PART 1 빗자루(Orobanche Caryophyllacea, Phelipanche Arenaria 및 P. Ramosa)에서 분리한 Phenylpropanoid 배당체의 항산화 및 항응고 효과

Bartosz Skalski a, Sylwia Pawelec b, Dariusz Jedrejek b, Agata Rolnik a, Rostyslav Pietukhov a,

Renata Piwowarczyk c, Anna Stochmal b, Beata Olas a,*

a University of Ło´d´z, 일반 생화학과, 생물학 및 환경 보호 학부, 90-236 Ł´od´z, 폴란드

b 폴란드 24-100 Puławy 주립 연구소 토양 과학 및 식물 재배 연구소 생화학 및 작물 품질부

생물다양성 연구 및 보존 센터, 환경 생물학, 생물학 연구소, Jan Kochanowski University, 25-406 Kielce, 폴란드

추상적인

다음을 포함하는 Orobnchaceae의 홀로 기생 식물시스탄체, Orobanche 및 Phelipanche spp는 페닐프로파노이드 배당체(PPG)가 풍부한 것으로 알려져 있습니다. 많은 PPG 화합물은 항균, 항염, 항산화 및 기억력 향상과 같은 광범위한 활성을 갖는 것으로 밝혀졌습니다. 유럽 ​​빗자루(O. Caryophyllaceae – OC, P. Arenaria – PA, P. ramosa – PR) 및 10개의 단일 분리된 페닐프로파노이드 성분의 생체 활성 가능성을 더 잘 조사하기 위해 우리는 시험관 내 시스템에서 혈장 산화에 대한 항라디칼 작용, 보호 효과를 조사했습니다. , 및 응고 매개변수에 대한 영향. 테스트된 추출물은 Trolox 파워의 50-70%의 소거 활성을 보여주었습니다. 풍부한 OC추출물악티오사이드, 아실 단위에 B-고리 카테콜 부분이 없는 PPG를 함유한 유일한 추출물인 PR 추출물보다 20% 이상 더 나은 항라디칼 잠재력을 가졌습니다. 더욱이, 8개의 시험된 PPG만이 H2O2/Fe로 처리된 인간 혈장에서 항산화 잠재력을 입증한 것으로 밝혀졌습니다. 그러나 테스트된 3개의 PPG는 항산화 특성 외에도 항응고 가능성을 가지고 있었습니다. PPG의 구조, 특히 아실 및 카테콜 부분의 존재는 주로 항산화 특성과 관련이 있는 것으로 보입니다. 이러한 화합물의 항응고 가능성은 화학 구조와도 관련이 있습니다. 선택된 PPG는 산화 스트레스와 관련된 심혈관 질환을 치료할 가능성을 보여줍니다.

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시스탄체세뇨관에는 많은 효과가 있습니다

1. 소개

산화 스트레스는 노화 가속화 및 일부 암을 포함하여 살아있는 유기체의 건강에 부정적인 영향을 미치는 것으로 널리 알려져 있습니다. 산화 스트레스의 발생은 신체 세포의 산화 및 항산화 메커니즘(효소적(카탈라제, 글루타티온 퍼옥시다제) 및 비효소적(글루타티온) 방어 포함) 사이의 균형이 깨지는 것과 관련이 있습니다[1]. 산화 라디칼 및 닫힌 껍질 종을 포함한 활성 산소 종(ROS)의 과잉 생산은 산화 스트레스 형성의 주요 메커니즘 중 하나입니다. 그러나 ROS에 의한 생물학적 영향은 농도, 노출 시간 및 위치에 크게 좌우됩니다. 정상적인 조건(낮은 농도)에서 산소/질소 라디칼은 2차 메신저 역할을 할 수 있지만 더 높은 수준에서는 세포막과 같은 생물학적 구조와 반응하기 시작할 수 있습니다[2]. 모든 ROS 종 중에서 하이드록실 라디칼(H2O.)은 생체 거대 분자인 단백질, 지질 및 DNA에 가장 큰 손상을 일으키고 있습니다. 산화 스트레스는 심혈관 질환을 포함한 다양한 질병에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있습니다. 혈액 시스템의 장애는 지혈 및 혈장 바이오마커의 다양한 매개변수의 변화에 ​​의해 연관되고/되거나 선행되었습니다[1,3].

한편, 폴리페놀 및 다중불포화 지방산과 같은 많은 천연 물질은 활성 산소 종의 형성 및/또는 감소를 방지할 수 있는 강력한 항산화제로 확인되었습니다. 이러한 특성을 갖는 화합물은 많은 식품 및 식물 기원의 제약 제제에서 발견됩니다. 따라서 신선한 야채와 과일이 풍부한 식단과 천연 항산화제를 기반으로 한 항산화 요법은 산화 스트레스 수준을 낮추고 다양한 병태생리학적 과정을 예방할 수 있기 때문에 널리 권장됩니다[4,5]. 식물성 폴리페놀은 2차 대사산물의 다양한 그룹으로, 그 중 페놀산은 널리 분포되어 있으며 항균, 항산화, 항염증과 같은 다양한 생물학적 효과를 나타내므로 중요한 위치를 차지합니다. Phenylpropanoid glycosides(PPGs)는 hydroxycinnamic acid의 에스테르 유도체이며, 다음을 포함하여 홀로기생하는 Orobanchaceae 식물에 존재하는 주요/유일한 부류의 2차 대사산물입니다.시스탄체, Orobanche 및 Phelipanche spp. 이 과의 여러 종은 농부들이 들판에서 없애고 싶어하는 심각한 작물 해충이며(Phelipanche ramosa의 예), 약리학에서는 거의 사용되지 않지만 대부분은 인간에게 거의 중요하지 않습니다. 허바시스탄체아시아 전통 의학에서 신장 결핍증의 치료와 면역 및 기억력 향상, 노화 방지 및 피로 방지제로 광범위하게 사용됩니다[6]. 다양한 연구 그룹의 식물화학적 분석은 아세토니드, 에키나코사이드, 포디움 사이드와 같은 페닐프로파노이드 배당체가 Herba Cistanche의 주요 활성 성분 중 하나임을 입증했습니다[7]. Jedrejek et al.에 의해 폴란드에서 발견된 여러 빗자루 종에 대한 최근 연구. [8]은 이 식물 재료가 유사한 질적 구성(PPG의 지배)을 갖고 있으며, 더 나아가 동등하거나 심지어 초과하는 것으로 나타났습니다.시스탄체종 활성 물질의 함량 측면에서 [8].

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본 연구는 다양한 페닐이 풍부한 3가지 빗자루 추출물(Orobanche Caryophyllaceae – OC, Phelipanache Arenaria – PA, P. ramosa – PR)의 항라디칼 및 항산화 잠재력과 지혈 매개변수에 미치는 영향을 평가하는 것을 목적으로 했습니다. -

프로스타노이드 및 이들의 단일 PPG 구성성분. 항라디칼 용량은 2,2'-azinobis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid/Trolox Equivalent(ABTS/TE) 및 2,2-diphenyl-1-picrylhybrazil(DPPH)을 사용하여 측정되었습니다. ) 테스트. 수산기(H2O2/Fe)를 이용하여 혈장 시험계의 산화적 스트레스를 유도한 후 지질과산화(TBARS(thiobarbituric acid-reactive species) 분석), protein carbonyl과 thiol의 농도를 측정하였다. 결정된 지혈 매개변수 중에는 활성 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT), 프로트롬빈 시간(PT) 및 트롬빈 시간(TT)이 있습니다.

2. 재료 및 방법

2.1. 화학

2,{1}}디페닐{2}}피크릴히드라질 라디칼(DPPH), 2,2'-아지노비스-3-에틸벤즈티아졸린{8}}술폰산(ABTS), 과황산칼륨, {{9 }}하이드록시{10}},5,7,{13}}테트라메틸크로만{14}}카복실산(Trolox), 디메틸설폭사이드(DMSO), 티오바르비투르산(TBA), 포름산(LC-MS 등급), 및 H2O2는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입했습니다. 메탄올(HPLC 구배 등급) 및 아세토니트릴(LC-MS 등급)은 Merck(Darmstadt, Germany)에서 구입했습니다. 텐페닐-

2'-O-acetylacteoside(97%), 2'-O-acetylpoliumoside(98%), 3-O-methylpoliumoside(96%), acetonide(99%), 경기장을 포함한 이 작업에서 테스트된 프로판 화합물 내부(97%), crenatoside(98%), teniposide(99%), poliumoside(99%), tubuloside A(96%) 및 wiedemannioside D(96%)는 이전에 아래 주어진 식물 재료에서 분리되었습니다. 8]. 화합물의 순도는 UHPLC-PDA-MS 분석을 사용하여 평가되었습니다. Milli-Q 정수 시스템(Millipore Co.)을 사용하여 사내에서 초순수를 제조했습니다. 다른 시약은 분석 등급이었고 국내 상업적 공급업체에서 제공했습니다.

2.2. 식물 재료

Orobanche Caryophyllaceae Sm., Phelipanche Arenaria Pomel 및 P. Ramos (L.) Pomel을 포함한 3종의 빗자루 꽃 식물이 prof에 의해 식별되었습니다. Renata Piwowarczyk(Jan Kochanowski University, Kielce, Poland) 및 폴란드의 천연 자원에서 수집됨.

바우처 표본(O. Caryophyllaceae – Chomento'wek (50.3349ºN, 20.4000ºE), 고온 초원, 기생 Galium boreale, 2014년 5월; P. Arenaria – Zwierzyniec (50.3652ºN, 22.5801ºE) 초원 및-5801◦E 휴경, 기생 Artemisia campestris, 2014년 6월;

P. ramosa – Szewce(50.3553◦N, 22.3038◦E), 들판, 기생 Solanum Lycopersicum, 2014년 9월)는 Kielce(KTC)의 Jan Kochanowski University 식물 표본관에 기탁되어 있습니다. 식물 재료는 추출 전에 동결 건조되고 미세하게 분쇄되었습니다.

2.3. 빗자루 추출물의 제조

분말 식물 재료(O. Caryophyllaceae(OC) – 2g, P. Arenaria(PA) – 3g 및 P. ramosa(PR) – 3g)는 40ºC 및 1500psi(용매 압력)에서 80% MeOH로 추출되었습니다. ) ASE 200 가속 사용

용매 추출기(Dionex, Sunnyvale, CA, USA). 추출물을 증발시키고 동결 건조시켰다(Gamma 2-16 LSC 동결 건조기, Christ, Germany). OC, PA 및 PR에 대한 추출 효율은 각각 식물 재료의 중량을 기준으로 55%, 37% 및 43%였습니다. 탄수화물 함량이 높기 때문에(데이터는 표시되지 않음), 미가공 추출물은 Oasis HLB 마이크로 컬럼(500mg; Waters, Milford, MA, USA)에서 고체상 추출(SPE)에 의해 추가로 정제되었습니다. 당을 1% MeOH로 제거한 다음 관심 화합물을 80% MeOH로 용리했습니다. 용매를 제거한 후 OC, PA 및 PR 추출물을 동결건조(Gamma 2-16 LSC 동결건조기)하였으며, SPE 정제 수율은 53%(OC), 67%(PA), 51%(PR)였습니다. .

2.4. 빗자루 추출물의 식물화학적 특성

빗자루 추출물의 정성 및 정량 분석은 광다이오드 어레이 검출기(PDA) 및 직렬 사중극자 질량 분석기(TQD-MS/MS)에 연결된 ACQUITY UPLC 시스템(Waters)을 사용하여 수행되었습니다. 동결 건조된 OC, PA 및 PR 추출물을 50% 메탄올에 0.50 mg/mL 농도로 용해한 다음

BEH C18 컬럼(100 × 2.1 mm, 1.7 µm, Waters)에서 크로마토그래피. 크로마토그래피 조건은 다음과 같습니다. 오븐 온도 – 25 ºC,

선형 구배 10→이동상 A의 이동상 B의 25%(0아세토니트릴 중 .1% 포름산)(0H2O 중 0.1% 포름산) 12에 대해 분, 유속 – 0.4 mL/min, 주입 부피 – 2 μL, UV 범위 – 190–490 nm(3.6 nm 분해능). MS 분석은 다음 설정을 사용하여 전자분무 이온화(ESI)가 있는 음이온 모드에서 수행되었습니다. 스캔 범위 100–1200 m/z; 모세관 전압 2.8kV; 콘 전압 35V;

소스 온도 150ºC; 탈용매 온도 450℃; 탈용매화

가스 유량 900L/h, 원추형 가스 유량 100L/h. 데이터 수집 및 처리는 Waters MassLynx 4.1 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다.

PPG(Phenylpropanoid glycoside) 피크는 얻은 LC-MS 데이터를 이전에 분리된 화합물의 데이터와 비교하여 확인했습니다[8]. 빗자루 추출물에서 PPG의 정량은 330 nm에서 검출하는 UPLC-UV 방법과 다음을 사용한 외부 표준 보정을 기반으로 했습니다.악티오사이드(Sigma-Aldrich, 99%, HPLC)

그룹 기준. 선형 검량선은 1–200 ug/mL 범위 내에서 6가지 농도로 작성되었으며 좋은 선형성을 나타냈습니다(R2

0.999). 정량적 결과는 3회 주입의 평균 SD 값을 나타내며 밀리그램으로 표시되었습니다.악티오사이드추출물 그램당 당량(eq)(mg악티오사이드당량/g).

2.5. 시험관 내 항라디칼 활성

2.5.1. ABTS 라디칼 소거 분석

ABTS 항라디칼 테스트는 Kontek et al. [9], 다음과 같이 약간 수정되었습니다. 20% MeOH를 사용하여 시약(7mM ABTS 및 4.9mM 칼륨 per-

황산염); 100~400ug/mL 범위의 4가지 농도 수준에서 OC, PA 및 PR 추출물의 용액과 10 250 ug/mL 범위의 6가지 농도 수준에서 Trolox 용액을 다음과 같이 준비했습니다. 50% MeOH. ABTS 작업 용액에 대한 샘플의 비율은 1:25(v/v)였습니다. 734 nm에서의 흡광도는 30분 배양 후 측정되었습니다.

UV-vis 분광광도계(Evolution 260 Bio,

Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA).

흡광도 억제(%)는 다음과 같이 계산되었습니다.

trol-Abssample)/Abscontrol] ×100.

빗자루 추출물의 Trolox 등가물(TE)이 계산되었습니다.

공식 TE=msample/mstandard 사용, 여기서 m은 직선의 기울기

선 곡선(흡광도 억제 대 농도). 의 TE 값

샘플은 Trolox에 대한 정규화된 활동을 설명합니다(TEstandard =

1.0). OC, PA, PR 추출물과 Trolox에 대한 IC50 값은 다음과 같습니다.

실험적으로 도달 한 다음 직선에서 계산되었습니다.

곡선(흡광도 억제 대 농도)은 다음과 같이 표시됩니다.

ug/mL.

분석은 삼중으로 수행되었으며 결과가 표시됩니다.

± 표준 편차(SD)를 의미합니다.

2.5.2. DPPH 라디칼 소거 분석

DPPH 항라디칼 시험은 Jedrejek et al. [8] 및 Brand-Williams et al. [10], 다음과 같이 약간 수정: 50▽ 250 ug/mL 범위의 4가지 농도 수준에서 OC, PA 및 PR 추출물 용액과 10▽ 범위의 6가지 농도 수준에서 Trolox 용액 250ug/mL는 50% MeOH로 제조되었습니다. 샘플 대 DPPH의 비율은 1:19(v/v)였습니다. 517 nm에서의 흡광도는 UV-vis 분광광도계(Evolution 260 Bio)를 사용하여 어둠 속에서 30분 동안 배양한 후 측정되었습니다. 흡광도 억제(%)는 [(Absecontroll-Abssample)/Abscontrol] × 100과 같이 계산되었습니다. 테스트 샘플의 Trolox Equivalent(TE) 및 IC50 값은 ABTS 테스트(섹션 2.5.1)와 동일한 방식으로 계산되었습니다. 분석은 3회 수행되었으며 결과는 평균 ± SD로 표시됩니다.

2.6. 인간 혈장 실험을 위한 테스트된 식물 화합물 및 추출물의 스톡 솔루션

테스트된 화합물과 식물 추출물의 스톡 용액은 5{1}}% DMSO에서 준비되었습니다. 테스트된 샘플에서 DMSO의 최종 농도는 0.05% 미만이었고 그 영향은 모든 실험에서 결정되었습니다.

2.7. 인간 혈장 분리

인간 혈액 또는 혈장은 혈액 은행(폴란드 Lodz) 및 의료 센터(폴란드 Lodz)에 6명의 일반 기증자(비흡연 남성 및 여성)로부터 채취되었습니다. 혈액은 CPD 용액(citrate/phosphate/dextrose; 9:1; v/v blood/CPD) 또는 CPDA 용액(citrate/phosphate/dextrose/adenine; 8.5:1; v/v; blood/CPDA)으로 수집되었습니다. 기증자는 기증 전 최소 2주 동안 약물이나 중독성 물질(담배, 알코올 및 항산화 보충제 포함)을 복용하지 않았습니다. 혈액 샘플 분석은 인간 연구를 위한 헬싱키 선언의 지침에 따라 수행되었으며 Lodz 대학의 인간 실험 연구 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 혈장은 실온에서 25분 동안 4500xg에서 신선한 인간 혈액을 원심분리하여 준비했습니다. 단백질 농도는 Whitaker and Granum의 절차에 따라 280 nm에서 시험된 샘플의 흡광도를 측정하여 계산되었습니다[11].

2.8. 인간 혈장의 산화 스트레스 지표

2.8.1. 지질 과산화 측정

혈장 지질 과산화는 TBARS(티오바르비투르산 반응성 물질)의 농도를 측정하여 정량화했습니다. TBARS 농도는 몰 흡광 계수(ε=156,000 M 1 cm 1 )를 사용하여 계산되었습니다. 방법은 [12,13]에 더 자세히 설명되어 있습니다. 2.8.2. 카르보닐기 측정 카르보닐기의 수준은 몰 흡광 계수(ε=22,{10}} M 1 cm 1 )를 사용하여 계산되었으며 Bartosz[ 13] 및 Levine et al. [14]. 2.8.3. 티올기 측정 혈장 단백질의 티올기 함량은 SPECTROstar Nano Microplate Reader(BMG LABTECH, Germany)를 사용하여 5,5' -dithiol-bis-(2- nitrobenzoic acid)를 사용하여 412 nm에서 흡광도를 측정하여 분광광도계로 측정했습니다. 이 방법은 다른 곳에서 더 자세히 설명되어 있습니다[15-17].

2.9. 지혈의 매개변수

2.9.1. 프로트롬빈 시간(PT) 측정

PT는 시신경 응고를 사용하여 응고 측정법으로 결정되었습니다.

문자는 Tukey 검정(p < 0.05)의 결과를 나타내며 값은 동일합니다.

행 안의 문자는 크게 다르지 않습니다.

2.9.2. 트롬빈 시간(TT) 측정

TT는 Malinowska et al.에 의해 기술된 방법에 따라 광학 응고 분석기(모델 K{0}}, Kselmed, Grudziadz, 폴란드)를 사용하여 응고 측정법으로 결정되었습니다. [18].

2.9.3. 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT) 측정

APTT는 Mali now ska et al에 따라 K{0}} Optic Coagulation Analyzer(Kselmed, Grudziadz, Poland)를 사용하여 응고 측정법으로 결정되었습니다. [18].

2.10. 데이터 분석 불확실한 데이터를 제거하기 위해 Q-Dixon 테스트를 수행했습니다.

데이터는 Shapiro-Wilk 테스트로 정규 분포에 대해 테스트하고 Levene 테스트로 분산 동등성을 테스트했습니다. 통계적으로 유의한 차이는 ANOVA를 사용하여 식별한 다음 Tukey의 다중 비교 테스트 또는 Kruskal-Wallis 테스트를 사용했습니다. 비교는 p < 0.05에서="" 유의미한="" 것으로="" 간주되었습니다.="" 값은="" 평균="" ±="" sd/sem으로="">