효과.

우리는 조직 수확 절차에 의존하는 NAD(P)(H) 산화환원 상태에서 약간의 관찰 가능한 차이가 있을 수 있다고 예측했습니다. 이 질문에 답하기 위해 우리는 NAD(P)(H) 산화 환원 상태에 대한 사후 조직 수집 절차와 사후 조직 수집 절차의 효과를 조사했습니다. 이 분석을 위해 희생 프로토콜을 정의하는 더 많은 연구에서 쥐 간 조직의 값을 비교했습니다. 공개되었을 때 검토된 모든 연구는 조직 샘플을 차갑게 보관하고 NAD(P)(H) 측정 전에 즉시 얼음에서 추출하거나 -80도에서 동결했다고 밝혔습니다. 이 분석은 안락사 전후에 추출된 조직 간에 쥐 간에서 NAD 플러스 농도에 유의한 차이가 없음을 확인했습니다(그림 6a). 그러나 쥐 간에서 보고된 NADH 수치는 사후 샘플에서 상당히 높습니다(그림 6b). 총 NAD(H) 수준(그림 6c)의 차이는 관찰되지 않았지만 NAD + /NADH 비율은 안락사 후 수집된 조직에서 더 낮았으며(그림 6d), 이는 NADH 수준에서 관찰된 변화와 일치합니다. NADP + , NADPH 및 NADP + /NADPH 비율은 조직 수확 시점별로 그룹화된 쥐 간 결과를 보충 그림 9에 표시합니다. 그러나 사후 샘플 수가 부족하여 조직 수확 시점이 NADP(H) 수준에 미치는 영향을 해석할 수 없습니다. 마우스 간에서는 사전 및 사후 NAD 플러스 수준 간에 차이가 없었지만 보고 연구의 수는 제한적이었습니다(그림 6e). 아니요나드,NADP 플러스, 또는나드프사후 데이터마우스 간비교가 가능했습니다.

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논의

많은 최근 연구에서 NAD(P)(H) 조절이 세포 항상성과 산화환원 상태에 필수적이라는 것이 입증되었습니다. 설치류로부터 얻은 데이터는 전신 NAD 플러스 수준의 덜 침습적인 지표로서 인간 혈액 NAD 플러스 수준을 조사하는 연구로 이어졌습니다. 최근 임상 연구에 따르면 NAD 플러스 수준은 질병 상태에서 감소했으며23,47 NAD 플러스 부스팅 전략에 따라 증가했습니다23,44,48,49. 우리는 1946년에서 2021년 6월 20일 사이에 발표된 모든 연구에 대해 메타 분석을 수행했습니다. 여기에는 마우스, 쥐 및 인간에 특히 초점을 맞춘 포유류 종의 NAD(P)(H) 수준에 대한 정량적 데이터가 포함되어 있습니다. 생물 의학 분야의 종을 연구했습니다. 이 분석은 연구 전반에 걸쳐 이러한 측정값에서 잘 알려진 분산이 주어진 정상적인 포유류 조직에서 NAD(P)(H) 농도의 평균 표준 수준을 결정하기 위해 부분적으로 수행되었습니다. 우리는 이러한 데이터가 NAD 플러스 연구 분야에서 표준화된 프로토콜을 자극하고 NAD(P)(H) 수준 및 산화 환원 비율을 질병 및 치료 요법에 대한 신뢰할 수 있는 바이오마커로 사용하는 데 사용될 수 있기를 바랍니다.

설치류 조직 전반에 걸친 측정의 상당한 변동성에도 불구하고, 이 메타 분석은 일부 예외를 제외하고 조직 전반에 걸쳐 유사한 평균 NAD 플러스 수준을 나타냈습니다. 흥미롭게도, 마우스 골격근은 다른 고도의 대사 조직(즉, 간, 신장, 심장 및 뇌)보다 NAD 플러스 수준 중앙값이 더 낮았습니다(그림 2a). 이것은 골격근에서 다른 NAD(H) 산화환원 상태를 나타내거나 섬유 조직에서 대사산물 추출과 관련된 더 큰 문제를 가리킬 수 있습니다. 그러나 이러한 관찰은 혈액과 근육 이외의 샘플 조직이 부족하여 인간에서 확인할 수 없었습니다.

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조직 샘플에서 생리학적 NAD(P)(H) 측정의 정확도에 영향을 미칠 수 있는 많은 잠재적 요인이 있습니다. 보고된 모든 연구에서는 열에 민감한 분획(NAD 플러스 및 NADP 플러스)을 보존하기 위해 조직을 채취하여 액체 질소에 직접 담그거나 냉동 또는 처리하기 전에 얼음에 보관하는 것으로 기술했습니다. 다양한 NAD(P)(H) 분획물에 대한 pH의 영향(예: 환원된 NAD(P)H 형태의 산 불안정성)은 대부분의 연구에서 pH 중성 추출 용매를 사용하게 했습니다. . 그러나 환원 및 산화 대사 산물의 빠른 상호 전환과 NAD(H)50-53에 대한 무산소 효과를 감안할 때 조직 대사 산물의 신속한 추출과 세포 NAD(P)(H )-산화환원/소비 효소, 예를 들어 단백질 제거. 이러한 라인을 따라 사후 조직 수집에 대한 우리의 분석은 사후 분석이 NAD 플러스의 감소를 선호한다는 것을 나타냅니다. 조직 NAD 플러스의 감소는 이전에 확장된 2.5-h 저산소 대기54에 노출된 쥐의 뇌, 심장 및 간에서 생체 내에서 설명되었습니다. 스냅 동결 전에 조직 수집을 희생하십시오. 이것은 마취 상태에서 조직을 추출하거나 희생 후 대사산물 분석에 사용하기 위한 조직의 즉각적인 수확을 우선시하는 동안 대표적인 NAD(P)(H) 측정을 얻기 위해 발생해야 함을 나타낼 수 있습니다.

또한 NAD(P)(H) 측정의 전반적인 연구 내 가변성에 기여하기 위해 각각 다른 제한을 갖는 다양한 정량화 방법에 대한 가능성이 있습니다. 지난 20년 동안 가장 자주 사용된 방법은 효소 순환 분석, LC-MS 및 HPLC였습니다. 이러한 각 방법은 대사산물 추출 기술, 정량화 매개변수 및 적절한 품질 관리 구현의 영향을 받습니다. LC-MS를 사용하여 Lu et al. NAD(P)(H) 대사산물의 환원 및 산화 형태 사이의 상호전환이 다양한 추출 완충액 또는 아세토니트릴:메탄올:물과 0.1M 포름산 혼합물이 포함된 용매에서 서로 다른 속도로 발생하여 최소한의 상호 전환으로 가장 높은 회복31. 그러나 LC-MS를 사용하는 경우 NAD(P)(H) 동위원소와 같은 내부 제어를 스파이킹하여 연구의 개별 샘플 간에 이러한 상호 변환을 모니터링할 수 있으며, 이는 HPLC 및 효소에 비해 LC-MS 기술의 이점입니다. 순환 분석31,33,55. 그럼에도 불구하고 잘 제어된 LC-MS 기술을 사용하더라도 매트릭스 효과 및 이온화 효율의 변화를 포함하여 다양한 요인이 측정된 신호를 방해할 수 있습니다. 예를 들어 일부 연구에서는 LC-MS 기반 대사체학에서 내부 표준으로 13C 표지 효모 추출물을 사용합니다. 그러나 추출된 샘플 대사 산물 매트릭스를 13C 표지 효모 추출물 대사 산물 매트릭스로 스파이킹하면 표지 및/또는 비표지 대사 산물의 신호를 감소시키는 이온 억제와 같은 다양한 결과를 초래할 수 있으며 그렇지 않은 경우 절대 정량화에서 오류가 발생할 수 있습니다. 철저한 품질 평가56에 의해 감지되었습니다. 또한 LC-MS 기술은 이론적으로 한 번의 실험에서 여러 NAD(P)(H) 대사체를 측정할 수 있지만 관심 대사체의 농도 차이가 큰 경우 최적의 희석을 실행해야 하기 때문에 여전히 한계가 있습니다. 따라서 더 간단한 효소 순환 분석에 비해 장점이 있음에도 불구하고 LC-MS 방법의 복잡성으로 인해 철저한 최적화가 필요합니다. 최근 NAD와 바이오센서, 이미징 기반 질량 분석법과 같은 새로운 분석 방법이 개발되었지만 메타 분석에 포함시키기에는 이러한 기술에서 생성된 정량적 데이터가 아직 충분하지 않습니다. 그러나 우리의 메타 분석에 포함된 한 연구는 마우스 간 및 기타 샘플 유형57에서 NAD 플러스 수준을 측정하기 위해 종이 기반 생물발광 바이오센서를 사용했습니다. 이 연구는 유사한 검출 방법으로 인해 생물 발광 분석 그룹에 포함되었습니다 (그림 1a).


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이 분석을 위해 677건의 연구 데이터를 제외했습니다. 여기에는 정량적이 아닌 상대 NAD(P)(H) 결과(51%)를 제공한 연구와 NAD(P)(H)가 농축된 연구가 포함되었습니다.로 정규화되지 않았다조직 무게, 단백질 함량, 또는혈액량(13퍼센트). 제외된 연구의 36%는 적합하지 않은 표본(예: 포유류가 아닌 피험자, 세포 또는 조직 배양)에서 수행되었습니다. 제외된 연구 외에도 이 메타 분석의 주요 한계에는 분석 전 절차(사전 또는 사후 추출 또는 추출 버퍼 정보) 및/또는 분석 방법과 관련된 보고된 정보의 다양성 또는 부족이 포함됩니다. 설치류 희생 시 연령, 성별, 유전적 배경, 식이, 섭식 상태 등을 고려합니다.
우리의 메타 분석은 연구 간 변동성과 NAD(P) (H) 정량적 측정을 표준화할 필요성을 강조하지만, 우리의 분석은 다음을 평가하거나 토론하지 않습니다.비교 결과의 타당성개별 연구 내에서. 의 바이오마커 역할을 하는 여러 NAD(P)(H) 대사산물의 의미를 고려할 때인간의 건강, 사전 분석 및분석 절차허용 할 것입니다연구 간 결과의 더 나은 비교. 이것은 증가함에 따라 더욱 중요해집니다.조직 NAD(P)(H) 수치를인간의 건강을 향상시킵니다.

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행동 양식

문헌 검색. "Epub Ahead of Print", "In-Process & Other Non-Indexed Citations", "Versions", "PubMed-Not-MEDLINE", "Daily update", "Front segment 주간 업데이트", "Back fles from 1946 to start" 정면의MEDLINE ALL(Ovid) 데이터베이스에서 1946년부터 2021년 6월 20일 사이의 세그먼트" 인용을 검색하고포유류 조직에서 NAD(P)(H) 대사체 수준의 정량적 데이터를 포함하는 기사를 검토했습니다.부록 S1에 줄 지어 있습니다. 검색 쿼리 전략은 3377개의 기사를 산출했습니다. 추가 혈액 집중 수색은동일한 데이터베이스를 사용하여 수행되었으며 1513개의 기사가 생성되었습니다(부록 S2).
스크리닝 방법론. 포유류 조직 및 혈액에서 NAD(P)(H) 대사산물 정량화를 보고하는 초록 및 제목은 전문 스크리닝을 거쳤습니다. 모든 초록 검토는 두 번째 검토로 확인되었습니다.충돌이 해결되었습니다. 초록심사 후 643편의 논문을 전문 심사 대상으로 선정조직 중심 검색 및 혈액 중심 검색에 대한 272(보조 그림 10). 사전에만 연구보낸 상대 NAD(P)(H) 대사 산물 데이터는 전체 텍스트 스크리닝 중에 제외되었습니다.NAD를 보고하는 연구...을 더한/NADH 비율. tssues, 세포, 분리된 소기관에서 엄격하게 파생된 결과 유지배지에서 또는 관류로부터의 혈액 용리액에서 제외되었습니다. 이 전체 텍스트 검토로 인해 667이 제외되었습니다.(457 plus 210) 기사는 주로 NAD 대사체 데이터의 부족(50.5%)으로 인해 부적합한 데이터에서 파생되었습니다.표본(36.3%), 또는 상대/임의 단위로 제시된 데이터(13.2%). 마지막으로 241개의 기사가 포함되었습니다.정성적 메타 분석 및 정량적 메타 분석에서의 205(보충 그림 10). 비록 우리의초기 검색에는 1946년부터 2021년 6월 20일까지 발표된 연구가 포함되었습니다. 위에서 언급한 바와 같이 가장 오래된 연구는당사의 허용 기준을 충족하는 양적 NAD(P)(H) 데이터는 1961년에 게시되었습니다.


데이터 추출.

NAD(P)(H) 대사산물에 대한 수치 데이터는 기사에서 직접 얻거나 반자동 데이터 추출 소프트웨어(WebPlotDigitizer58)를 사용하여 기사 수치에서 추출했습니다. 추가로, 적용 가능한 경우 희생 및/또는 조직/혈액 샘플링 방법(즉, 마취 및/또는 안락사 방법, 조직 취급 및 보관 온도)과 관련된 조직 샘플링 시점을 기록했습니다. 동물 모델의 경우 종, 특성(예: 계통, 유전자형, 연령 및 체중) 및 환경 조건(예: 수면 주기, 식이 유형, 섭식 빈도 및 조직 샘플링과 관련된 섭식 상태)을 기록했습니다. 또한, 모든 연구에 대해 치료(예: 약리학적 치료, 수술, 방사선 조사, 종양 유도 및 연구 대상에 적용되는 기타 절차) 및 모든 연구 그룹 정보(예: 치료 또는 질병 그룹 및 해당 컨트롤)가 추출되었습니다. 마지막으로, NAD(P)(H) 정량화 방법(예: 효소 분석법, 질량 분석 기반, HPLC, NMR, 생물발광) 및 출판 세부 사항(예: 출판물 제목, 참조 코드[DOI, Medline UI, PMID] 또는 하이퍼링크) 및 발행 연도)가 표시되었습니다(보충 자료 2).



데이터 분석. 분석 전에 모든 농도는 조직 샘플의 경우 nmol/g 또는 단백질의 nmol/g 또는 혈액 분획의 경우 nmol/ml로 변환되었습니다. 단백질 함량으로 정규화된 결과의 수가 적기 때문에 조직 중량 및 혈액량으로 정규화된 결과만 표시합니다. 통계 분석은 GraphPad Prism 버전 9.3.1(GraphPad Sofware Inc., San Diego, California, USA,데이터 가용성이 연구 중에 추출되고 분석된 모든 데이터는 이 게시된 기사 및 보충 자료에 포함되어 있습니다.정보 파일.수신: 2022년 4월 29일; 수락: 2023년 2월 7일



참조

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