식물성 식단은 비만과 같은 만성 질환 발병 위험을 낮추는 것과 관련이 있습니다.
Oct 11, 2022
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추상적인:시금치 메탄올 추출물(SME)은 당뇨병이 진행되는 동안 증가하는 최종 당화 생성물(AGEs)의 형성을 억제하므로 SME가 당뇨병성 망막에 유익한 영향을 미치는지 아는 것이 중요합니다. 이 연구에서 시험관 내 분석은 SME가 환원당 또는 메틸글리옥살을 배양한 소 혈청 알부민에서 당화, 카르보닐기 형성 및 환원된 티올기 고갈을 억제한다는 것을 보여주었습니다. 스트렙토조토신으로 유도된 당뇨병 쥐(STZ2)의 망막에서 SME 효과는 정상 혈당 그룹인 STZ, SME로 처리된 STZ 쥐 및 아미노구아니딘으로 처리된 STZ 쥐(항-AGEs 참조)에서도 연구되었습니다(n=10). 그룹) 12주 동안. 망막을 절단하고 Ne-카르복시메틸 라이신(CML), 수용체 RAGE, NADPH-Nox4, 유도성 산화질소 합성효소(iNOS),{9}}니트로티로신(NT), 핵 NF-kB, 혈관 내피 성장 인자( VEGF), glial fibrillary acidic protein(GFAP), S100B 단백질 및 TUNEL 분석. 지질 과산화는 말론디알데히드(MDA) 수준에 의해 전체 망막에서 결정되었습니다. 그 결과 당뇨병성 망막에서 SME는 CML-RAGE co-localization, 산화 스트레스(NOX4,iNOS,NT,MDA), 염증(NF-B,VEGF,S10B, GFAP) 및 세포자멸사(p)를 감소시키는 것으로 나타났습니다.<0.05).therefore, smes="" could="" attenuate="" retinal="" degeneration="" by="" inhibiting="" cml-rage="">
키워드:시금치; 당뇨병성 망막병증; 고급 당화 최종 생성물; 산화 스트레스; 염증; 격노; 카르복시메틸 L-라이신
1. 소개
식물성 식단은 비만, 제2형 당뇨병 및 관상동맥 심장병과 같은 만성 질환 발병 위험을 낮추는 것과 관련이 있습니다. 시금치(Spinacia oleracea L.)는 상당한 양의 섬유질, 비타민 및 미네랄을 제공하기 때문에 전 세계적으로 소비되는 식용 잎 채소입니다[1,2]. 엽록소, 카로티노이드(루테인 및 제아잔틴)[3], 페놀 화합물(플라본, 플라보노이드, 쿠마린)[4-8](보충 1 참조)을 포함한 여러 식물화학물질이 확인되었습니다. 시금치와 그 틸라코이드를 식품으로 섭취하거나 수용성 추출물 또는 동결건조 형태로 섭취하면 항암, 항비만, 혈당강하 효과가 있다고 보고된 바 있다[9]. 시금치의 항염증 효과는 동물 내독소혈증 모델, 비만 동물 및 건강한 인간에서 입증되었습니다[9]. 그 항산화 효과는 인간 전립선 암종 세포, 비만 동물 모델, UV 조사 마우스 및 형질전환 마우스 전립선의 선암종에서 연구되었다[9,10]. 시금치 메탄올 추출물(SME)의 항당화 및 항염증 효과는 각각 zebrafish의 포도당 유도 당뇨병 모델과 쥐의 isoproterenol 유도 심근 괴사 모델에서 연구되었습니다[11,12]. SME는 수정체 안구에서 알도스 환원효소 활성을 감소시켜 당화 단백질 수준을 포함한 글리코실화 헤모글로빈 및 프럭토사민 수준을 감소시켰습니다[11]. 위의 결과는 중소기업이 당뇨병성 망막병증(DR)과 같은 당뇨병 합병증의 진행에 예방 효과가 있을 수 있음을 시사합니다.
DR은 염증, 산화 스트레스 및 최종 당화 생성물(AGE) 축적과 관련된 시력 상실 또는 실명을 점진적으로 초래합니다[13,14]. AGE는 단백질 가교를 유도하여 구조/기능 및 이의 회전율/제거를 변경합니다. AGE는 포도당과 단백질의 유리 아미노 그룹 사이의 비효소 반응에 의해 생성되어 Schiff's 염기 및 Amadori 제품(프럭토사민)과 같은 가역적 중간체를 형성합니다[15]. AGE 형성을 위한 다른 메커니즘에는 "카르보닐 스트레스" 경로가 포함됩니다. 여기서 당과 지질의 산화는 글리옥살 및 메틸글리옥살(MGO)과 같은 디카르보닐 중간체 화합물을 생성하여 N:-카르복시메틸 라이신(CML)으로 AGE를 형성합니다. 16]. 혈청 및 유리체에서 증가된 CML 수준은 DR의 출현 및 진행 모두에 대한 생화학적 마커가 될 수 있습니다[17,18]. 망막에서 AGEs(AGEs-RAGE)에 의한 수용체 RAGE의 활성화는 활성화된 B의 핵인자 kappa-light-chain-enhancer에 의해 조절되는 GFAP(glial fibrillary acidic protein) 및 전염증 인자의 과발현을 유도합니다 세포(NF-kB)[19]. NF-kB는 양성 피드백 메커니즘으로 작용하여 RAGE 발현을 양성적으로 조절합니다[20].시스탄체란 무엇인가한편, 칼슘 결합 단백질인 S100B의 고농도도 NF-kB를 활성화시켜 신경 염증 및 신경교 세포 활성화를 유도할 수 있습니다[21]. 성상교세포에서 S100B의 과발현은 망막 성상교세포증에 의해 나타나는 신경독성 효과를 유발합니다.
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망막 손상을 방지하기 위한 전략이 실험적으로 개발되었습니다. 다른 식물에서 분리된 시금치의 일부 파이토케미컬은 AGE 및 산화 스트레스의 억제와 관련이 있습니다[8,{1}}]. 루테인, 아스타잔틴 및 캠페롤은 항-AGE, 항산화 및 항-세포자멸사 특성을 통해 인간 유래 망막 색소 상피 세포(ARPE-19)를 손상으로부터 보호합니다[26-28]. 이러한 결과는 시금치의 파이토케미컬이 DR과 같은 망막 변성 예방에 중요한 역할을 함을 시사합니다. 또 다른 전략은 아미노구아니딘(AG)을 당화 및 iNOS 활성의 강력한 억제제로 사용하여 쥐에서 CML 축적 및 반응성 디카르보닐 전구체 형성을 약화시키는 것입니다[29]. 그러나 690명의 당뇨병 환자를 대상으로 한 다심 및 무작위배정 임상시험에서는 유익한 효과가 명확하게 확립되지 않았다[30].
고혈당 상태에서 망막 변성의 변화는 거의 연구되지 않았습니다. 따라서, SME가 스트렙토조토신으로 유도된 당뇨병 쥐의 망막에서 항-AGE, 항산화 및 항염증 특성과 관련된 손상으로부터 망막 층을 보호하는지 아는 것은 흥미롭습니다.
2. 재료 및 방법
2.1.시금치(SME) 메탄올 추출물의 제조
시금치(S.oleracea L.)의 신선한 잎은 가을-겨울철에 멕시코 푸에블라 주의 농경지에서 수확되었으며 국립 폴리테크닉 연구소(IPN, 멕시코시티, 멕시코). 바우처 표본 번호 4532는 IPN의 국립 생물 과학 학교 식물 표본실에 기탁되었습니다.
잎은 탈수되고 곱게 갈았다. 건조된 잎을 상온에서 메탄올로 침용하여 셀룰로오스 필터(Whatman, Maidstone, UK)로 여과하고 회전식 진공 증발기(BUCHI Rotavapor R{0}}, Switzerland)를 이용하여 45도에서 건조시켰다. 녹색 검(95.0g/kg 마른 잎)을 얻습니다.안티에이징 시스탄체SME는 사용할 때까지 4도의 암실에서 보관하였다. 모든 분석에서 추출물은 증류수에서 재구성되었습니다[11].
2.2.SME 항당화 활성의 시험관내 분석
2.2.1. 소 혈청 알부민(BSA-AGE)에서 파생된 고급 당화 최종 생성물의 형성
BSA-AGE 분석은 이전에 설명한 대로 수행되었습니다[31]. 간단히 말해서, 10 mg/mL BSA(fraction V; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 D-글루코스 0.5 M, D-과당 {{12 }}.5 M, 또는 메틸글리옥살 2.5 mM, 0.1 M PBS(pH 7.4) 및 0.02% 아지드화 나트륨 용액에서 제조됩니다. SME 농도(5, 10, 25, 50, 100 및 200 mg/mL)를 각 혼합물에 첨가한 다음 37도에서 4주 동안 인큐베이션했습니다. 이후 4도에서 이틀 동안 증류수에 투석하여 미반응 당을 제거하였다. BSA-AGE 수준은 형광 분광광도법(Ex370/Em 440 nm; model LS 30, PerkinElmer LAS Ltd., Buckinghamshire, UK)[32]에 의해 결정되었습니다. 환원당 및 MGO에 의한 BSA 단백질의 당화는 양성 대조군(BSA 당화)이었고, 아미노구아니딘(1 mg/mL)으로 당화된 BSA의 배양은 음성 대조군(BSA 당화-AG)으로 사용되었다. 검정을 3회 수행하였다.
2.2.2. 프럭토사민 분석
fructosamine 수준은 fructosamine이 NBT를 감소시켜 알칼리 조건에서 착색된 최종 생성물인 formazan을 형성하는 능력을 기반으로 하는 NBT(nitro blue tetrazolium) 분석에 의해 결정되었습니다. 대조군 또는 당화된 BSA 배양 SME 농도(BSA-SME) 중 10 마이크로리터를 탄산염 완충액(0.1M, pH 10.3)에서 제조된 2.5mM의 NBT 9{7}}μL에 첨가했습니다. 모두 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 530 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 프럭토사민 농도(nmol/mg)는 포르마잔의 표준곡선에 따라 계산하였다.
2.2.3. BSA-AGE에서 카르보닐기 형성 및 티올기 고갈 결정
카르보닐기 농도는 Levine et al.에 따르면 BSA-SME 및 대조군 샘플에서 측정되었습니다. [34]. 400μL의 2.5M HCl에 2,{3}}디니트로페닐히드라진(DNPH;10mM)의 용액을 각 샘플 100μL에 첨가하고 실온에서 60분 동안 암실에서 인큐베이션했습니다.시스탄체 혜택그런 다음, 500 μL의 트리클로로아세트산(20% w/v)을 첨가하고 5분 동안 얼음 위에 두었습니다. 샘플을 4{11}} rpm에서 15분 동안 원심분리하고 단백질 펠렛을 에틸 아세테이트/에탄올(1:1 v/v)로 3회 세척했습니다. 그 후, 샘플을 250μL 구아니딘 염산염에 6M까지 현탁시켰다. 카르보닐기의 농도(nmol/mg 단백질)는 370nm 흡광도에서 분광광도법(EON, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA) DNPH의 흡수 계수(22,000M{12}} cm{13}}).
Ellman의 방법에 따라 BSA-SME 및 대조군 샘플에서 티올기 고갈의 측정이 수행되었습니다. 간단히 말해서, 5,5'-디설판디일비스(2-니트로벤조산)(DNTB, 10mM, PBS에서 제조됨) 1{11}} μL과 당화된 샘플 50 μL를 실온에서 15분 동안 배양하고, 그런 다음 410 nm에서 흡광도를 측정했습니다. 유리 티올 그룹의 수준은 L-시스테인(0.{12}} μM)의 표준 곡선을 사용하여 계산되었으며 nmol/mg 단백질로 표시되었습니다[34].
2.3. SME가 당뇨병 쥐의 망막에 미치는 영향 2.3.1.쥐의 당뇨병 유도
체중이 250±10gr(N{2}})인 Wistar 수컷 랫트를 8시간 금식하여 사용했습니다. 구연산염 완충액(10mM, pH 4.5)(Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, USA)에서 streptozotocin(60mg/kg)을 복강 내로 투여했습니다[35]. 3일 후, 꼬리에서 한 방울의 혈액 샘플을 채취하여 포도당 수준을 측정했습니다(글루코미터; ACCU-CHEK 활성; Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Germany). 혈당 수치가 350mg/dL보다 높은 동물을 연구에 모집했습니다. 혈액 내 포도당은 12주 동안 매주 측정되었습니다.
2.3.2. 실험적 설계
스트렙토조토신으로 유도된 당뇨병 쥐(STZ)를 다음 그룹으로 무작위로 나누었습니다(n =10): 2mL의 식수(STZ)로 위내 처리된 STZ; 4{12}} mg/kg의 SME로 처리된 STZ(STZ-SME); 정상혈당 쥐(NG); 및 50 mg/kg 아미노구아니딘으로 처리된 STZ(AG; Sigma-Aldrich, Inc.)(STZ-AG). STZ-AG를 항-AGE 참조 그룹으로 사용했습니다. 할당된 용량은 12주 동안 24시간(오전 9시)마다 투여되었습니다. 모든 그룹의 혈당 수준을 매주 모니터링했습니다. 400mg/kg의 SME 투여 요법은 다음을 기반으로 했습니다. 7g의 SME는 100g의 신선한 시금치에서 얻습니다(데이터는 표시되지 않음). 이 양은 미국 식단[36]에서 평균 70kg인 사람의 일일 섭취량에 해당하며, 이는 체중 1kg당 추출물 100mg에 해당합니다.Cistanche 추출물 안티 방사선한편, 쥐의 신진대사 촉진의 차이로 인해 인간과의 비교 연구를 위해 모든 천연 추출물의 섭취량을 최대 6.4배까지 증가시키는 것이 권장된다[37]. 우리가 사용한 400 mg/kg의 용량은 주로 Wistar 쥐에서 유도된 심근 괴사 모델에서 얻은 결과를 기반으로 했으며, 이는 SME의 항염 효과가 300 mg/kg에서 더 유의함을 보여주었습니다[12].
2.3.3. 조직학적 및 면역조직화학 평가
적출된 눈은 중성 포르말린에 고정한 후 등급 알코올로 탈수하고 파라핀에 포매하였다. 2μm의 조직학적 섹션을 전기하전 슬라이드에 장착하고, 탈랍하고, 항원 회수 용액(K035; 10x 시트레이트 완충액, pH6; Diagnostic BioSystems, Pleasanton, CA, USA)까지 재수화했습니다. 폴리머 기반 면역검출 시스템(PolyVuemouse/rabbit DAB 검출 시스템, Diagnostic BioSystems)을 사용하였다. 하기 1차 항체가 사용되었다: 아교 섬유성 산성 단백질(항-GFAP; MAB360; Chemicon International, Inc., Temecula, CA, USA); 혈관 내피 성장 인자(항-VEGF;sc{8}}; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA), S100 칼슘 결합 단백질 B(항-S100B; ab52642; Abcam PLC, Cambridge, UK) 및 활성화된 B 세포의 핵 인자 카파-경쇄 증강제(항-NF-kB p65;sc{20}}). 모든 희석액은 1:200이었고 4도에서 밤새 배양되었습니다. 2차 항체(Mouse/Rabbit PolyVueTM)는 공급자의 지침에 따라 추가되었습니다.시스탄체 허브섹션은 DAB 플러스/크로모겐 기질 및 헤마톡실린으로 염색되었습니다. 조직학적 관찰 및 이미지 캡처는 Carl Zeiss 현미경(Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany)에서 수행되었습니다.
면역형광 염색을 위해 슬라이드를 4℃에서 밤새 1차 항체와 함께 인큐베이션했습니다: 카르복시메틸 라이신(항-CML; ab124145; Abcam PLC, Cambridge, UK), AGE 수용체(항-RAGE; sc{4}}), NADPH 산화효소 4(항-Nox4;ab133303), 3-니트로티로신(항-NT; ab110282) 및 산화질소 합성효소(유도성)(항-iNOS; A{13}};Boster Bio, Pleasanton, CA , 미국). 그런 다음 다음 이차 항체를 사용했습니다. 항-RAGE의 경우 염소 항-마우스 IgG(FITC)-접합(1:200; Santa Cruz, Biotechnology, Inc.); 항-CML 및 항-NT의 경우, 마우스 항-토끼 IgG-PE(SC{23}}); 및 anti-iNOS 및 anti-Nox4의 경우 m-IgGkBP-PE(Sc{29}}). 모두 실온에서 60분 동안 인큐베이션했습니다. 그 후, 섹션을 4',6-디아미딘-2'-페닐인돌 디히드로클로라이드(DAPI)를 포함하는 배지에 장착했습니다. 항-CML 및 항-RAGE 항체는 동일한 슬라이드에서 공동 하이브리드화되었습니다. 형광 이미지에는 FLoidTM Cell Imaging Station(Life Technologies Carlsbad, San Diego, CA, USA)을 사용했습니다.
2.3.4.아포토시스 평가
In Situ Cell Death Detection Kit, TMR(tetramethyl-rhodamine{{ 3}}dUTP) 빨간색, 버전 12(12156792910, Roche Diagnostics) 간단히 말해서, 탈랍된 슬라이드를 재수화하고 PBS로 두 번 헹구었습니다. 그런 다음, TUNEL 반응 혼합물과 함께 37℃에서 60분 동안 가습된 분위기에서 인큐베이션되었습니다. 그 후, 섹션을 DAPI로 장착하고 형광 현미경(FLoidTM Cell Imaging Station)에서 관찰했습니다. TUNEL에 대한 IOD는 망막 층에 대해 계산되었습니다.
2.3.5. 지질 과산화 분석
망막 조직의 말론디알데히드(MDA) 수준을 평가하기 위해 약 3mg의 신선한 조직(n=3)을 균질화하고 이전에 보고된 대로 처리했습니다[38]. MDA 수준은 키트 공급자의 지침(OXItek-TBARS 분석 키트, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA)에 따라 정량화되었습니다.
2.4.통계분석
통계 분석을 위해 모든 망막 현미경 사진은 시신경 영역 너머 100μm에서 200배 크기로 캡처되었습니다. 동물 그룹당 약 40개의 이미지(n=7)가 분석되었습니다. 이미지 분석은 소프트웨어 Image-Pro Premier 버전 9.0(Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA)으로 수행되었습니다. GraphPad Prism 소프트웨어(미국 캘리포니아주 La Jolla, 버전 8.0)를 사용했습니다. 그림은 신경절 세포층(GCL), 내부 핵층(INL) 및 외부 핵층(ONL)에 대한 box-and-whisker 플롯(중앙값, 1/3 사분위수, 최소-최대값)으로 그래프로 표시된 값을 보여줍니다. 평균과 표준편차(평균 ± SD)는 부록 A에 나와 있습니다(표 A{13}}A3). 모든 경우에 일원 ANOVA 테스트에 이어 Tukey의 테스트가 수행되었습니다. 피<0.05 was="" considered="" statistically="">
