산화 스트레스는 다양한 대사 질환의 중요한 전구체 중 하나입니다 2부
Apr 26, 2022
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3. 토론
자유 라디칼은 전자를 얻기 위해 단백질, 지질 또는 DNA를 공격하여 다양한 건강 문제를 일으킬 수 있습니다. 이러한 이유로 신체의 항산화 시스템과 산화에 의해 형성된 자유 라디칼의 균형을 유지하는 것이 필수적입니다. 이 균형이 무너지면 산화 스트레스가 발생한다[29]. 산화 스트레스는 암, 당뇨병, 심혈관 질환, 알츠하이머 병 등과 같은 다양한 만성 질환을 유발하는 주요 요인 중 하나입니다. 인체에는 조직 및 기관에 대한 산화 손상을 방지하기 위한 자가 항산화 시스템이 있지만 이러한 방어 시스템은 알코올 과소비, 흡연, 스트레스, 만성 약물 사용 및 방사선 등과 같은 다양한 조건으로 인해 효율성을 잃을 수 있습니다.[30]. 다양한 과학적 보고서에 따르면 이차 식물 대사 산물은 산화 스트레스와 그 유해한 영향을 예방하는 데 중요한 역할을 한다고 합니다. 대부분의 연구. 그러나 이차 대사 산물은 위장 시스템의 다양한 pH 조건, 효소 활성 및 체온으로 인해 구조적 변형을 겪는 것으로 잘 알려져 있습니다. 또한, 분자량, 극성, 식물 기질의 거대분자에 대한 결합 정도와 같은 2차 대사 산물의 화학적 특성도 생체 이용률에 영향을 미치는 중요한 요소입니다[13]. 따라서, 일단 섭취된 화합물 또는 그 대사산물의 혈류로의 흡수는 이들의 전신 생리학적 효과를 발휘하기 위해 필수적이다. 시험관 내 소화 시뮬레이션 모델은 물질의 가능한 생체이용률 특성 평가에 대한 증거를 제공할 수 있습니다. 기능적 특성을 주장하기 위해서는 인체 시험에서의 확인이 필요하지만, 시험관 내 시뮬레이션 모델은 종종 윤리적으로 논쟁의 여지가 있고 자원 집약적이며 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되는 생체 내 연구 또는 인체 시험의 대안으로 널리 사용됩니다[32].
여러 연구자들은 또한 Cistus 종의 다른 기관에서 준비한 추출물의 항산화 잠재력을 조사했습니다. 문헌 조사에 따르면, 이것은 체외 소화 시뮬레이션 모델을 사용하여 페놀 물질의 생체 이용률과 항산화 활성에 미치는 영향에 관한 Cistus 종에 대한 첫 번째 연구입니다. Karaset al. [33]은 폴리페놀 성분의 10%가 식물 기질에서 소화되지 않고 남아 있고 그 중 90%가 위 또는 장 단계에서 소화된다고 제안했습니다(각각 약 48% 및 52%). 앞서 언급했듯이 수성 추출물의 모든 페놀 함량은 시험관 내 인간 소화 시뮬레이션 절차에 의해 부정적인 영향을 받았습니다. 따라서 모든 추출물의 생체이용 가능한 샘플의 페놀 함량에서 상당한 손실이 감지되었습니다. 더욱이, IN 샘플의 총 프로안토시아니딘 농도는 모든 수성 추출물에서 검출 한계 미만이었습니다. 다양한 연구는 또한 식물 추출물의 페놀 화합물 및 이에 따른 관련 생체 활성에 대한 소화 절차의 부정적인 영향을 촉발했습니다. 예를 들어, Salvia virgata Jacq의 총 페놀 함량을 보고했습니다. 또한 우리의 이전 연구에서 소화 절차에 의해 부정적인 영향을 받았습니다. 또한 추출물의 주요 대사 산물인 루틴과 로즈마린산의 양이 감소하는 경향이 있었습니다[13]. 이에 반해 여러 연구에서는 상반된 결과를 보고했습니다. Celeb et al. [34], 그들은 Hypericum perfoliatum L의 메탄올 추출물의 생체이용 샘플에서 총 페놀산, 플라보노이드 및 페놀 함량의 증가를 관찰했습니다. 실제로 주요 대사산물인 케르시트린, 클로로겐산 및 갈산은 100 이상의 생체 접근성 비율을 보였습니다. 퍼센트 . 이러한 연구는 소화 절차의 효과가 식물 재료에 따라 다를 수 있음을 보여주었습니다. 이러한 차이점을 명확히 하기 위해 페놀성 물질에 대한 소화 시스템의 작용 메커니즘을 고려하는 것이 필수적입니다. (바이오플라보노이드 효능) Serra et al.[35] 페놀 화합물은 주로 식물 기질의 배당체, 중합체 및 에스테르 형태에서 발견되며 흡수되기 전에 소화 시스템에서 가수분해된다고 제안했습니다. 다양한 요인이 위장관에서 페놀 화합물의 구조적 변형에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, 프로안토시아니딘 또는 프로시아니딘과 같은 고분자량 화합물은 장에서 흡수되기 전에 가수분해되어야 합니다. 식물 기질의 구조는 또한 페놀의 생체이용률에 중요한 요소입니다. (시탕슈를 사다)페놀 화합물은 섬유질, 단백질 및 지질 분자와 같은 식물 기질의 거대분자에 결합할 수 있습니다. 따라서 기질에서 유리된 페놀 성분만 위장관에서 흡수될 수 있습니다. 또한 장내 미생물총의 다양한 pH 값과 효소 작용은 페놀 화합물의 화학 구조 변형에 영향을 미치는 다른 중요한 요소 중 하나입니다[36]. 이러한 데이터에 비추어 우리는 유사한 유형의 실험 연구에서 얻은 다른 결과가 소화 시스템의 복잡성과 식물 기질의 구성으로 인한 것일 수 있다는 가설을 세울 수 있습니다. 표 3에 제시된 바와 같이, Cistus 추출물의 생체 이용 가능한 샘플은 페놀 함량이 낮기 때문에 소화되지 않은 샘플 및 위 후 대응물보다 더 약한 항산화 활성을 나타냈습니다.
시스탄체~할 수 있다면역력을 향상시키다
또한, C. saluifolius의 두 추출물은 다른 종과 비교할 때 DPPH, CUPRAC, FRAP 및 TOAC 분석에서 더 나은 항산화 활성을 나타냈습니다. 또한, C.paroifforus의 두 추출물 모두 다른 종의 추출물보다 더 높은 DMPD 라디칼 소거 활성을 보였다. 표 1에 나타난 바와 같이 총 페놀류, 플라보노이드,시탕슈 비엔페이C. salviifolius의 페놀산 함량은 다른 시료보다 높았다. 따라서 C. salviifolius 추출물의 더 높은 항산화 잠재력은 페놀 함량과 관련이 있을 수 있습니다.
또한, 생체이용 가능한 시료의 항산화 잠재력, 탄수화물 관련 효소에 대한 억제 활성 및 AGEs의 감소는 마커 플라보노이드 배당체의 감소와 관련이 있을 수 있습니다. 그러나 Cistus 추출물에는 그림 1에 표시된 것처럼 다른 페놀성 물질도 포함되어 있습니다. 따라서 생물학적 활성에 대한 소화의 영향을 모니터링하려면 추출물에 대한 자세한 크로마토그래피 분석이 필요합니다.
소화 효소에 대한 식물 추출물의 억제 가능성은 최근 합성 억제제의 안전성 문제로 인해 더 많은 관심을 받고 있습니다. 따라서 식물 추출물의 억제 효과는 여러 연구에서 확인되었으며 이 효과는 일반적으로 플라보노이드, 페놀산, 프로안토시아니딘 등과 같은 페놀성 물질과 관련이 있습니다. Sun et al. [37] 폴리페놀 화합물은 소수성 힘과 비공유 결합의 도움으로 위에서 언급한 효소와 결합하여 억제 효과를 나타낸다고 제안했습니다. 따라서 폴리페놀에 의한 o-아밀라아제 및 α-글루코시다아제 효소 활성의 억제는 분자 구조와 관련이 있습니다. 이 상호작용 메커니즘은 억제 역학, 분자 도킹, 형광 소광 등과 같은 다양한 기술을 사용하여 연구되었지만 아직 확실한 결론을 얻지는 못했습니다[38]. 그러나 많은 연구에서 식물 추출물의 소화 효소 억제가 페놀 함량과 직접적인 관련이 있다고 보고했습니다. 시스투스 종의 효소 억제 활성에 대한 유사한 연구도 이전에 보고되었습니다. Sayah et al. [39] C. monspeliensis 및 C. saluifolius의 8{{1{12}}}}% 메탄올 및 수성 추출물의 -amylase 및 -glucosidase 억제 활성을 조사했습니다. 그들의 결과는 C. salvifolius 수성 추출물이 더 높은 o-글루코시다아제(ICso ug/mL:{18}}.95±0.14) 및 -amylase(IC5{ {55}} ug/mL: 217.1±0.15) C. monspeliensis 물 추출물(IC50 ug/mL∶ 14.58±1.26) 및 (IC{25}}g/mL:886.10±0.10)보다 각각 억제 활성. 이들 효소에 대한 두 수성 추출물의 억제율은 참조 화합물인 acarbose보다 더 높았습니다(ICso ug/mL:18.01±2.{33}}) 우리 연구와 유사하게, 그들은 효소 억제율 및 총 페놀 및 플라보노이드 양. C. saloifolius 수성 추출물(각각 408.43±1.09mg GAE 및 140.{39}}±1.15 RE)의 총 페놀 및 총 플라보노이드 함량은 C.monspeliensis 수성 추출물(261.76±1.9mg GAE 및 78.00각각 ±1.15 RE). Orhanet al. [40] 또한 C.laurifolius의 잎에서 추출한 80% 수성 및 에탄올 추출물의 소화 효소 억제 가능성을 조사했습니다. 그들의 결과에 따르면 80% 에탄올 추출물(71.7% ±0.6)은 1mg/mL 농도에서 수성 추출물(39.3% ±2.2)에 비해 강력한 아밀라아제 억제 활성을 나타냈다. 그들은 페놀 화합물, 특히 플라보노이드가 베타 세포 세포 사멸을 방지하고 항당뇨 활성을 지원함으로써 인슐린 분비에 직접적인 영향을 미친다고 제안했습니다. 우리 결과와 상관관계가 있는 이 가설은 C. salviifolius의 수성 추출물의 ND 샘플이 가장 높은 총 플라보노이드 및 페놀 함량과 가장 큰 -amylase 및 o-glucosidase 억제 활성을 나타냈다는 것을 나타냅니다. 표 4에 나타난 바와 같이, C. salviifolius의 수성 추출물은 다른 추출물보다 소화효소에 대한 더 우수한 억제 활성을 나타내었다. 추가적으로,시스탄체 콜레스테롤수성 추출물의 IN 샘플은 ND 샘플보다 낮은 페놀 및 플라보노이드 함량을 함유하여 본 연구에서 더 낮은 효소 억제 활성을 나타냈다. 추출물의 페놀 함량은 소화 과정에 의해 부정적인 영향을 받았지만 여전히 상당한 소화 효소 억제 활성을 나타냈습니다. 여러 연구에서 플라보노이드 배당체가 강력한 -amylase 및 -glucosidase 억제 가능성을 가진 식물 추출물의 주요 대사 산물로 보고되었습니다[41-43] 소화 효소에 대한 페놀 화합물의 억제 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았지만 구조- 활성 관계 연구는 플라보노이드, 페놀산, 프로안토시아니딘 및 탄닌과 같은 일부 페놀 성분에 대해 수행되었습니다. 플라보노이드에 대한 구조-활성 관계 연구는 C-고리의 C2=C3 이중 결합이 이러한 화합물의 소화 효소 억제 가능성을 향상시키는 것으로 나타났습니다. 이 결합은 전자 밀도를 높이므로 플라보노이드와 효소 간의 상호 작용 강도가 증가합니다[44]. 또한 C-5 및 C{10}}의 히드록실기는 플라보노이드의 α-아밀라아제 억제 가능성을 촉진합니다. 또한 플라보노이드 골격의 하이드록실화는 α-아밀라아제 및 β-글루코시다아제 효소 억제 가능성에 긍정적인 영향을 미친다고 제안되었습니다[45]. 앞서 지적한 바와 같이, 본 연구의 모든 마커 플라보노이드는 위에서 설명한 이러한 구조적 요구 사항을 지닌 플라보놀 배당체였습니다. 그러나, 시험관내 소화 절차 후, 이들의 관련 활성은 수성 추출물의 생체 이용 가능한 샘플에서 상당히 감소했습니다.
일반적으로 AGEs에 대한 식물 추출물의 억제 가능성은 페놀 함량, 항산화 가능성, 금속 킬레이트화 능력, 단백질 상호 작용 및 AGE 수용체 차단 활성과 같은 여러 요인과 관련이 있습니다[13]. 표 4에 제시된 바와 같이, 수성 추출물의 생체이용가능한 샘플은 시험관내 소화 절차가 추출물의 페놀 함량에 악영향을 미치기 때문에 ND 샘플에 비해 더 낮은 AGE 억제 활성을 나타냈다. 현재 연구 결과에 따르면 C.의 수성 추출물의 ND 샘플(시스탄체와 통캇 알리 레딧) saluifolius는 총 페놀 및 플라보노이드 함량뿐만 아니라 가장 높은 AGE 억제 활성을 가졌다. 대조적으로, C. monspeliensis의 수성 추출물 IN 샘플은 가장 약한 AGE 억제 잠재력을 보였으며, 이는 총 플라보노이드 및 페놀 함량이 가장 낮기 때문일 수 있습니다. 플라보노이드는 식물 추출물, 과일, 야채 및 음료에 널리 분포되어 있기 때문에 AGE 형성에 대한 플라보노이드의 억제 가능성에 대한 여러 연구가 강화되었습니다. 이 연구에서 마커 페놀릭으로 지정된 동일한 플라보노이드가 다른 연구[46-48]에서도 마커 화합물로 보고되었습니다.
소화 효소 억제와 유사하게 플라보노이드의 AGE 억제 활성은 C{0}}C3 이중 결합과 A 및 C 고리의 수산화에 의해 자극되었습니다. 그러나 플라보노이드 골격에 대한 당 부착은 억제 활성을 감소시킨다[49]. 한편, Cervantes-Lauren et al.[50] 글리코사이드의 플라본이 다른 플라보노이드 글리코사이드보다 더 큰 AGE 억제 가능성을 갖고 있다고 제안했습니다.{5} 이 가설은 생체이용 가능한 샘플에서 감소된 AGE 억제에 대한 설명일 수 있습니다. 예를 들어, C.monspeliensis의 수성 추출물의 생체 이용 가능한 샘플에서는 quercitrin과 hyperoside가 검출되지 않았으며, 이는 다른 종의 추출물에 비해 C. monspeliensis의 IN 샘플의 활성이 낮은 이유입니다. C. saloifolius의 수성 추출물에서는 quercitrin이 검출되지 않았지만, 유의하게 더 많은 양의 hyperoside와 salidroside가 높은 AGE 억제 활성의 원인일 수 있습니다. 일반적으로 샘플의 마커 플라보노이드 함량과 AGEs에 대한 억제 가능성 사이에는 양의 상관관계가 관찰되었습니다.
4. 재료 및 방법
4.1.화학물질
실험에 사용된 모든 참조, 효소 및 화학 물질은 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입했습니다. 실험에는 분석 등급 재료가 사용되었습니다.
4.2.식물 표본
C.creticus 및 C.saloifolius의 공중 부분은 2018년 4월 마지막 주에 Yeditepe University(Kayisdagi, Istanbul) 캠퍼스에서 수집되었습니다. C.mon-speliensis 및 C. paroiflorus의 공중 부분은 Alacant Kutlu Aktas 근처에서 수집되었습니다. Balaji, Cesme, Izmir 2018년 5월 둘째 주. C. laurifolius의 공중 부분은 2018년 6월 첫째 주 Konya의 Kemer-Doganhisar 도로에서 수집되었습니다. Erdem Yesilada 교수는 식물 재료를 인증했습니다. C. creticus(YEF18013), C. Lauri folium(YEF18017), C.monspeliensis(YEF18015), C.paroiflorus(YEF18016) 및 C.salvifolius(YEF18014)에 대한 상품권 표본은 약학부 식물표본관에 보관되었습니다. 터키 이스탄불 예디테페 대학교 약학박사. 4.3.추출 절차
수성 추출은 전통 의학에서 일반적으로 준비 기술로 사용되기 때문에 선택되었습니다. 100g의 시스투스(Cistus)종 기상부를 거칠게 공기 건조하여 15분간 진탕기를 이용하여 뜨거운 증류수(80도, 1.5L)로 추출하였다. 그 다음, 수성 추출물을 여과지로 여과하고 감압하에 증발 건조시켰다. 동결건조 절차가 완료된 후 추출물을 증류수에 용해하여 추가 처리(비소화 샘플: ND)(추출물 수율: C.creticus의 경우 13.04%, C.laurifolus의 경우 15.7%, C.monspeliensis의 경우 12.8%) , C.parviflorus의 경우 14.94%, C.salvifolius의 경우 14.74%). 4.4.체외 인체 소화 시뮬레이션 방법
인간 소화 시뮬레이션 모델은 이전에 Celeb et al.[34]에 의해 자세히 설명된 방법에 따라 시험관 내 Cistus 샘플에 적용되었습니다. 먼저 NaCl 1g과 펩신 1.6g을 500mL의 증류수에 녹여 모의위액(SGF)을 얻었다. 이후에 HCl(5M)을 사용하여 SGF 용액의 pH를 2로 조정했다. 이 용액 17.5mL 2.5mL의 식물 샘플과 혼합하고 이 혼합물을 37도의 진탕 수조에 2시간 동안 놓아 소화 시스템의 연동 운동을 모방했습니다. 2시간 후, 샘플을 빙욕에 넣어 효소 반응을 비활성화하고, 샘플 2mL를 추가 실험을 위해 "위후"(PG) 샘플로 따로 보관했습니다. 적절한 양의 NaHCO3(1M, pH7)가 로딩된 셀룰로오스 투석막이 차가운 샘플 용액에 위치했습니다. 따라서 위장 흡수가 모방되었습니다. 그런 다음 담즙산/판크레아틴 용액 4.5mL를 용액과 혼합하고 혼합물을 37도에서 2시간 더 인큐베이션했습니다. 마지막으로, 투석막 내부의 유체는 "생체이용 가능한" 샘플(IN)로 획득되었습니다. 절차가 끝난 후 모든 샘플은 추가 실험을 위해 -20도에서 보존되었습니다. 4.5. 페놀 프로파일의 시험관 내 추정 4.5.1. 총 페놀 함량 분석 샘플의 총 페놀 함량에 대한 분광 광도 측정은 Barak et al.[32]에 의해 앞서 자세히 설명된 방법에 따라 96-웰 플레이트 템플릿에서 수행되었습니다. NagCO3 75 uL(H2O에서 20% )를 새로 준비한 샘플 및 참조 용액 20μL에 첨가했습니다. 그런 다음, 100 μL의 Folin-Ciocalteu 시약을 혼합물과 합하였다. 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 배양한 후, 흡광도는 690 nm에서 측정되었습니다. 갈산은 검량선을 설정하기 위해 다양한 농도에서 기준 용액으로 사용되었으며 총 페놀 함량은 갈산 당량(GAE)으로 표시되었습니다. 4.5.2. 총 플라보노이드 함량 분석 샘플의 총 플라보노이드 함량에 대한 분광 광도 측정은 Bardakci et al.에 의해 이전에 설명된 방법에 따라 96-웰 플레이트 템플릿에서 관리되었습니다. 【51】; 75% 에탄올 150μL, 염화알루미늄 10μL 및 1M 아세트산나트륨 삼수화물 10μL를 샘플 및 참조 용액 50μL와 별도로 혼합했습니다. 그런 다음, 이 혼합물을 암실 온도에서 30분 동안 인큐베이션했습니다. 인큐베이션 기간 후, 흡광도는 405 nm에서 계산되었습니다. 퀘르세틴은 검량선을 설정하기 위해 다양한 농도의 참조 용액으로 사용되었으며 총 플라보노이드 함량은 퀘르세틴 등가물(QE)로 표시되었습니다.
4.5.3.총 페놀산 함량 분석
샘플의 총 페놀산 함량은 이전에 Barak et al.에 의해 보고된 절차에 따라 분광광도계로 측정되었습니다. [52]. 먼저 증류수에 적당량의 아질산나트륨과 몰리브덴산나트륨을 녹여 Arnow 시약을 얻었다. 그런 다음, 1ml의 샘플을 1ml의 Arnow 시약, 1ml의 0.1M HCl 및 1ml의 1M NaOH와 각각 합하였다. 그 후 증류수로 10 ml가 되도록 부피를 조절하고 490 nm에서 흡광도를 즉시 판독하였다. Caffeic acid는 검량선을 얻기 위해 다른 농도에서 기준 용액으로 사용되었으며 총 페놀산 함량은 CAE(caffeic acid equivalent)로 표시되었습니다.
4.5.4.총 프로안토시아니딘 함량 분석
샘플의 총 프로안토시아니딘 함량의 분광광도 측정은 Barak 등의 방법에 따라 96-웰 플레이트 템플릿에서 수행되었습니다. [11]. 간략하게, 25 uL의 샘플 용액을 각각 150 uL의 4% 바닐린 및 75 uL의 HCl 용액(32%)과 혼합하였다. 암실 온도에서 15분 인큐베이션 시간 후, 흡광도를 492 nm로 조정했습니다. 카테킨 수화물은 검량선을 얻기 위해 다른 농도에서 참조 용액으로 사용되었습니다. 메탄올을 대조군 용액으로 사용하였다. 샘플의 총 프로안토시아니딘 함량은 카테킨 등가물(CE)로 표시되었습니다.
4.6.유리 라디칼 소거 활성 분석 4.6.1.DPPH 라디칼 소거 활성 분석
Celeb et al.[53]이 수정한 방법에 따라 샘플의 DPPH 라디칼 소거 활성을 96-웰 플레이트 템플릿에서 결정했습니다. 처음에는 150 uM의 DPPH 용액을 새로 준비했습니다. 그런 다음, 200 μL의 DPPH 용액을 25 μL의 샘플 용액과 혼합하였다. 그런 다음, 이 혼합물을 암실 온도에서 50분 동안 인큐베이션했습니다. 흡광도는 540 nm에서 계산되었습니다. 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT)은 다른 농도에서 참조 용액으로 사용되었습니다. 대조 용액으로 메탄올을 사용하였다. 샘플의 활성은 50% 활성을 나타내는 농도에 해당하는 EC50으로 표시되었습니다.
4.6.2.DMPD 라디칼 소거 활성 분석
샘플의 DMPD*(N,N-디메틸-p-페닐렌디아민) 라디칼 소거 활성은 Inan et al.에서 앞서 설명한 방법에 따라 96-웰 플레이트 템플릿에서 수행되었습니다. [13]. 먼저, 1{6}}{{1{14}}}mM DMPD + 용액, 0.05M FeCl; 6H2O 용액 및 0.01M 아세테이트 완충액을 새로 준비했습니다. 그런 다음, 1mL의 DMPD 용액, 100mL의 아세테이트 완충액, 0.2mL의 FeCl{16}}H2O 용액을 혼합하고 나중에 15uL의 샘플 용액을 210μL의 이 혼합물과 합했습니다. 암실 온도에서 50분간 배양한 후 492 nm에서 흡광도를 측정하였다. Trolox는 검량선을 얻기 위해 다른 농도에서 기준 용액으로 사용되었습니다. 샘플 용액의 농도는 1 mg/mL이었다. 샘플의 DMPD 라디칼 소거 활성은 Trolox 등가물(TE)로 표시되었습니다. 4.7.금속 환원 활성 분석
4.7.1.제2철 환원 항산화력 분석(FRAP)
샘플의 FRAP 활성 측정은 이전에 Bardakci et al.[54]에 의해 보고된 절차에 따라 96웰 플레이트 템플릿에서 수행되었습니다. 실험 초기에 FRAP 시약은 아세테이트 완충액, ferric-tripyridyltriazine 및 FeCl;6H2O 용액을 혼합하여 형성되었습니다. 그 후 FRAP 시약을 37도 오븐에 3{14}} 분간 넣었습니다. 그런 다음, 10 uL의 샘플 용액을 각각 30 uL의 증류수 및 260 uL의 FRAP 시약과 합하였다. 37도에서 30분간 인큐베이션한 후 흡광도를 593 nm로 조정하였다. 결과를 평가하기 위해 다양한 몰 농도의 황산제1철(0.{15}}mM) 용액을 사용하여 표준 곡선을 작성했습니다. BHT는 다른 농도에서 참조 용액으로 사용되었습니다. 샘플의 FRAP 활성은 1g 건조 추출물에서 mM FeSO4로 표시되었습니다.
4.7.2.CUPRAC(Cupric Reducing Antioxidant Capacity Assay)
샘플의 CUPRAC 활성은 Celeb et al.에 의해 수정된 방법에 따라 96-웰 플레이트 템플릿에서 결정되었습니다. [31]; 85μL의 CuSO4(10mM), 네오쿠프레인 및 암모늄 아세테이트 용액과 51uL의 증류수를 43uL의 샘플 용액에 별도로 추가했습니다. 수조에서 50도의 인큐베이션 기간(20분) 후 450 nm에서 흡광도를 측정했습니다. Ascorbic acid는 검량선을 얻기 위해 다른 농도에서 기준 용액으로 사용되었습니다. 샘플의 CUPRAC 활성은 아스코르브산 등가물(AAE)로 표시되었습니다. 4.8.총 항산화 활성 분석(TOAC)
샘플의 총 항산화 활성 측정은 Celeb et al.의 절차에 따라 96-웰 플레이트 템플릿에서 수행되었습니다. [55]. 먼저 일정량의 인산일나트륨, 몰리브덴산암모늄 사수화물, 황산을 혼합하여 TOAC 용액을 얻었다. 그런 다음 300 μL의 TOAC 용액을 30 μL의 샘플 용액에 첨가했습니다. 95도 수조에서 90분간 인큐베이션한 후 690 nm에서 흡광도를 측정했습니다. Ascorbic acid는 검량선을 얻기 위해 다른 농도에서 기준 용액으로 사용되었습니다. 샘플의 TOAC 활성은 아스코르브산 등가물(AAE)로 표시되었습니다. 4.9.생체이용률 지수 추정
생체이용률 지수(BAvI)는 Inan et al.[13]이 설명한 이론 방정식에 따라 계산되었습니다.
BAVI=CIN/CND '생체이용률 지수'(BAvI)는 생체이용 가능한 샘플(IN)의 페놀 수와 소화되지 않은 샘플(ND)의 비율로 설명됩니다. 4.10. HPTLC에 의한 마커 플라보노이드 정량화
Cistus 종의 수성 추출물의 모든 시뮬레이션 샘플(ND, PG, IN)에서 살리드로사이드, 하이퍼로사이드 및 케르시트린 농도의 정량적 측정은 고성능 박막 크로마토그래피(HPILC)(CAMAG, Muttenz, Switzerland)에 의해 수행되었습니다. Guzelmeric et al.에 의해 검증된 방법을 따릅니다. [16]. Hyperoside, salidroside 및 quercitrin은 25.50 및 10{{30}} ug/mL 농도로 제조되었으며 새로 제조된 샘플 용액의 농도는 다음과 같이 조정되었습니다. 10mg/mL. 이 용액을 100μL 주사기를 사용하여 특정 부피({10}} μL 표준 용액 및 5 μL 샘플 용액)로 순상 유리 지지 실리카 겔 플레이트(20cm × 10cm, Merck, Darmstadt, Germany)에 적용했습니다. Hamilton, Bonaduz, Switzerland). 적용 절차는 Linomat 5 샘플 애플리케이터로 수행되었습니다. 현상 프로세스는 자동 개발 챔버(ADC 2) 및 에틸 아세테이트: 디클로로메탄, 아세트산, 포름산: 물(10:25:10)에서 수행되었습니다. :10:10:10me)를 이동상으로 선택한 다음, 플레이트를 침지 장치(CAMAG)에서 천연 제품 시약(NPR)(200mL의 에틸 아세테이트 중 1g 디페닐붕산{22}}아미노에틸 에스테르)으로 유도체화했습니다. hyperoside와 quercitrin은 260 nm에서 분광광도계로 분석하였고, salidroside의 양은 330 nm에서 UV 스캐너로 측정하였으며, 표준물질의 Rf 값은 hyperoside (≈0.35), quercitrin (c0.45), tiliroside (≈ 0.65).상관 계수(r²)는 다음과 같이 밝혀졌습니다. 마커 플라보노이드의 정량화를 위해 ×0.98이어야 합니다.
4.11.당뇨 관련 효소에 대한 억제 활성 4.11.1. -글루코시다아제 저해 활성
-Cistus 종의 수성 추출물에서 얻은 소화되지 않은 생체 이용 가능한 샘플의 글루코시다제 억제 활성은 Balan et al. [56]. 먼저, 100mM 인산완충액(pH7)을 구입하여 적당량의 인산일나트륨과 인산이나트륨을 혼합하였다. ac 글루코시다제 효소를 인산 완충액에 용해시켜 α-글루코시다제 용액(0.2U/mL)을 얻었다. 그런 다음 17{30}} uL의 인산염 완충액, 20 μL의 α-글루코시다아제 용액 및 20 μL의 샘플 용액을 합하고 37도 오븐에서 15분 동안 인큐베이션했습니다. 그 후, 100mM 인산칼륨 완충액(pH7.0)에 녹인 2.5mM p-니트로페닐{18}D-글루코피라노사이드 용액 20uL를 혼합물에 첨가하고, 37도에서 15분 동안 또 다른 인큐베이션 기간을 실행하였다. 그런 다음, 0.2M 탄산나트륨 용액 80μL를 혼합물에 첨가하여 반응을 종료시켰다. 흡광도는 405 nm에서 측정되었습니다. 다른 농도의 케르세틴 용액을 기준으로 사용했습니다. 결과는 Cistus 종의 수성 추출물의 ND 및 IN 샘플의 1 mg/mL 및 0.5 mg/mL 농도에서 억제 활성의 백분율로 추정되었습니다.
4.11.2. -아밀라아제 억제 활성
-Cistus 종의 수성 추출물에서 얻은 소화되지 않고 생체이용 가능한 샘플의 아밀라아제 억제 활성은 Balan et al.[56]에 의해 이전에 자세히 설명된 절차에 따라 결정되었습니다. 샘플의 α-아밀라아제 억제 활성의 분광광도 측정은 DNS(3,{5}}dinitrosalicylic acid) 시약을 사용하여 수행되었습니다. 상기 방법에서 기술한 바와 같이, 전분의 전환에 의해 맥아당이 생성되고, 전분에서 생성되는 맥아당으로 인해 알칼리성 DNS의 황색이 주황-적색으로 변한다. 따라서 나트륨 칼륨 타르타르산나트륨 용액(2M NaOH에 용해)과 일정량의 DNS(증류수에 용해)를 혼합하여 96mM DNS 용액을 제조하였다. 그런 다음, 2{32}}6.7mM NaCl(α-아밀라아제 효소의 보조인자)을 포함하는 2mM 인산나트륨 완충액을 20도(pH:6.9)에서 제조하였다. α-아밀라아제 효소(1U/mL)와 전분(10mg/mL)을 이 완충액에 녹였습니다. 그 후, 50 μL의 인산나트륨 완충액과 10 μL의 α-아밀라아제 효소 용액을 20 μL의 샘플 용액과 혼합하였다. 이 혼합물을 37도에서 45분 동안 인큐베이션했습니다. 인큐베이션 기간 후, 20 μL의 전분 용액을 혼합물에 첨가하였다. 또 다른 인큐베이션 기간은 37도에서 45분 동안 시작되었습니다. "샘플 배경"이라고 하는 o-아밀라아제 효소 용액을 추가하지 않고 동일한 절차를 샘플에 적용했습니다. 대조군은 샘플 용액이 없는 동일한 절차로 연구했습니다. 흡광도는 540 nm에서 측정되었습니다. Acarbose는 다른 농도의 기준 용액으로 사용되었습니다. 결과는 Cistus 종의 수성 추출물에서 얻은 ND 및 IN 샘플의 1mg/mL 및 0.5mg/mL 농도에서 억제 활성의 백분율로 표시되었습니다. 4.11.3.AGE 억제 활동
Cistus 종의 수성 추출물로부터의 소화되지 않고 생체이용 가능한 샘플의 AGE 억제 활성은 Starow-icz et al. [57]. 모든 공정 전에 1 mg/mL 및 0.5 mg/mL 농도의 ND 및 IN 샘플을 새로 준비했습니다. 그런 다음, 10mg/mL 농도의 소 혈청 알부민(BSA) 용액 1mL를 ND 및 IN 샘플 용액 1mL에 첨가했습니다. 대조 시료는 ND 및 IN 시료 용액을 첨가하지 않고 제조하였고, 블랭크 시료는 0.5M 포도당을 첨가하지 않고 제조하였다. 그 다음, 준비된 모든 샘플을 55도의 진탕 수조에서 40시간 동안 인큐베이션하였다. 배양 기간이 끝난 후 Thermo Scientific™ VarioskanTMLUX 다중 모드 마이크로플레이트 판독기를 370 nm 여기/440 nm 방출 범위에서 사용하여 형광 강도를 계산했습니다. 퀘르세틴은 다른 농도에서 참조 용액으로 사용되었습니다.
5. 결론
현재 연구에서 터키 식물에 기록된 모든 Cistus 종의 수성 추출물은 페놀 프로파일과 시험관 내 항산화 및 항당뇨병 잠재력에 대해 조사되었습니다. 달이거나 주입하는 것이 전통 의학의 일반적인 형태이기 때문에 실험 연구에서 활성 평가를 위해 수성 추출물을 사용하는 것이 특히 중요합니다. 반면에, 수성 추출물의 친수성 성분은 일단 섭취되면 위장 시스템에서 일련의 대사 변형을 겪습니다. 따라서 전통적인 제형의 정확한 활성 평가를 위해서는 생체이용 가능한 대사 산물의 활성도 조사해야 합니다.
이것은 터키 시스투스 종에 대한 체외 인간 소화 시뮬레이션 방법의 결과를 조사한 첫 번째 연구입니다. 또한 이 연구에서 AGEs에 대한 터키 시스투스(Turkish Cistus) 종의 억제 가능성이 처음으로 연구되었습니다. 또한 salidroside, hyperoside 및 quercitrin은 마커 플라보노이드로 지정되었으며 농도 변화는 시험관 내 소화 절차에서 모니터링되었습니다. 추출물의 페놀 함량과 항당뇨병 및 항산화 활성은 위장 소화 절차에 의해 부정적인 영향을 받았지만 여전히 상당한 생체 활성을 나타냈습니다. 그 결과 C. salviifolius 추출물이 페놀 함량과 항산화 및 항당뇨 활성 측면에서 가장 강력한 식물로 검출되었다. 결론적으로, 터키 시스투스 종의 공중 부분은 풍부한 페놀 함량과 잠재적인 항산화 및 항당뇨 활성을 가지고 있습니다. 생체 이용률을 평가하기 위해 시험관 내 소화 시뮬레이션 방법이 사용되었지만 유기체에서 발생하는 대사 경로를 완전히 모방하지 않을 수 있습니다. 따라서 페놀 화합물의 생체이용률과 보고된 약리학적 효과에 대한 기여도를 자세히 평가하기 위해서는 추가적인 생체 내 및 임상 연구가 필요합니다.
저자 기여:개념화, YI, EC, EY; 방법론, YI, SA, IK, EC 형식 분석, YI, IK.-C., SA; 조사, YI, IK.-C, SA; 자원, YI, IK.SA, EC 및 EY; 데이터 큐레이션, YI, IK-C., SA; 쓰기--YI, 쓰기-검토 및 편집, YI, EC, EY; 시각화, YI; 감독, EC 및 EY모든 저자는 출판된 원고 버전을 읽고 동의했습니다.
자금:이 연구는 외부 자금 지원을 받지 않았습니다. 기관 검토 위원회 성명서: 해당 없음. 사전 동의서: 해당 사항 없음.
데이터 가용성 설명:이 연구에 제공된 데이터는 교신저자의 요청에 따라 제공됩니다.
이해 상충:저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
샘플 가용성:화합물의 샘플은 저자로부터 입수할 수 없습니다.
이 기사는 Molecules 2021, 26, 5322에서 발췌했습니다. https://doi.org/10.3390/molecules26175322 https://www.mdpi.com/journal/molecules