2부: 열처리 중 철의 존재 및 부재 시 아스코르브산, 5-카페오일퀸산 및 퀘르세틴-3-루티노사이드의 상호작용 및 항산화 활성에 대한 영향
Mar 15, 2022
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3. 토론
3.1.Ascorbic Acid,5-Caffeoylquinic Acid, Quercetin-3-Rutinoside의 구조-활성 관계
구조-활성 관계에 따라 다른 물질에 대해 측정된 AOA의 첫 번째 지표는 작용기의 수에서 비롯되었습니다. 세 가지 분석 물질 모두를 비교하면 아스코르브산이 가장 낮은 AOA를 보였고 5-카페오일퀸산이 그 뒤를 이었습니다.케르세틴{0}}루티노사이드최고 AOA에 도달했습니다. Csepregi et al. [14]는 이 세 가지 화합물의 AOA를 비교할 때 동일한 순서를 발견했습니다. 이 순위는 히드록시기의 총량으로 설명할 수 있습니다. 케르세틴{1}}루티노시드는 10개, 5-카페오일퀴닉산은 5개,아스코르브 산4개가 있습니다. 을 위한플라보노이드, 하이드록시 그룹의 총량과 AOA의 메커니즘에 미치는 영향은 이전에 Burda와 Oleszek[15]에 의해 보여졌습니다. 히드록시기는 디케톤으로 쉽게 산화될 수 있기 때문에 엔디올 구조에서 특히 중요합니다[8]. 분석된 물질에서 엔디올 구조는 또한 금속 이온과 착물을 형성하는 능력에 중요합니다[16-18]. 엔디올 구조는 페닐 고리의 케르세틴-3-루티노사이드 및 5-카페오일퀸산 분자에서 발생하며, 이는 이러한 화합물의 더 강한 AOA에도 영향을 미칠 수 있습니다. 추가 연구에 따르면 AOA는 다른 분자 구조의 영향도 받을 수 있습니다. 페놀산은 카복실산 그룹의 영향을 받을 수 있습니다. 예를 들어 하이드록시페닐 아세트산(R-CH{6}}CH-COOH)은 하이드록시신남산(R-CH,-COOH)에 비해 전자를 끄는 그룹이 더 약합니다. 5-caffeoylquinic acid[19]의 caffeic acid로. 플라보노이드에서 아글리콘은 해당 배당체보다 AOA가 더 높았습니다[20,21]. 케르세틴{15}}루티노사이드, 배당체, 아글리콘의 AOA케르세틴결과적으로 더 높다[14]. AOA에 영향을 줄 수 있는 다양한 기능 그룹이 있으므로 결과적으로 단일 전자 전달(SET), 수소 원자 전달(HAT) 및 순차 양성자 손실 전자와 같은 다양한 메커니즘을 가진 다양한 테스트 분석을 사용하는 것이 중요합니다. 감지를 위한 전송(SPLET). 각 메커니즘과 사용된 분석 시약은 생리 활성 화합물의 다른 구조를 감지할 수 있습니다[22].
3.2.광물철이 없을 때의 항산화 활성에 대한 열처리 및 구조적으로 다른 항산화제의 상호작용의 영향
40분의 연장된 열처리 시간에 걸친 안정적인 AOA는 열 분해가 처음에 가정된 것보다 덜 중요함을 나타냅니다. 또한 HPLC 데이터에 따르면 순수한 5-카페오일퀸산과 퀘르세틴{2}}루티노사이드는 안정적이며 열처리 과정에서 최대 분해율이 20%입니다. 이전 연구에서는 물의 정상 끓는점까지{4}}카페오일퀸산의 안정성을 입증했으며[23], Dawidowicz와 Typek[24]는 5시간 동안 5-카페오일퀸산을 가열한 후 9개의 유도체 화합물을 발견했습니다. 환류. 아스코르빈산 농도의 경우 40분 조리 후 분해가 확인되었습니다. 수용액에서 철 없이 아스코르브산 분해를 일으키는 영향 요인은 pH 값, 빛 노출, 산화, 온도 및 다양한 농도일 수 있습니다[25,26]. 이 연구에서 온도와 농도 요인이 가장 중요한 역할을 했을 것입니다. 마이크로튜브의 최소 가스 공간으로 인해 산화 과정이 최소로 감소했기 때문입니다. 나머지 기체상은 호기성 조건에서 분해하기에 충분할 수 있습니다. 조건이 다르면 제품이 달라지므로[27,28], 이 연구에서는 40분의 조리 후 두 조건의 제품을 모두 찾을 수 있었습니다. Yuan과 Chen[28]은 푸르푸랄, 2-퓨로산, 3-하이드록시{18}}피론 및 미지의 물질이 pH 값에 따라 수용액에서 아스코르브산의 주요 분해 산물이라고 보고했습니다. . Shinoda et al. [29,30] 오렌지 주스에서 푸르푸랄, 2-푸로산, 5-하이드록시말톨, 3-하이드록시{24}}피론 및 5-(하이드록시메틸 )푸르푸랄. Hsu et al. [31] 에탄올 용액에서 아스코르브산을 분석하고 2-퓨로산과 3-하이드록시{29}}피론을 검출했습니다. 호기성 또는 혐기성 조건에 따라 검출된 아스코르브산 유도체(피크 3 및 4)는 푸르푸랄, 2-푸로산 또는 3-하이드록시{34}}피론 또는 중간체일 수 있습니다. ascorbic acid는 용량-반응 관계에서 감소하였고, ascorbic acid의 농도가 높을수록 조리 중 분해율이 낮아졌다. 아스코르브산은 수소 결합과 반 데 발스 에너지로 인해 더 높은 농도에서 스스로 안정화되는 것으로 보입니다[32].
이원 및 삼원 혼합물에서 주로 AOA에 대한 추가 효과가 발견되었습니다. 이원 혼합물에서 AOA가 더 높은 물질의 농도가 증가하면 조합의 AOA도 증가했습니다. 다른 연구에서는 아스코르브산(50-200 mg/L)[33]과 (+)-카테킨(200 um) 사이, 그리고 서로 다른 모노테르펜의 이원 혼합물[34] 사이에 부가 효과가 있음을 발견했습니다. DPPH 분석에서만 길항 효과가 5-퀘르세틴{6}}루티노사이드와 결합된 카페오일퀸산과 2배의 케르세틴-3-루티노사이드 농도를 가진 3원 혼합물에서 발견되었습니다. 이것은 공간에서 분자, 특히 케르세틴{8}}루티노사이드가 상당히 큰 분자인 방향과 DPPH 라디칼 분자의 입체적 접근성으로 인해 발생할 수 있습니다[35]. TPC 분석에서 아스코르브산과 {{10}caffeoylquinic acid의 조합은 1:2 비율에서 강력한 길항 효과를 낸 반면, 2:1 비율로 역혼합하면 강력한 상승 효과를 나타내어 각각의 AOA. 이중 농도의 아스코르브산은 이 실험에서 5-카페오일퀸산에 의해 입증된 바와 같이 자가 안정화에 이어 다른 분자의 안정화로 인해 이러한 조건에서 AOA를 추가로 향상시킬 수 있습니다. 석류-천도 복숭아 주스에서는 천연 페놀과 아스코르빈산 사이에서 동일한 상호 작용이 발견된 반면, 포도 주스에서는 아스코르빈산 농도를 증가시켜 길항 효과가 증가하는 것으로 관찰되었습니다[36]. 이러한 결과는 아스코르브산, 5-카페오일퀴닉, 퀘르세틴{20}}루티노사이드의 혼합물이 가장 강력한 AOA 잠재력을 달성한다는 것을 시사합니다.항산화제풍부하게 구비되어 있습니다.
3.3. 미네랄 철분의 영향
The addition of iron to the samples had the most influence on changes in their AOA. Contrary to the hypothesis, based on the pro-oxidative activity of iron, the AOA increased, compared to the same substance or substance mixture without iron. Iron may act like a catalyst itself or forms metal chelates, which are effective catalysts. The changed stoichiometry of the chelates can form additional radical-scavenging metal centers [18], which explains the increased AOA. Further tests showed that reduced ferrous iron (50-100%,v/o)itself interacts with the TEAC(0.266-0.538 mol TE/mol iron), DPPH(0.210-0.495 mol TE/mol iron), and TPC(16.65-31.82g GAE/mol iron) assay reagents, while oxidized ferric iron does not (data not shown). In the presence of iron, 5-caffeoylquinic acid had the highest AOA, followed by quercetin-3-rutinoside and ascorbic acid in TEAC and DPPH assays. This may be due to the changed stoichiometry by metal chelation. The AOA ranking detected by the TPCassay stayed the same, as in the absence of iron: quercetin-3-rutinoside >5-caffeoylquinic acid>아스코르브 산. 그러나 혼합물에 철을 첨가하면 TEAC 및 DPPH 분석 결과에 영향을 미치는 반면 TPC 분석은 크게 영향을 받지 않습니다. 이러한 이유로 철분이 풍부한 샘플로 작업할 때 다른 작동 메커니즘으로 다른 테스트 분석을 사용하는 것이 중요합니다.
DPPH 분석에서만 순수한 케르세틴{0}}루티노사이드의 AOA와 아스코르브산과 함께 2배의 케르세틴{2}}루티노사이드 농도를 갖는 등몰 또는 비등몰의 AOA는 철이 존재할 때 더 낮은 값을 보였습니다. Boligon et al. [351] DPPH 분석은 이러한 라디칼의 입체적 접근성으로 인해 더 작은 항산화제를 더 잘 감지한다고 설명했습니다. 아마도 두 개의 결합면이 있는 케르세틴-3-루티노사이드는 철과 상당히 큰 복합체를 형성할 수 있으므로 분석에 접근할 수 없습니다. Kejic et al. [8], 이것은 금속 이온의 배위를 통한 초분자 착물의 형성으로 설명될 수 있다. 1:2 비율로 혼합 원자가 착물을 만들 수 있는 아스코르브산과 함께 [12], 아마도 이러한 더 큰 혼합 착물은 DPPH 라디칼과 상호 작용할 수 없습니다. 이 연구의 결과와 달리 다른 연구[18,37,38]에서는 DPPH 분석을 사용하여 케르세틴{13}}루티노사이드 복합체가 순수한 케르세틴{14}}루티노사이드보다 더 효과적인 항산화제임을 발견했습니다. 플라보노이드와 금속 이온의 킬레이트 착물은 착물 금속 이온의 라디칼 활성을 무효화할 수 있는 것으로 알려져 있습니다[39]. 유일한 차이점은 이 연구에서 Symonowics와 Kolandek의 연구에서 사용된 철(II) 염화물이나 황산염 대신에 암모늄 철(II) 황산염을 사용했다는 것입니다[39].
아스코르브산과 5-caffeoylquinic acid는 2:1 비율로 존재하는 경우 시너지 효과를, 1:2 비율에서는 길항 효과가 있는 것으로 나타났습니다. 5-caffeoylquinic acid와 철의 조합은 생체 내에서 권장되지 않습니다[6]. 그러나 이 연구는 시험관 내에서 5-카페오일퀸산에 비해 아스코르브산의 2배 양이 AOA에 시너지 효과를 줄 수 있음을 보여주었습니다. 비율에 대한 추가 조사는 생체 내에서도 긍정적인 효과를 얻을 수 있는지 여부를 보여줄 수 있습니다.
HPLC 데이터에 따르면 0분 조리된 샘플에서 아스코르브산 농도만 감소하기 때문에 샘플에 철을 추가하면 촉매 활성에 최소한의 영향을 미칩니다. 조리된 아스코르빈산 샘플에서는 철이 없는 샘플과 달리 아스코르빈산 농도가 높을수록 분해율이 높아집니다.{1}}카페오블퀸산과 케르세틴{2}}루티노사이드는 온도와 시간뿐만 아니라 추가적인 요소가 필요합니다. 철의 촉매 활성이 작동하기 위한 혼합물의 상호 작용. 케르세틴{3}}루티노사이드는 철이 존재할 때 열처리 후 아스코르브산과 이원 혼합물에서만 감소했습니다. 이는 플라보노이드가 1차 항산화제로 작용한 다음 생성된 화합물 라디칼이 아스코르브산과 반응하여 원래 화합물을 재생한다는 사실 때문일 수 있습니다[18]. 5-카페오일퀸산은 케르세틴{6}}루티노사이드를 보호하는 반면 아스코르브산은 케르세틴{7}}루티노사이드를 보호할 수 없기 때문에 특별한 것 같습니다. 따라서 5-caffeoylquinic acid는 철 및 열처리와 함께 시스템을 안정화시키는 핵심 분자일 수 있습니다. 5-카페오일퀸산이 안정화 분자라는 이 가설은 삼원 혼합물에서 더 확인되었습니다. 여기에서 케르세틴{10}루티노사이드는 항상 {{11}카페오일퀸산에 의해 안정화되어 아스코르브산이 있어도 케르세틴{12}루티노사이드 농도의 감소가 관찰되지 않았습니다. 다른 연구에서 5-카페오일퀸산은 공동 착색 메커니즘을 통해 안토시아닌의 분해에 대한 보호 특성을 보여주었습니다[40]. AOA가 더 높을 수 있는 새로운 분해 산물은 철이 있는 상태에서 세 가지 물질 모두에서 나타났습니다. 카페인산(피크 6)은 5-카페오일퀸산 분해 산물로 확인되었습니다(데이터는 표시되지 않음). 이것은 다른 물질이 quinic acid이거나 Dawidowicz와 Typek[24]에 의해 기술된 9가지 가능한 유도체 중 하나일 수 있다는 가정으로 이어졌습니다. quinic acid;(1S,3R,4R,5R)-5-[{ }}(3,{26}}디히드록시페닐)-2-히드록시프로파노일]{28}},4,{30}}트리히드록시-시클로헥산 카르복실산;(1S3R,4R,5R)-5- [3-(3,4-디히드록시페닐)-3-히드록시프로파노일]{41}},4,5 트리히드록시시클로헥스-안카르복실산; 트랜스 3-O-카페오일퀸산; 트랜스 5-O-카페오일퀸산; 트랜스 4-O-카페오일퀸산; 카페인산; 시스{51}}O-카페오일퀸산;4,{54}}디카페오일퀸산. 케르세틴{55}}루티노사이드의 경우 분해 산물이 크로마토그램에 나타나 식별할 수 없습니다.
3.4. 제2철(Fe3 플러스 ) 및 철철(Fe2 플러스 )로 킬레이트를 형성하는 능력
아스코르브산을 함유한 모든 시료에서 제2철은 제1철로 환원되었다. 이 과정에서,아스코르브 산제2철에서 전자를 취하여 제1철로 환원하여 그 자체로 라디칼이 된다. 불안정한 라디칼은 빠르게 dehydroascorbic acid와 분해 생성물로 전환됩니다[12]. 과산화수소가 없기 때문에 펜톤 회로를 통해 제2철로 다시 반응하는 것은 불가능합니다. 0분 조리된 이성분 혼합물에서 아스코르브산이 있는 상태에서 20% 이상의 철이 결합되었습니다. 아스코르브산은 3-OH 및 2- 수소 치환 후 3-O 및 2-O 핵을 통한 킬레이트화에 의해 철 종 및 기타 금속 이온과 착물을 형성하는 것으로 알려져 있습니다. OH기[16,17,41. 또한 혼합 원자가 철-아스코르브산염 착물을 형성할 수 있습니다[42]. 그러나 아스코르브산은 약한 킬레이트제이며 조리 후 아스코르브산이 존재할 때 순수 및 혼합 샘플에서 결합된 철의 미량만이 검출되었습니다. 더욱이, 조리 과정으로 인해 아스코르브산은 분해 산물로 분해되어 철과 킬레이트화되지 않는 것으로 보입니다.
5-카페오일퀸산은 상대적으로 열악한 환원제입니다. Ferric iron은 5-caffeoylquinic acid에 의해 환원되었으며 장기간 조리하면 환원이 증가했습니다.{2}}Caffeoylquinic acid는 리간드에서 금속 전하 이동[17]으로 ferric iron과 킬레이트됩니다.5-Caffeoylquinic acid 카페인산의 3,4 엔디올 구조에서 하나의 가능한 결합면을 가지고 있습니다. 이것은 왜 카페인산이 5-카페오일퀸산의 생리활성 부분인 반면 퀴닉산은 AOA가 거의 없는지에 대한 지표가 될 수 있습니다[43]. 엔디올은 1:1 비율로 철 착물[41]의 형성으로 인해 OH 형성을 억제했습니다[44,45]. Lamy et al.[46]은 5-caffeoylquinic acid가 단량체 복합체를 형성하는 반면 Kiss et al. [47] 올리고머 종을 발견했습니다. 이전 연구[17,48]와 달리, 열처리 전 및 후처리 과정에서 5-caffeoylquinic acid가 있을 때 결합된 철의 미량만 발견되었습니다. 이것은 이 연구의 중성 pH 조건에 의해 설명될 수 있지만 다른 연구는 인간 위장의 1-2.5에서 pH 값을 기반으로 산성 매질에서 작업했습니다[48]. 몇 시간 후 보관된 샘플에서 검은색 침전물이 발견되었으며 이는 5-카페오일릭퀸산-제2철 복합체의 지표입니다. 최근에는 혼합 시료를 분석에 사용하여 중성 pH에서 이러한 복합체를 형성하는 데 더 오랜 시간이 필요합니다. 카페인산을 함유한 철 착물은 소거 활성을 거의 나타내지 않았다[49]. 게다가, quinic acid와 ferric iron 사이의 반응에 대한 분광광도학적 증거가 없다[48]. 5-카페오일퀸산과 달리 케르세틴{30}}루티노사이드 샘플에서는 열처리 후에도 결합된 철이 발견되었습니다.
케르세틴{0}}루티노사이드는 조리 시간을 연장하여 최소한의 증가로 제2철을 제1철로 환원합니다. 케르세틴{1}}루티노사이드의 이러한 적당한 환원 활성은 이전에 Mira et al. [50]. quercetin{3}}rutinoside의 철 환원 활성은 3-rutinoside, 5,7,3',4'-OH[50]에서 검출되었습니다. 제2철과의 적당한 상호작용은 -OH기의 수가 적어서 킬레이트화 측에서 음전하 밀도가 낮아진 것으로 설명할 수 있습니다[50]. 플라보노이드는 (i) 5-히드록시와 4-카르보닐 기 사이, (ii) 3-히드록시와 4-카르보닐 기 사이, 및 (ii) 브링[39]에서 3',A'-히드록시기 사이. 케르세틴{20}}루티노사이드는 결합면 (i) 및 (i)[9]를 사용하며, 3-하이드록시 그룹에 루티노사이드가 부착됩니다. 스펙트럼 데이터는 금속 이온이 3', A'-하이드록시 그룹에만 결합된다는 것을 보여주기도 했습니다[18]. 킬레이트는 2가 형태의 철과 함께 더 효과적입니다[50]. 이원 혼합물에서 케르세틴{27}}루티노사이드는 삼원 혼합물에서와 달리 아스코르브산이 존재할 때 복합체를 형성할 수 없습니다. 5-카페오일퀸산이 있으면 소량의 결합된 철이 발견됩니다. 이는 5-카페오일퀴닉이 아스코르브산이 있을 때 케르세틴{30}}루티노사이드 분자를 보호하므로 케르세틴{31}}루티노사이드가 철과 복합체를 형성할 수 있음을 나타냅니다.
4. 재료 및 방법
4.1.화학물질
ABTS(2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt)(≥98%)was obtained from Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany), DPPH*(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) radical (95%) and Trolox(97%)were obtained from Thermo Fisher (Kandel, Germany). Folin-Ciocalteu phenol reagent was purchased from Merck(Darmstadt, Germany). HPLC grade methanol, acetonitrile(HPLC grade), glacial acetic acid (100%, p.a.), sodium acetate trihydrate (≥99.5% p.a.), potassium thiocyanate (≥98.5%, p.a., ACS),2,2'-dipyridyl (≥95%), hydrochloric acid (≥25%, p.a., ISO), gallic acid monohydrate (≥99%), potassium persulfate (≥99%), rutin trihydrate (working standard), chlorogenic acid (working standard), L-(+)-ascorbic acid (working standard), sodium carbonate(>99%), 황산 제2철 암모늄 12수화물 및 황산 제1철 암모늄 6수화물은 Carl Roth(Karlsruhe, Germany)에서 구입했습니다.
4.2.샘플
ascorbic acid, {{0}}caffeoylquinic acid 및 quercetin{1}}rutinoside의 수용액 및 혼합물은 다른 비율의 순수한 용액 및 혼합물로 준비되었습니다. 가능한 모든 이원 혼합물은 등몰비로 만들어졌고, 한 화합물의 비등몰비는 두 배가 되었습니다. 삼원 혼합물은 또한 각각 2배가 된 1개 또는 2개의 화합물을 사용하여 등몰비 및 비등몰비로 제조하였다. 항산화제의 최종 농도는 각 테스트 용액에 대해 0.3mM이었습니다. 또한 혼합물당 총 0.3mM 철({{1{12}}}}.15mM 제1철 및 0.15mM 제2철)을 첨가한 후 모든 실험을 반복했습니다. 항산화제와 철분의 선택된 양은 생리학적 또는 식품 수준을 기반으로 하지 않고 분자 상호작용의 효과를 연구하기 위해 몰 질량을 기반으로 합니다. 결과적으로, 총 항산화제와 철 사이의 등몰비가 확립되었습니다. 모든 혼합물을 끓는 물에서 0, 10, 20, 40분 동안 조리한 후 얼음 위에서 식혀 가열 과정을 중단하였다. 이것은 3개의 독립적인 복제에 대해 수행되었습니다.
4.3.광도 측정
항산화제(순수 또는 혼합) 웰 플레이트(SynergyTM HTX Multi-Mode Microplate Reader, BioTek Instruments, Winooski, VT, USA). 단일 전자 전달(SET) 및 수소 원자 전달(HAT)과 같은 반응 메커니즘이 다르기 때문에 다른 테스트 분석이 사용되었습니다. TEAC 및 TPC 분석은 SET[17,18]를 기반으로 하지만 DPPH 테스트 분석의 경우 SET, HAT 또는 이 두 메커니즘의 조합에 기반한 것인지 문헌이 명확하지 않습니다[{{6} }]. Foti[51]의 최근 연구에 따르면 페놀은 두 메커니즘의 조합인 SPLET(순차 양성자 손실 전자 전달)를 통해 DPPH와 반응할 수 있습니다. 중간 극성 및 이온화 전위와 같은 요인이 주요 메커니즘에 영향을 미칩니다.
4.3.1. 총 페놀 함량(TPC)
총 페놀 함량(TPC)은 Bobo-Garcia et al.[52]에 의해 이전에 기술된 96-웰 플레이트에서 Folin-Ciocalteu 방법을 사용하여 결정되었습니다. 약간의 수정으로.
Briefly, 10 μL Folin-Ciocalteu reagents were mixed with a 50 μL sample, and afterward 100 μL Na, CO3 was added. The 96-well plate was incubated at 37 °C（±0.2°C） and with constant orbital shaking at a moderate speed (237 CPM, 4 mm) for 14 min. After a 1 min resting period, the absorbance was measured at 736 nm. Results were expressed as gallic acid equivalents (mg GAE/ mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 5.97 to 59.7 ug gallic acid/mL(R~>0.99). Folin-Ciocalteu 시약은 비타민 및 미네랄과 같은 비페놀계 물질에도 반응하기 때문에 이 테스트의 일반적인 이름은 오해의 소지가 있습니다[22]. 생리 활성 화합물의 "총 환원 활성"을 더 잘 설명합니다.
4.3.2. Trolox 등가 항산화 용량(TEAC)
항산화 활성은 약간의 변형이 있는 96-웰 플레이트에서 TEAC 분석을 사용하여 결정되었습니다. 9.6 mg ABTS 및 25 mL까지 H2O로 채워진 1.66 mg 과황산칼륨을 포함하는 스톡 용액을 준비하고 12-16시간 동안 실온에서 암실에서 인큐베이션했습니다. 이 스톡 용액으로부터 100% MeOH로 25mL까지 채워진 5mL 스톡 용액을 포함하는 TEAC 작업 용액을 준비했습니다.
Briefly, 10 μL of the sample was mixed with 150 μL of the TEAC working solution. After a 5 min incubation, the plate was shaken orbitally at a moderate speed for 1 min, followed by a 1 min resting period. The absorbance was measured at a wavelength of 734 nm. The TEAC was expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R->0.98).
4.3.3. DPPH*라디칼 스캐빈징
그만큼항산화제activity was determined using the modified DPPHmethod for 96-well plates. A DPPHworking solution with 7.88 mg DPPH filled up to 100 mL was prepared. Briefly, 20 μL of the sample was mixed with 180 ul of the DPPH working solution and incubated in the dark for 28 min at room temperature. After 1 min orbital shaking at a moderate speed and a 1 min resting time, the absorbance was measured at a wavelength of 515 nm. Results were expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R2>0.98).
4.4. 시너지와 길항
항산화 활성의 상승 및 길항 효과 분석을 위해 실험적으로 얻은 결과를 해당 농도에서 개별 성분의 효과의 합으로 계산한 이론값과 비교하였다[53]. 상승작용은 결합된 작용이 개별적으로 작용하는 각각의 합보다 크도록 두 개 이상의 물질의 상호 작용을 설명합니다. 이에 반해 길항작용은 두 가지 이상의 물질이 결합하여 상호작용을 할 때 각각의 효과를 합한 것보다 전체적인 효과가 작은 현상이다.
4.5.이온성 철의 결정
The colorimetric determination of ferrous and ferric iron was modified according to Niedzielski et al. 【54】 for 96-well plates. Briefly, for ferrous iron detection, 20 μL acetate buffer(90 g sodium acetate trihydrate and 48 g acetic acid glacial filled up to 200 mL)and 20 μL 2,2'dipyridyl （0.5%, m/m） and, for ferric iron detection, 20 μL hydrochloric acid （2 M） and 20 μL potassium thiocyanate （5%, m/m）were pipetted into a 200 μL sample in the 96-well plate, incubated there for 10 min at room temperature, and the absorbance was measured for ferrous iron at520nm and for ferric iron at 470nm. Results were expressed in mM ionic iron/mM total iron, using a standard curve ranging for ferrous iron from 0.024-0.214mM(R'>0.99) and for ferric iron from0.005-0.178 mM(R->0.99). 철철과 제2철의 합인 총 철과 이온 철의 차이가 결합 철입니다.
4.6.HPLC-DAD
광도 측정에 사용된 동일한 추출물에서 항산화제인 아스코르브산, 5-카페오일퀸산, 케르세틴{1}}루티노사이드 및 이의 분해 생성물을 정량화하기 위해
measurements, a Shimadzu Prominence 20 high-performance liquid chromatography (HPLC) system equipped with a refrigerated SIL-20AC HT autosampler, CTO-10AS VP column oven, DGU-20A5 degasser, LC-20 AT liquid chromatograph quaternary pump, and an SPD-M20A diode array detector (DAD) was used. As a column for separation, a Supelco Ascentis⑧Express an F5 column (150× 3.0 mm, 5 um)equipped with a Supelco Guard column （5×3.0 mm, 5 μm） and a 0.2 micron SST Frit for UltraLite was used. The column temperature was set to 30°C. UV detection was at 245 nm for ascorbic acid, 320 nm for 5-caffeoylquinic, and 360 nm for quercetin-3-rutinoside. The mobile phase consisted of Eluent A (1% acetic acid (v/o), pH 2.5) and Eluent B(100% ACN). The separation was achieved using the following gradient program: 0-2.5 min.5% B:2.5-15 min.5-20%B:15-20 min,20%B;20-22.5 min, 20-5%B;22.5-30 min,5%B.The flow rate was 0.3 mL/min, and the sample injection volume was 30 μL. Standard calibration curves for the three substances 5-caffeoylquinic （0.5-0.15 μM; R2>0.99）, ascorbic acid （0.35-0.025 uM; R2>0.99）, and quercetin-3-rutinoside（0.35-0.025 μM; R2>0.99)가 준비되었습니다. 파생 화합물은 열처리 전 및 열처리 후 철의 유무에 따라 순수 표준물질을 분석하여 잠정적으로 확인했습니다. 따라서 새 피크는 삽입 표준에서 파생되어야 합니다. 또한, 선택된 혼합물을 HPLC-MS를 통해 측정하여 제안된 구조를 확인했습니다.
4.7. 통계 분석
Microsoft Excel 2016(Microsoft, Redmond, USA) 및 R Statistics(버전 3.6.3, Hold-ing the Windsock, 2020)는 생물통계학적 테스트와 데이터 결과 제시 및 작성에 사용되었습니다. 치료 평가 및 연결을 위한 추론 통계는 3원 분산 분석(ANOVA), 사후 Tukey의 HSD 검정 및 Pearson 상관 관계를 사용하여 수행되었습니다. 사용된 R 패키지는 ggplot2[55], means[56] 및 multcomp[57]입니다.
5. 결론
위의 연구 결과에 따르면 아스코르브산, 5-카페오일퀸산, 케르세틴{2}}루티노사이드의 AOA는 분자 구조, 농도, 비율, 다른 항산화제 및 철과의 상호작용에 의해 영향을 받았습니다. 상호작용은 특히 아스코르브산과 5-카페오일퀸산을 결합할 때 AOA에서 역할을 하는 것으로 보입니다. 여기에서 시너지 효과와 길항 효과가 감지되었습니다. 온도는 AOA에 최소한의 영향을 미치는 반면, 동시에 온도는 특정 혼합물, 특히 철이 있는 경우 모든 항산화제의 안정성에 영향을 미칩니다. 조리 시간이 길어질수록 철이 없을 때 아스코르빈산 농도만 감소했고 5-카페오일퀴닉산 농도는 철이 있을 때만 감소한 반면 케르세틴-3-루티노사이드 농도는 아스코르빈산과 결합했을 때만 감소했습니다. 철의 존재. 철과 함께 5-caffeoylquinic acid는 열 처리에 의해 농도가 감소하는 다른 분자를 보호할 수 있습니다.
식물에서 아스코르브산, 5-카페오일퀸산, 케르세틴{1}}루티노사이드의 조합은 가능할 뿐만 아니라 일반적입니다. 따라서 이러한 결과는 야채를 조리하는 동안 발생하는 과정에 대한 기본 지식을 제공합니다. 식품 매트릭스는 더 복잡하고 반응 조건을 변경하거나 반응 자체가 되는 효소, 기타 미네랄 또는 산을 비롯한 수많은 생리 활성 화합물을 포함합니다. 이러한 복잡한 상호 작용은 이 연구의 범위를 훨씬 넘어서며 유익한 농도와 상호 작용은항산화제요리된 야채에서 미래에 해결되어야 합니다.
참고문헌
1. 멜러, DD; Naumovski, N. 당뇨병에서 코코아의 효과: 주요 표적 기관으로서 췌장과 간의 잠재력, 항산화 효과 이상? 국제 J. 식품 과학. 기술. 2016, 51, 829–841. [교차 참조]
2. Crozier, A.; 자가나트, IB; Clifford, MN 페놀, 폴리페놀 및 탄닌: 개요. 식물 내 이차 대사 산물: 인간 식단에서 발생, 구조 및 역할; Crozier, A., Clifford, MN, Ashihara, H., Eds.; Blackwell Publishing: Hoboken, NJ, USA, 2006년; 1~24쪽. ISBN 1-4051-2509-8.
3. Miller, D. "자동산화" 반응의 촉매로서의 전이 금속. 자유 라디칼. 바이올. 메드. 1990, 8, 95–108. [교차 참조]
4. Buchner, N.; Krumbein, A.; Rohn, S.; Kroh, 플라보놀 루틴 및 케르세틴에 대한 열처리의 LW 효과. 래피드커뮤니케이션. 질량 스펙트럼. 2006, 20, 3229–3235. [교차 참조]
5. Layrisse, M.; 가르시아-카살, 미네소타; 솔라노, 엘.; 매사추세츠주 바론; 아르구엘로, F.; Llovera, D.; 라미레즈, J.; 리츠, 나.; Tropper, E. 철 비스-글리신 킬레이트, 피테이트 및 폴리페놀이 풍부한 아침 식사에서 인간의 철 생체 이용률. J. Nutr. 2000, 130, 2195-2199. [교차 참조] [PubMed]
6. 허렐, RF; 레디, 엠.; Cook, JD 폴리페놀 함유 음료에 의한 인간의 비헴 철 흡수 억제. 브르. J. Nutr. 1999, 81, 289–295. [교차 참조] [PubMed]
7. 버지니아주 코스윰 Potapovich, 실리카에 의한 세포 손상에 대한 플라보노이드 보호의 AI 항라디칼 및 킬레이트 효과. 아치. 바이오켐. 생물 물리학. 1998, 355, 43–48. [교차 참조] [PubMed]
8. Kejík, Z.; Kaplanek, R.; Masaˇrík, M.; Babula, P.; Matkowski, A.; Filipensky, P.; Veselá, K.; Gburek, J.; 시코라, D.; Martásek, P.; et al. 플라보노이드-항산화 능력 및 그 이상의 철 복합체. 국제 J. 몰. 과학. 2021, 22, 646. [교차참조]
9. Latos-Brozio, M.; Masek, A. 다양한 중합 방법으로 얻은 단량체 및 중합체 폴리페놀(케르세틴, 루틴 및 카테킨)의 구조-활성 관계 분석. 화학 생물다이버. 2019, 16, e1900426. [교차 참조] [PubMed]
10. Gullón, B.; 루차우, TA; 모레이라, MT; 레마, JM; Eibes, G. Rutin: 추출, 식별 및 정제 방법, 생물학적 활성 및 생체 이용률 향상을 위한 접근에 대한 검토. 트렌드 식품 과학. 기술. 2017, 67, 220–235. [교차 참조]
