쥐 재생 불량성 빈혈에서 당귀 다당류에 의한 미토콘드리아 막 안정화

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추상적인

쥐 재생 불량성 빈혈(AA)에서 당귀 다당류(Angelica Sinensis polysaccharide, ASP)에 의한 미토콘드리아 막 안정화 메커니즘을 조사하기 위해 ICR 마우스를 무작위로 대조군으로 나누었다. AA 및 ASP 처리 그룹 AA 그룹 마우스는 60Co Y 및 사이클로포스파미드 및 클로람페니콜의 복강 주사로 처리되었습니다. 대조군 동물은 납 차폐 조사 및 식염수 주사로 처리하였다. 처리된 AA 마우스에게 2주 동안 ASP를 먹였습니다. 골수의 미토콘드리아 미세구조는 투과전자현미경으로 관찰하였고 골수핵세포(BMNC)의 막관통전위는 형광분광광도법으로 관찰하였다. 배지의 Cox 및 MDH 함량도 세 그룹에서 연구되었습니다. 골수에서 BMNC의 미토콘드리아 수와 막관통 전위는 대조군에 비해 AA 그룹에서 감소했지만 ASP 처리 그룹은 대조군에 비해 개선되었습니다. AA 그룹. ASP 처리군의 완전한 미토콘드리아 절단은 유의하게 지연되었다(P< 0.05)="" as="" compared="" to="" the="" aa="" group.="" we="" conclude="" that="" asp="" might="" improve="" mitochondrial="" membrane="" stabilization,="" and="" suppress="" the="" downregulation="" of="" transmembrane="" potential="" and="" apoptosis="" of="" bmnc="" in="">

키워드: 재생 불량성 빈혈, 당귀 다당류, 미토콘드리아, 막 전위, ICR 마우스

cistanche 추출물: 골 형성을 촉진하고 골밀도를 증가시킵니다.

배경

재생 불량성 빈혈(AA)은 골수 및 관련 혈액 줄기 세포가 손상되어 적혈구, 백혈구 및 혈소판의 결핍을 유발하는 혈액 질환입니다. 이러한 결핍은 개별적으로 빈혈, 백혈구 감소증 및 혈소판 감소증으로 알려져 있으며 집합적으로 범혈구감소증으로 알려져 있습니다. 화학 물질, 약물, 방사선, 방사성 물질, 방사선 생성 장치, 감염에 대한 노출. 면역 질환, 유전(사례의 50%) 및 알려지지 않은 병인도 AA의 발병으로 이어질 수 있습니다.

미토콘드리아는 영양소 분자(기질)에서 에너지를 체계적으로 추출하여 아데노신 삼인산(ATP)을 생성하기 때문에 "세포의 발전소"로 간주됩니다[1]. 또한, mtDNA는 보호 히스톤과 효과적인 DNA 복구 시스템이 없기 때문에 높은 돌연변이율로 복제됩니다. mtDNA의 돌연변이는 후천적 철모구성 빈혈, 골수이형성 증후군 및 후천성 AA와 같은 혈액 질환과 관련이 있습니다[2-4]. 우리의 이전 연구 5]는 돌연변이에 의해 유도된 미토콘드리아 호흡 사슬의 기능적 손상이 AA 환자의 조혈 부전에 관련될 수 있음을 보여주었습니다. 말기 세포 사멸의 형태학적 특징(아폽토시스, 괴사, 자가포식 또는 유사분열)과 상관없이 미토콘드리아 막 투과화(MMP)는 종종 생존과 죽음 사이의 결정적인 사건입니다[6]

중국 전통 의학에 따르면 당귀는 혈액을 통합하고 순환을 촉진하는 데 도움이 됩니다[7]. 최근 연구에 따르면 당귀 추출물은 항산화 및 신경 보호 효과가 있는 것으로 나타났습니다[8,9]. 그러나 ASP의 항산화 기능은 아직 명확하지 않습니다. 이 연구는 미토콘드리아 용해 시간 곡선과 AA에서 ASP의 미토콘드리아 막 안정화 효과를 사용하여 초기 세포 손상을 조사했습니다.

cistanche 보충제는 골밀도를 증가시키고 골 형성을 촉진합니다.

재료 및 방법

동물의 그룹화

6-8주된 18-22g의 건강한 ICR 수컷 마우스는 Shandong University(중국)의 실험 동물 센터에서 제공했습니다. 동물은 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있는 따뜻하고 조용한 환경에 수용되었습니다. 실험을 시작하기 전에 일주일 동안 적응했습니다.

마우스를 무작위로 정상 그룹, AA 그룹 및 처리 그룹의 세 그룹으로 나누었습니다. 재생 불량성 빈혈 모델은 이전에 설명한 대로 생성되었습니다[10].

간단히 말해서, 마우스에 2.{1}}Gy 60Coy를 조사한 다음 다음 3일 동안 매일 40mg/kg/일 사이클로포스파미드 및 50mg/kg/일 클로람페니콜을 복강 내 주사했습니다. 치료군은 ASP(200 mg/kg/d, Chinese Medical Dictionary에 따름)를 위내로 먹였습니다. 대조군과 AA군 생쥐는 생리식염수(10 ml/kg/d)가 보충된 식이를 위 내로 먹였다. 또한, 모든 마우스는 연구 기간 동안 표준 식단을 받았습니다. 2주 동안 ASP 또는 생리 식염수로 처리한 후, 마우스를 경추 탈구로 희생시켰다.

혈액 검사

세 그룹의 꼬리 혈액 샘플은 각각 첫째 날과 14일째에 수집되었습니다. 말초 혈액 샘플에서 백혈구와 혈소판을 계산하고 Hb 수치를 결정했습니다. 실험이 완료되면 마우스를 희생시키고 골수 핵 세포(BMNC)의 차등 계수를 위해 대퇴골 도말을 준비했습니다(그림 1).

투과 전자 현미경

대퇴골 골수를 도말하고 초박형 섹션으로 슬라이스했습니다. 대퇴골 조혈 세포의 미토콘드리아를 50시야 이하 투과전자현미경(JEM{0}}EX, Japan)으로 분석하고 계수하였다.

미토콘드리아 용해 시간 곡선

미토콘드리아 분리 키트(Pierce Biotechnology Inc., USA)의 제조업체 프로토콜에 따라 뮤린 BMNC에서 미토콘드리아를 추출했습니다. 모노아민 산화효소(MAO)의 농도는 미토콘드리아의 농도를 나타내며 20개의 혈청 배양액에서 200U/ml 미토콘드리아 현탁액을 사용하여 다른 시점(30분 간격)에서 12시간 이내에 측정했습니다. 배지에서 cytochrome oxidase(Cox) 및 malate dehydrogenase(MDH)의 함량도 측정했습니다. 미토콘드리아 막의 피크 시간 분석과 기질 특이적 효소 농도-시간 곡선은 미토콘드리아 막 용해의 정도를 보여주었다.

미토콘드리아 막 전위

MAO 또는 ASP로 사전 배양한 후, 세 그룹에서 분리된 미토콘드리아를 0.5 ml 인산염 완충 식염수(Wuhan Boster Biotechnology, Ltd., 중국) 및 10 ul 로다민 123 작업 용액( Sigma-Aldrich, USA)를 첨가하고 37℃에서 5% CO2에서 15분 동안 인큐베이션하였다.미토콘드리아 막 전위는 490 nm의 여기 파장 및 520 nm의 방출 파장을 사용하여 유세포 분석에 의해 분석되었다.

통계 분석

통계 분석은 SPSS 19.{1}} 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 데이터는 평균 및 표준 편차로 표시됩니다. 학생의 t-검정은 다른 그룹을 비교하는 데 사용되었습니다. P < 0.05는="" 통계적으로="" 유의한="" 것으로="">

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결과

말초 혈액 및 BMC 수

전자동 혈액 세포 분석기를 사용하여 AA 마우스의 말초 혈액 세포 및 BMC 수가 현저하게 감소한 것으로 나타났습니다(P<0.05), indicating="" that="" the="" aa="" mouse="" model="" was="" successfully="" established="" (table="">

재생불량성 빈혈 쥐의 미토콘드리아 미세구조

AA 마우스 골수의 투과 전자 현미경은 미토콘드리아 미세구조가 처리군에서 ASP로 유의하게 개선되었음을 보여주었으며(표 2 및 그림 1), 이는 ASP가 AA 마우스에서 미토콘드리아를 안정화한다는 것을 나타냅니다. 대조군의 미토콘드리아의 크기와 모양은 정상이었다. 대조적으로. AA 그룹의 미토콘드리아는 크리스태의 붕괴 또는 소멸과 함께 구형 구조가 확대되었습니다(그림 1A-C).

재생 불량성 빈혈 마우스의 미토콘드리아 막 전위(MMP)

투과전자현미경에서 미토콘드리아 손상이 밝혀짐에 따라 우리는 형광 분광 광도계를 사용하여 세 그룹 간의 Rh 123 형광의 상대적 차이를 측정하여 AA 마우스에서 MMP에 대한 ASP의 영향을 결정했습니다.

그 결과 AA군(19.6±3.03)에서 골수세포의 Rh 123 형광이 대조군(31.7±2.59, P<0.0). however,="" the="" rh="" 123="" fluorescence="" of="" the="" asp-treated="" aa="" group="" was="" higher="" than="" that="" in="" the="" aa="" group=""><0.0i)(table 2="" and="" figure="" 2),="" indicating="" that="" asp="" facilitated="" the="" recovery="" of="" the="" mmp="" in="" aa="">

초기 세포 손상 미토콘드리아 용해 시간 곡선

대조군에서 미토콘드리아 체외 배양 Cox 및 MDH의 함량은 피크에 도달하는 데 3.5시간이 걸렸다. 배양액의 MAO 함량은 시간이 지남에 따라 큰 변화가 없었으나 COX와 MDH의 함량은 시간이 지남에 따라 점차 증가하여 정점에 이르렀다가 점차 감소하였다. 따라서 세포에서 방출되는 완전한 미토콘드리아 내용물은 분열 피크에 도달하는 데 약 3.5시간이 소요되었습니다.

AA 그룹의 COX 및 MDH 피크는 각각 1.5시간, 1.375U/, 36.732U/l에서 나타났습니다. 처리군의 COX 및 MDH 피크는 각각 5.5시간, 6.5시간, 1.341U/l, 33.994U/에서 나타났다. 각 시점에서 두 세트의 데이터가 통계 분석에 사용되었습니다. 1.5시간에 AA 그룹의 COX 및 MDH 수준은 처리 그룹보다 유의하게 더 높았습니다(P < 0.{18}}5).="" 따라서="" 혈청의="" 완전한="" 미토콘드리아="" 절단은="" asp를="" 추가한="" 후="" 유의하게="" 지연되었으며(p="">< 0.05)="" 피크가="" 약간="" 감소했습니다(그림="">

논의

재생 불량성 빈혈(AA)은 말초 범혈구감소증 및 골수 저형성증을 특징으로 하는 골수 부전 증후군입니다. mtDNA의 돌연변이와 불안정성은 여러 질병에서 입증되었습니다. 미토콘드리아 기능 장애와 미토콘드리아 수의 감소는 mtDNA의 감소를 초래할 수 있습니다. 조혈 구획에서 mtDNA의 후천적 결실은 중증 범혈구감소증 및 망상적혈구감소증에서 발생하는 것으로 밝혀졌습니다[11]. 이전 연구[5]를 기반으로 ASP가 AA 마우스의 미토콘드리아 막을 안정화할 수 있는지 여부를 조사했습니다.

당귀 다당류-철 복합체(APIC)는 IDA에 대한 우수한 치료 효과뿐만 아니라 혈액 보충 및 혈액 순환 촉진에 탁월한 효과가 있습니다[12]. ASP는 IDA 쥐에서 헵시딘 발현을 하향 조절하는 세포외 십이지장마비(SMAD) 및 1신호 조절 키나제(ERK) 경로에 대한 어머니의 아들인 Janus-kinase(JAK)를 예방함으로써 헵시딘 과발현으로 유도된 질병의 치료에 유용할 수 있습니다[13 ]. Qin J는 ASP가 생체 내 쥐 OA 모델에서 연골 세포의 프로테오글리칸(PG) 합성을 개선하고 PG 합성에 관여하는 GT의 발현을 촉진하여 시험관 내에서 IL{6}}B 자극 연골 세포를 개선할 수 있음을 발견했습니다[14].

우리 연구에서 AA 마우스 모델은 아세틸 페닐히드라진, X선 및 시클로포스파미드의 조합에 의해 유도되었습니다. AA 마우스는 말초혈액 백혈구, Hb 및 혈소판에서 통계적으로 유의한 감소를 보였고(표 1), AA의 임상적 특징인 상완골 골수 세포 및 골수 수임 전구 세포에서 심각한 감소를 나타냈다. ASP로 처리된 AA 마우스는 AA 그룹과 비교하여 BM 세포에서 점진적인 증가를 보였다. 또한 조혈 세포의 미토콘드리아 수도 영향을 받았습니다. ASP는 AA 그룹에 비해 처리 그룹에서 훨씬 더 많은 수의 미토콘드리아를 생성했습니다(그림 1). 이러한 결과는 ASP가 AA 마우스에서 골수 유핵 세포 증식을 촉진하고 미토콘드리아 수를 증가시키며 미토콘드리아 막을 안정화시킬 수 있음을 보여주었습니다.

미토콘드리아 손상은 mtDNA 손상과 mtRNA 전사체 수준의 감소, 단백질 합성 및 미토콘드리아 기능에 의해 반영되며, 이는 세포 에너지 감소, 세포 신호 전달 중단, 세포 분화 및 세포자멸사 방해를 초래할 수 있습니다. 또한 미토콘드리아 ATP 생산이 부족하면 염색체 불안정성이 촉진될 수 있습니다[15]. mtDNA는 5개의 미토콘드리아 호흡 복합체 중 4개의 구성요소를 암호화하기 때문에 mtDNA의 변경은 미토콘드리아 질환을 유발합니다[16-18]. 미토콘드리아 질환 외에도 mtDNA의 돌연변이는 암, 당뇨병과 관련이 있습니다. 심혈관 질환. 신경퇴행성 질환, 백혈병과 같은 혈액학적 질환 및 정상적인 노화 과정[19]. 중요한 것은 mtDNA 돌연변이와 mtDNA 복제 수의 감소가 병원성일 수 있다는 것입니다[20, 21]. mtDNA 무결성 및 복제 수의 유지를 위한 세포 메커니즘을 이해하는 것은 AA와 같은 혈액 질환의 예방 및 치료를 목표로 하는 임상 개입의 대상을 제공할 수 있기 때문에 가장 중요합니다. 이러한 요인은 또한 에너지 대사를 감소시켜 조혈 줄기 세포의 자가 재생 및 분화에 영향을 미칠 수 있습니다.

본 연구의 결과는 ASP가 미토콘드리아 미세구조를 개선하고, 골수 부전을 치료하기 위해 막횡단 전위의 하향 조절 및 골수 요소의 세포자멸사를 억제할 수 있음을 보여줍니다.

씨스탄체 & 씨스탄체 추출물:베베핏 본즈

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