메트포르민은 자연적으로 노화된 마우스 모델에서 노화로부터 수정체 상피 세포를 보호합니다
Jul 12, 2022
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소개
수정체 상피 세포(LEC)는 수정체의 전방 캡슐을 감싸는 세포의 단층을 형성하고 적도 수정체 활까지 확장됩니다[1, 2]. LEC의 정상적인 구조와 기능은 전체 수정체의 투명도와 대사 항상성을 유지하는 데 필수적입니다[3]. 증가하는 증거는 LEC의 노화가 효소 및 크리스탈린을 포함한 수정체 단백질의 변형, 변성 및 응집을 일으켜 궁극적으로 수정체 혼탁 또는 백내장을 유발할 수 있음을 나타냅니다[3-5]. 연령 관련 백내장(ARC)은 여전히 노인의 삶의 질에 심각한 영향을 미치는 시각 장애 및 실명의 주요 원인입니다[6]. 현재 ARC의 진행을 예방하기 위한 효과적인 전략은 없습니다. 따라서 수정체의 투명도를 향상시키고 ARC 진행을 지연시킬 수 있는 약리학적 중재의 개발이 필요합니다.
지난 수십 년 동안 과학자들은 몇 가지 유전적, 식이 요법 및 약리학적 개입을 사용하여 건강을 개선하고 수명을 연장하는 데 놀라운 진전을 이루었습니다[7]. 메트포르민(MET)은 광범위하게 연구된 노화 방지제 중 하나입니다. 실질적인 연구에 따르면 MET는 다양한 동물 모델 시스템에서 노화를 완화하고 건강한 수명을 연장할 수 있습니다. MET는 Caenorhabditis elegans의 수명을 연장할 뿐만 아니라 건강과 활력을 향상시킬 수 있습니다[8]. MET는 Drosophila midgut 줄기 세포에서 노화와 관련된 산화 스트레스 관련 DNA 손상 축적을 줄여 수명을 연장할 수 있습니다[9]. 이전 연구는 또한 만성 저용량 MET 투여가 생쥐의 건강과 수명을 향상시키는 것으로 나타났습니다[10]. 더욱이, 새로운 증거는 당뇨병 환자가 MET로 치료될 때 당뇨병이 없는 대조군과 비교할 때에도 생존 이점을 나타냄을 나타냅니다[11].
다양한 모델 유기체에서 MET의 수명 촉진 활성 외에도 MET는 연령 관련 질병을 개선하기 위해 여러 세포 신호 전달 경로를 표적으로 합니다. MET는 주로 AMP(adenosine monophosphate) 활성화 단백질 키나제(AMPK) 활성화를 통해 자가포식을 조절하고 신경변성 및 신경 염증을 예방하여 파킨슨병에서 신경 보호 역할을 하는 것으로 나타났습니다[12]. 유사하게, MET는 AMPK 및 내피 산화질소 경로를 통해 간 정현파 내피 세포의 연령 관련 변화를 개선합니다[13].cistanche 복용량 레딧또한, MET에 의한 만성 AMPK 활성화는 당뇨병이 있는 OVE26 마우스에서 자가포식을 상향 조절하여 심근병증을 예방합니다[14]. 또한, MET는 자가포식 및 칼로리 제한을 강화하여 연령 관련 심혈관 악화를 완화합니다[15]. 또한, MET 치료는 고지방식이에 의해 유도된 ApoE{5}}마우스 및 토끼에서 연령 관련 죽상동맥경화증을 억제하여 죽상경화반 석회화를 유의하게 예방하고 고감도 C-반응성 단백질 수준을 감소시키며 활성을 억제할 수 있습니다. 혈관의 핵인자 카파 B(NF-kB)경로 [{10}}].
이러한 관찰을 바탕으로 본 연구는 MET가 ARC 노화와 기본 분자 메커니즘을 지연시킬 수 있는지 여부를 조사하려고 시도했습니다. 우리의 연구 결과는 다음과 같습니다: (i) 만성 저용량 MET 치료는 자연적으로 노화된 마우스에서 LEC의 노화를 지연시켜 수정체 불투명도를 억제했습니다. (i) AMPK 경로가 비활성화되었고 노화 LEC에서 자가포식 흐름이 손상되었습니다. ) 만성 저용량 MET 치료는 AMPK 경로를 활성화하고 자가포식을 강화함으로써 자연적으로 노화된 마우스에서 LEC의 노화를 지연시켰다. 우리의 발견은 MET의 추정되는 노화 방지 역할을 입증하고 MET가 ARC에 대한 가능한 치료 옵션으로 입증될 수 있다는 충분한 증거를 제공합니다.
결과
LEC의 노화는 자연적으로 노화된 마우스에서 ARC와 연관되었습니다
노화의 영향을 포함하여 ARC의 여러 잠재적 메커니즘이 광범위하게 조사되었습니다.시스탄치 추출물의 이점,그러나 LEC의 노화와 생체 내 ARC 사이의 연관성은 아직 명확하지 않습니다. 우리는 LEC의 노화가 생체 내에서 ARC를 유발할 수 있다고 가정했습니다. 따라서 우리는 ARC의 마우스 모델을 구성했습니다. 우리의 결과는 자연적으로 노화 된 마우스 (나이가 많은 마우스)의 렌즈 투명도가 대조군 (어린 마우스)의 렌즈 투명도와 비교하여 유의하게 감소한 것으로 나타났습니다 (그림 1a). 그림 1b에서 보는 바와 같이 자연노화군에서 백내장 발병률은 95.23%였다. H&E 염색 분석 결과 대조군의 LEC는 모양이 둥글고 규칙적으로 배열되었으며, 정상 LEC의 밀도는 비교적 높은 반면, 자연 노화된 마우스의 LEC는 모양이 평평하고 고르지 않게 배열되었으며, 노화 LEC가 현저하게 감소했습니다(그림 1c). 또한, SA- -Gal 염색은 자연적으로 노화된 마우스에서 노화 LEC의 비율이 상승함을 보여주었습니다(그림 1d). 또한, IHC 염색 및 웨스턴 블롯 분석을 통해 노화 관련 마커의 단백질 발현을 분석했습니다. IHC 염색은 p21 및 p53의 발현이 어린 마우스에 비해 자연적으로 노화된 마우스의 LEC에서 증가함을 보여주었다(도 1e, f). 유사하게, 우리는 p21과 p53의 단백질 발현이 어린 마우스의 수정체 캡슐보다 자연적으로 노화된 마우스의 수정체 캡슐에서 더 높다는 것을 추가로 발견했습니다(그림 1g). 이러한 결과는 자연적으로 노화된 마우스에서 LEC의 노화가 ARC와 관련이 있음을 시사했습니다.
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만성 저용량 MET 투여는 수정체의 투명도를 개선하고 LEC의 노화를 완화했습니다. 우리는 ARC에 대한 메트포르민의 효과를 테스트하기 전에 만성 저용량 MET 투여가 마우스에 안전한지 여부를 결정했습니다. 10개월 동안 MET 처리 후, 28마리의 마우스(자연노화군에서 18마리, MET군에서 10마리)가 자연사하였다. 우리는 두 그룹의 살아있는 생쥐가 건강했으며 두 그룹 사이의 체중과 장기 무게에 유의한 차이가 없음을 발견했습니다(표 1). 따라서 이러한 결과는 연구에 사용된 메트포르민의 용량이 동물에게 안전하고 후속 실험에 사용될 수 있음을 나타냅니다.
그 후, MET가 자연적으로 노화된 마우스에서 수정체 혼탁을 억제하고 LEC의 노화 관련 노화를 완화할 수 있는지 여부를 평가하기 위해 만성 저용량 MET를 투여했습니다. 예상대로 자연노화군에 비해 MET군 수정체의 투명도가 크게 향상되었다(Fig. 2a). 또한 형태학적 관찰을 통해 MET군의 렌즈가 불투명도가 감소한 것을 확인하였다. 백내장 발병률은 자연노화군에서 95.23%인 반면, MET군에서는 19.{6}}%였습니다(그림 2b). H&E 염색 분석 결과 MET군에서 LEC의 밀도가 현저히 높은 것으로 나타났습니다. 자연적으로 노화된 마우스보다(그림 2c). 또한, MET 그룹의 LEC는 자연적으로 노화된 그룹의 LEC와 비교하여 모양이 비교적 원형이었습니다(그림 2c). SA{10}}Gal 염색은 노화된 LEC의 비율이 자연적으로 노화된 그룹에 비해 MET 그룹에서 유의하게 감소함을 보여주었습니다(그림 2d). IHC 분석은 자연 노화 그룹보다 MET 그룹의 LEC에서 p21 및 p53의 발현이 더 많이 감소한 것으로 나타났습니다(그림 2e, f). 유사하게, 웨스턴 블롯 분석은 p21 및 p53의 단백질 발현이 자연적으로 노화된 그룹에 비해 MET 그룹의 수정체 캡슐에서 현저하게 감소되었음을 나타내었다(그림 2g). 이러한 결과는 만성 저선량 MET 투여가 수정체의 투명도를 개선하고 LEC의 노화를 완화할 수 있음을 의미했습니다.
만성 저용량 MET 투여는 AMPK 활성화를 통해 자연적으로 노화된 마우스에서 LEC의 노화를 약화시켰습니다 압도적인 양의 데이터는 AMPK를 활성화하는 것이 모델 유기체의 수명을 연장하기에 충분하다는 결론을 뒷받침하여 장수 목표로서의 매력을 증가시킵니다[19,20] . 이 이론을 고려하여 우리는 마우스의 LEC에서 AMPK 경로의 발현을 평가했습니다. 상대적인 FAS mRNA 수준은 자연 노화 그룹에서 감소하고 MET 그룹에서 증가했습니다(그림 3a). 도 3b,c에 나타낸 바와 같이, 인산화된 AMPKa(Thr172) 및 인산화된 ACC(Ser79)의 발현은 어린 마우스에 비해 자연적으로 노화된 마우스의 LEC에서 감소하였다. 그러나 인산화된 AMPKa(Thr172)와 인산화된 ACC(Ser79)의 발현은 자연노화군에 비해 MET군의 LEC에서 증가하였다. 또한, Western blot 분석 결과, 자연노화의 수정체낭에서 인산화된 AMPKa(Thr172)와 인산화된 ACC(Ser79)의 단백질 발현이 유의하게 하향조절되었으며, 인산화된 AMPKa(Thr172)와 인산화된 ACC( Ser79)는 MET 그룹의 수정체 캡슐에서 증가했습니다(그림 3d). 이러한 데이터는 AMPK 경로가 자연적으로 노화된 마우스의 LEC에서 비활성화되었음을 보여주었습니다. 또한, 만성 저용량 MET 투여는 AMPK 활성화를 통해 자연적으로 노화된 마우스에서 LEC의 노화를 약화시켰다.
만성 저용량 MET 투여는 자연적으로 노화된 마우스에서 LEC의 노화를 완화하기 위해 자가포식 플럭스를 회복시켰습니다. 이전 연구에서는 자가포식이 노화의 부작용을 퇴치하는 데 중요한 역할을 할 수 있음을 보여주었습니다[21,22]. MET 처리 후 수정체의 분자 및 세포 변화를 추가로 분석하기 위해 LC3 및 p62가 자가포식 수준의 바이오마커로 널리 인정되기 때문에 LC3 및 p62의 발현을 결정했습니다. 도 4a에 나타난 바와 같이, 상대적인 p62 mRNA 발현 수준은 대조군에 비해 자연노화군에서 유의하게 증가하였다; 그러나 p62의 상대적 mRNA 발현 수준은 자연적으로 노화된 그룹과 비교하여 MET 그룹에서 실질적으로 하향 조절되었다.시스탄체 징기스칸또한 IHC 염색 결과 자연적으로 노화된 마우스의 LEC에서 미세소관 관련 단백질 1 경쇄 3(LC{3}}II/l) 및 p62의 수준이 증가했음이 밝혀졌습니다. 또한, 우리의 결과는 LC3-II/l 및 p62의 수준이 MET 그룹의 LEC에서 현저하게 감소되었음을 보여줍니다(그림 4b, c). LC{8}}ll 및 p62의 단백질 수준은 자연 노화 그룹의 수정체 캡슐에서 현저하게 증가했습니다(그림 4d). 종합하면, 우리는 자연적으로 노화된 마우스의 LEC에서 자가포식 플럭스가 손상되었고 자연적으로 노화된 마우스에서 LEC의 노화를 완화하기 위해 만성 저용량 MET 투여에 의해 회복될 수 있다고 추측했습니다.
논의
치료되지 않은 백내장은 수정체의 혼탁을 특징으로 하는 전 세계적으로 실명의 주요 원인입니다[23]. 역학 연구에 따르면 ARC로 알려진 백내장의 주요 위험 인자는 연령이며 유일한 치료법은 외과 적 제거입니다 [24]. 이전 연구에서는 LEC의 노화가 ARC의 주요 원인임을 보여주었습니다[25]. 현재까지, 바람직하지 않은 부작용 없이 수정체 혼탁을 억제하고 LEC의 노화를 약화시키는 효과적인 치료제가 없었다. 본 연구의 초점은 LEC의 노화에 대한 분자 생물학적 기초와 노화에 대해 정상적인 LEC를 보호하는 메커니즘을 평가하는 것이 었습니다. 우리의 결과는 AMPK의 비활성화와 autophagy의 손상이 LEC와 ARC의 노화와 관련이 있음을 보여주었습니다. 또한, 우리는 MET가 AMPK를 활성화하고 자가포식을 강화함으로써 LEC를 노화로부터 보호하고 수정체의 탁함을 억제할 수 있음을 발견했습니다.
노화는 조직 기능의 전반적인 감소를 동반하는 기본적인 생물학적 과정입니다. 수명이 증가함에 따라 ARC와 같은 노화 관련 기능 장애는 심각한 건강이 됩니다.
문제 [26]. LEC의 노화는 ARC의 발생 및 발달에 관여하는 것으로 보고되었습니다[5]. 우리의 결과는 자연적으로 노화된 마우스의 LEC가 모양이 평평하고 고르지 않게 배열되었으며 LEC의 밀도가 현저하게 감소한 것으로 나타났습니다(그림 1c, d). 또한, 노화 관련 유전자(p21 및 p53)의 발현은 자연적으로 노화된 마우스의 LEC에서 상향 조절되었다(도 1e, f, g). 우리의 결과는 LEC의 노화가 ARC의 발생 및 발달과 관련이 있음을 암시했습니다. 따라서 새로운 치료 전략에 대한 근거를 제공하기 위해서는 LEC의 노화를 뒷받침하는 분자 메커니즘에 대한 정확한 이해가 필요할 수 있습니다.
MET는 전 세계적으로 제2형 당뇨병에 대해 가장 널리 처방되는 경구 혈당강하제입니다. 새로운 증거는 MET가 혈당 개선과 관련된 것 이상으로 건강에 유익한 영향을 미친다는 것을 나타냅니다[27]. MET의 기전은 AMPK 활성화, 자가포식 증가, 염증 억제, 항산화 효과 발휘와 같은 생물학적 노화의 기본 경로를 표적화하는 데 중요하다는 것이 확인되었습니다[28]. 인간의 경우 MET는 60년 이상 임상 실습에 사용되었습니다. 그것은 높은 안전성 프로필을 가지고 있으며 노화 및 노화 관련 질병을 담당하는 몇 가지 중요한 경로에 개입할 수 있는 고유한 위치에 있습니다. 그러나 ARC에 대한 MET의 영향과 이러한 효과의 조절 메커니즘은 보고된 적이 없습니다. 결과적으로, 우리 연구에서 자연적으로 노화된 마우스에서 만성 저용량 MET 투여는 수정체의 투명도를 개선하고(그림 2a) 생체 내에서 LEC의 노화를 약화시켰습니다(그림 2).
MET가 항노화 효과를 발휘하는 MET의 잠재적 기전인 AMPK 경로를 활성화한다는 것은 널리 알려져 있습니다[29]. 세포 에너지 센서인 AMPK는 세포 에너지 균형을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다[30]. 여러 연구에 따르면 AMPK는 에너지를 장수와 연관시키는 여러 경로 및 프로세스의 통합자 및 매개체 역할을 합니다. 우리 연구에서 우리는 AMPK의 비활성화가 자연적으로 노화된 마우스에서 노화된 LEC의 특징임을 발견했습니다(그림 3). 결과적으로 MET는 AMPK 경로를 자극하여 LEC의 노화를 방지하는 것으로 나타났습니다(그림 3). 확립된 AMPK 활성제로서, 노화 예방에서 MET의 역할은 일반적으로 자가포식의 회복, Sirt1 및 Foxo1의 활성화 및 mTOR의 억제와 같은 다운스트림 신호 전달 경로를 조절하는 효과에 기인합니다[31,32]. 우리의 연구는 ARC의 발생을 예방하는 데 MET에 의해 활성화된 AMPK 기능의 중요성을 강조하는 새로운 증거 라인을 제공했습니다.
위에서 언급했듯이 AMPK는 autophagy의 증가를 포함하여 노화 방지 효과를 발휘하기 위해 수많은 경로 및 단백질과 통신합니다. 장수 보장을 위한 핵심 프로세스로 부상하고 있는 자가포식은 노화 관련 질병의 잠재적인 치료 표적으로 광범위한 관심을 끌고 있습니다. Autophagy는 유체의 다단계 복잡한 생물학적 과정입니다. 자가포식의 전체 과정을 자가포식 플럭스라고 하며, 이는 자가포식 수준을 반영하는 데 널리 사용됩니다. 자가포식의 지표로서 LC{3}}Il은 리소좀 효소에 의해 분해되는 자가포식소막에 단단히 결합되어 있습니다.시스탄체 수명 연장유사하게, 자가포식-특이 기질인 p62는 일반적으로 자가포식용해소체에서 분해되고, 그 발현은 자가포식의 수준을 간접적으로 반영한다. 현재 연구에서 우리의 발견은 노화 LEC에서 autophagy 수준이 뚜렷하게 감소한 반면(그림 4), MET는 autophagy의 연령 관련 손상을 역전시켰습니다(그림 4). MET의 노화 방지 분자 메커니즘은 일반적으로 AMPK 활성화를 통해 자가포식을 향상시키기 때문에 세포에서 AMPK의 주요 기능에 기인합니다[33]. 또한 MET는 자가포식을 직접적으로 증가시켜 노화 방지에 기여하는 것으로 나타났습니다[34]. 그러나 MET가 독립적 또는 의존적 AMPK 경로를 통해 자가포식을 증가시킨다는 것을 증명하는 근본적인 메커니즘을 설명하기 위해서는 더 자세한 연구가 필요합니다.
ARC의 유병률은 아시아 출신 인구의 성별과 관련이 없다는 것이 입증되었습니다[35, 36]. 따라서 우리는 섹스를 ARC에 영향을 줄 수 있는 요인으로 고려하지 않았습니다. 우리의 연구는 위에서 언급한 한계를 고려하여 해석되어야 한다.
결론
요약하면, 우리는 AMPK 경로의 비활성화와 자가포식의 연령 관련 손상이 LEC의 노화와 ARC의 발생에 기여할 수 있음을 입증했습니다. 또한, 우리 실험의 데이터는 MET가 AMPK 경로의 활성화와 자가포식의 증대를 통해 LEC의 노화와 ARC의 형성을 효과적으로 지연시키는 것으로 나타났습니다. 우리의 발견은 ARC의 노화 과정에서 MET의 역할에 유용한 분자 메커니즘의 추가 조사를 위한 기본 라인이며 ARC의 발생 및 발달에 대한 새로운 전략 개발에 대한 보다 집중적인 연구에 유익할 것입니다.
재료 및 방법 시약
MET는 Bristol-Myers Squibb Company(중국)에서 구입했습니다. SQSTM1/p62({14}})는 Abcam(MA, USA)에서 구입했습니다. LC3(12741) 및 포스포-아세틸 CoA 카르복실라제(p-ACC)(Ser79)(3661)에 대한 항체는 Cell Signaling Technology( 매사추세츠, 미국).
동물과 치료
3개월 및 8개월 된 수컷 C57BL6J 마우스는 Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd.(Beijing, China)에서 구입했습니다. 마우스는 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있는 12시간 명암 주기의 온도 제어(온도, 20-25도 및 상대 습도, 55±15%) 조건에 수용되었습니다. 동물에 대해 수행된 모든 절차와 프로토콜은 하얼빈 의과대학 윤리위원회의 승인을 받았습니다.
마우스를 다음 세 그룹으로 나누었습니다. (i) 어린 마우스(3개월, 체중=29.72±1.66 g, n =40)가 있는 대조군은 표준 정제 마우스 식이와 물을 받았습니다. 임의대로; 생후 1개월에{21}} 생쥐 120마리를 무작위로 두 그룹(자연노화 그룹과 MET 그룹)으로 나누었습니다. (i) 자연 노화 그룹(나이든 마우스, 20개월, 체중=32.98±1.93g, n{13}})은 표준 정제 마우스 식이와 물을 임의로 제공받았습니다.(ii) MET 그룹( 20개월령, 체중=310.21±2.81g,n{19}})은 마우스가 10개월령에 도달할 때까지 표준 정제 마우스 식이와 물에서 유지되었습니다. 그 후, 치료가 시작되었습니다. MET 그룹의 마우스는 0.1% MET(Bristol Myers Squibb, China)와 물을 10개월 동안 자유롭게 보충한 식단을 먹였습니다.
렌즈와 렌즈 캡슐의 분리
마우스는 경추 탈구를 통해 안락사되었습니다. 모든 실험 동물의 눈 전체를 즉시 절제하고 멸균 식염수에 넣었습니다. 시신경을 위쪽으로 위치시키고 핀셋으로 고정하였다. 그런 다음 눈으로 들어가는 시신경을 절개하고 공막을 뒤로 당겨 수정체를 노출시켰습니다.시스탄체 NZ그 후, 우리는 핀셋을 사용하여 렌즈의 적도면에 부착된 모양체 조각을 부드럽게 제거했습니다. 새 렌즈의 사진을 즉시 촬영하고 렌즈를 실온에서 4% 파라포름알데히드로 신속하게 고정했습니다. 전체 수정체 캡슐을 나머지 수정체에서 빠르게 벗겨내고 액체 질소에서 급속 동결한 다음 후속 실험을 위해 80°C에서 보관했습니다.
헤마톡실린 및 에오신(H&E)
신선한 수정체를 즉시 실온에서 4% 파라포름알데히드로 고정하고 파라핀에 포매했습니다. 조직학적 검사를 위해 조직을 4-μm 조각으로 절단했습니다. 탈파라핀화 및 재수화 후, 준비된 파라핀 절편을 8분 동안 헤마톡실린(H) 용액으로 염색한 다음 1% 산성 에탄올(70% 에탄올 중 1% HCl)에 5회 침지합니다.
및 증류수로 헹굽니다. 이어서, 절편을 에오신(E) 용액으로 3분 동안 염색한 후 등급 알코올로 탈수하고 자일렌으로 제거하였다. 현미경(Nikon, Eclipse, Japan)에서 형태학적 변화를 관찰하였다.
노화 관련 -갈락토시다아제(SA- -Gal) 분석 노화 관련 -갈락토시다아제(SA- -Gal) 활성은 SA- -Gal 염색 키트(Sigma, CS{ {12}}030). 제조업체의 지침에 따라 일련의 처리 후 조직 절편을 인산완충식염수(PBS)로 5분(3회) 세척한 다음 SA{10}gal 염색 용액(pH 6.0)에서 인큐베이션했습니다. 24시간 동안 CO2 없이 37도. 이미지는 광학 현미경(Nikon, Eclipse, Japan)으로 캡처되었습니다. SA{16}}gal-양성 세포의 백분율은 양성 세포의 평균 수/총 세포의 평균 수로 추정되었습니다.
정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(gRT-PCR) TRlzol 시약을 사용하여 마우스의 수정체 캡슐에서 총 RNA를 추출했습니다. 역전사는 ExScript RT 시약 키트(Invitrogen)를 사용하여 수행되었습니다. SYBR Green Supermix를 사용하여 정량적 역전사-중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 분석을 수행했습니다.
키트(Takara, Tokyo, Japan), 내인성 대조군으로 -액틴 포함. 전사는 FAS(forward, 5'-TTGCTGGCACTACAGAATGC-3' 및 reverse, 5'-AACAGCC TCAGAGCGACAAT-3'), p62(forward,5'-GGCGCACTACCGCGATGAGGA{{ 10}} 및 역방향, 5'-TGTTCCCGCCGGGCACTCCTT{13}}') 및 -액틴(정방향, 5'-TCGTGGGCCGCCCTAGGCAC{17}}' 및 역방향, 5'-TGGCCTTAGGGTTC AGGGGGG-3') 각 유전자 발현 수준은
방법. -액틴으로 정규화하고 2-△△ct r 면역조직화학(IHC) 염색을 사용하여 계산 그룹당 선택된 1{12}} 렌즈 각각에서 총 5개의 대표 섹션을 면역조직화학(IHC) 분석에 사용했습니다. p21, p53, p-AMPK, p-ACC, LC3 및 p62의 발현을 평가합니다. 준비된 샘플을 6{17}}도에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 탈파라핀화를 위해 자일렌 및 등급 알코올 시리즈를 통과했습니다. 이어서, 샘플을 0.1M 구연산(pH 6.1)에 30분 동안 끓인 후 실온으로 냉각시켰다. PBS로 3회 세척한 후 샘플을 0.3% H2O에 담가 내인성 퍼옥시다제 활성을 억제하였다. 이어서, 1차 항체를 첨가하고 4℃에서 밤새 냉각하였다. 상응하는 2차 항체를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS로 세척한 후, 샘플을 원하는 염색 강도가 나타날 때까지 디아미노벤지딘(DAB)에서 인큐베이션하였다. 면역 염색된 세포의 이미지는 Nikon Eclipse 현미경(Nikon, Eclipse, Japan)을 사용하여 캡처되었습니다.
웨스턴 블롯 분석
생쥐의 수정체 캡슐에서 총 단백질을 RIPA(radio-immunoprecipitation assay) 완충액과 protease inhibitor cocktail(Pierce, USA)을 사용하여 추출하고, BCA(bicinchoninic acid) 키트(Thermo Fisher Scientific, USA)를 사용하여 단백질 농도를 정량화했습니다. . 총 단백질(40 ug)은 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 사용하여 분석하고 폴리비닐리덴 디플루오라이드 필터(PVDF) 멤브레인(Millipore, Germany)에 전기영동으로 옮겼습니다. 막을 4℃에서 1차 항체와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 막을 상응하는 2차 항체와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 면역반응성 밴드는 Super Signal West Pico와 함께 화학발광 기질 방법을 사용하여 가시화되었다. 키트 (Pierce Biotechnology, USA). 세 가지 독립적인 실험을 수행했습니다.
통계 분석
데이터는 평균±표준편차(SD)로 표현하였다. 통계 분석은 GraphPad Prism 7.{1}} 소프트웨어와 Microsoft Excel을 사용하여 수행되었습니다. Image J 소프트웨어를 사용하여 단백질을 정량화했습니다. 스튜던트 t-검정과 분산분석(ANOVA)을 사용하여 실험 데이터의 통계적 유의성을 계산했습니다. P-값과의 차이<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" all="" experiments="" were="" repeated="" independently="" at="" least="" three="">
데이터 가용성
현재 연구 중에 사용 및 분석된 데이터 세트가 이 게시된 기사에 포함되어 있습니다.
이 기사는 www.nature.com/cddiscovery에서 발췌했습니다.