Xican Li 1,2,*,† ID , Yulu Xie 1,2,†, Ke Li 3,4, Aizhi Wu 1,2,*, Hong Xie 1,2, Qian Guo 1,5,

Penghui Xue 1, Yerkingul Maleshibek 1, Wei Zhao 6, Jiasong Guo 7 및 Dongfeng Chen 3,4

접촉:joanna.jia@wecistanche.com

1 중국 약초 학교, 광저우 한의학 대학, 광저우 510006, 중국; xieyulu1900@163.com (Y.X.); xiehongxh1@163.com (H.X.); 15622178307@163.com (Q.G.); 15228738137@163.com (P.X.); pandiphd@163.com (Y.M.)

2 TCM의 혁신적인 연구 및 개발 실험실, 광저우 중국 의학 대학,

광저우 510006, 중국

3 기초 의학 대학, 광저우 중국 의학 대학, 광저우 510006, 중국; ys1090992678@163.com (K.L.); chen888@gzucm.edu.cn (D.C.)

4 기본 통합 의학의 연구 센터, 광저우 중국 의과 대학,

광저우 510006, 중국

5 기초 의학 대학, 광동 제약 대학, 광저우 510007, 중국

6 중산 의과 대학, Sun Yat-sen University, No. 74 Zhongshan Road. 2, 광저우 510080, 중국; zhaowei23@mail.sysu.edu.cn

7 조직학 및 발생학과, 남부 의과 대학, 광저우 510515, 중국;

†이 저자들은 이 작품에 똑같이 기여했다.

접수: 2018년 1월 24일; 수락: 2018년 2월 20일; 게시 날짜: 2018년 2월 23일

개요 : 이 연구는 설탕 잔류 물의 역할과 페놀의 메커니즘을 탐구하려고 노력했습니다.페닐프로파노이드산화 방지 제.액테오사이드, 그것의 apioside forsythoside B와 rhamnoside와 함께

폴리우모시드는, 다양한 항산화제 검정을 사용하여 비교적 조사하였다. 세 가지 전자 전달 (ET) 기반 분석 (FRAP, CUPRAC, PTIO·-scavenging at pH 4.5)에서 상대적 항산화 수준은 대략 다음과 같이 지배되었습니다.액테오사이드>forsythoside B> 소아마비 사이드입니다. 이러한 순서는 또한

pH 7.4에서의 H+-전사-관여 PTIO·-소거검정, 및 세 가지 다중 경로-관여 라디칼-소거검정, 즉 ABTS+·-소거, DPPH·-소거, 및 · O2.-scavenging. UV-vis 스펙트럼에서, 그들 각각은 Fe2+와 혼합되었을 때 335 364 nm에서 적색 편이를 나타내고 두 개의 약한 피크 (480 및 719 nm)를 나타냈다. 그렇지만액테오사이드가장 약한 흡수를주었습니다.

전기 분무 이온화 사중극자 비행 시간 탠덤 질량 분광법 (UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS) 분석과 결합 된 초고성능 액체 크로마토그래피에서는 라디칼 부가물 형성 (RAF) 피크가 발견되지 않았습니다. MTT 분석법은 폴리우모사이드가 산화적 스트레스 골수 유래 중간엽 줄기세포의 가장 높은 생존력을 나타냈다는 것을 밝혀냈다. 결론적으로,액테오사이드, 포시토시드 B 및 폴리우모시드는 ET, H+-전사, 또는 Fe2+-킬레이트화를 포함하는 항산화 작용을 발휘하는 다중 경로에 관여할 수 있지만, RAF는 아니다. ET 및 H+ 전달은 람노실 및 아피오실 잔기에 의해 방해될 수 있고; 그러나, Fe2+-킬레이트 전위는 2개의 당-잔기 (특히 람노실 모이어티)에 의해 강화될 수 있다. 람노실 및 아피오실 잔기의 일반적인 효과는 항산화제 또는 세포보호 효과를 향상시키는 것이다.

키워드:액테오사이드; 아피오실; 포시토사이드 B;페닐프로파노이드배당체; 폴리우모사이드; 람노실

cistanche는 산화 방지의 효력이 있습니다

1. 소개

최근에, 액테오사이드(verbascoside, 도 1), 페놀계페닐프로파노이드글리코시드버뱅 및 다른 식물에서 발생[1], 개 클로닝 과정 동안 송곳니 체세포 핵 전이 (SCNT)의 효율을 향상시키는 것으로 밝혀졌다 [2]. 또한, 액테오사이드는 X선 유발 손상으로부터 인간 아밀로이드 유발 손상[3] 및 인간 피부 섬유아세포로부터 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포를 보호할 수 α다[4]. 이의 아피오시드 포시토사이드 B(도 1)는 또한 식물에 분포하며[5], 유리한 치료 시간 창으로 강력한 신경 보호 효과를 발휘하는 것으로 관찰되었다[6]. 세포 및 조직에 대한 이러한 유익한 효과는 지질 및 DNA와 같은 일부 생체 분자의 보호와 관련이있는 것으로 생각됩니다. 실제로, 액테오사이드와 그의 유사체 시스타노사이드 F는 래트에서 미토콘드리아 지질 과산화를 억제하는 것으로 입증되었다[7]. 지질 과산화는 세포 산화 스트레스의 결과이며 궁극적으로 반응성 산소 종 (ROS)으로부터의 것으로 알려져 있습니다.

그림 1. 세 가지 자연의 구조 (왼쪽)와 우대 형태 기반 볼 앤 스틱 모델 (오른쪽)페닐프로파노이드배당체(acteoside, forsythoside B 및 poliumoside).

DNA 보호 측면에서, 액테오시드 및 그의 유도체는 DNA 라디칼, 예컨대 2'-데옥시아데노신-5'-모노포스페이트 (dAMP) 및 2'-데옥시구아노신-5'-모노포스페이트 (dGMP)를 신속하게 복구할 수 있다[8]. 이러한 이차 데옥시뉴클레오타이드 라디칼은 돌연변이유발 및 발암을 유도하는 세포를 추가로 산화적으로 손상시킬 수 있다[9]. 생물 물리학 적 연구에 따르면 acteoside와 그 유도체는 DNA 사소한 홈에 도킹되어 그러한 산화 적 DNA 손상을 신속하게 복구 할 수 있습니다 [10]. 우선-입체 형태-기반 볼-스틱 모델은 이러한 분자들이 프로폴드되어 DNA의 루프에 쉽게 도달할 수 있고, 따라서 DNA 라디칼의 손상을 신속하게 복구할 수 있다고 제안한다(그림 1, 오른쪽).

그러나, 생화학의 관점에서, 복구는 본질적으로 ROS-소거(즉, 항산화제) 경로를 통해 성취된다. 앞서 언급한 바와 같이, 데옥시뉴클레오타이드 라디칼 양이온의 생성은 궁극적으로 자유 라디칼을 포함하는 ROS의 공격으로부터 (예를 들어, · OH 라디칼 [11]) 및 산화제 분자 (예를 들어, H2O2 [12]). ROS-소거는 세포 산화 상태를 효율적으로 낮추고 [13,14] 줄기 세포의 품질을 향상시키는 것으로 생각됩니다 [12,15]. 따라서 항산화 능력을 연구하고 가능한 메커니즘을 더 논의 할 필요가 있습니다.

이 연구에서, 세 페놀페닐프로파노이드배당체(액테오시드, 포시토시드 B 및 폴리우모시드)은 2-페닐-4,4,5,5-테트라메틸이미다졸린-1-옥실-3-산화물 라디칼(PTIO·) 소거분석, 제2철 이온 환원 산화방지력(FRAP) 분석법, 큐프리크 환원 산화방지능(CUPRAC) 분석법, 2,2→-아지노비스(3-에틸벤젠-티아졸린-6-설폰산 라디칼(ABTS+·) 소거법을 포함하는 다양한 항산화 분석법을 사용하여 비교 조사하였다.

1,1-디페닐-2-피크릴-히드라진(DPPH·) 분석 및 · O2.-스캐빈징 분석 및 Fe2+-킬레이트화 UV-스펙트럼 분석. 그 후, DPPH· 전기 분무 이온화 사중극자 비행 시간 탠덤 질량 분광법 (UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS) 분석과 결합 된 초고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 결정하였다. 마지막으로, 골수 유래 중간엽 줄기세포(bmMSCs)에 대한 이들의 세포보호 효과는

3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 (MTT) 분석. 도 1에서 보는 바와 같이, 세 페놀의 차이페닐프로파노이드배당체(즉, 액테오사이드, 포시토시드 B, 및 폴리우모시드)는 글리코시드 타입이다: 포시토시드 B는 액테오사이드의 아피오사이드이고, 폴리우모사이드는 액테오사이드의 람노사이드이다. 따라서,이 비교 연구는 또한 apiosyl과 rhamnosyl의 역할을 이해하는 데 도움이됩니다.항 산화효과.

항산화에 대한 피부에 대한 cistanche 미백 효과

2. 결과

2.1. 금속 환원 분석(FRAP & CUPRAC)

이 연구에서, 우리는 두 가지 금속 환원 분석, 즉 FRAP 분석과 CUPRAC 분석을 수행했습니다. Suppl. 1에 예시된 바와 같이, 액테오사이드와 그 유도체는 용량 의존적 방식으로 0-10 βg/L에서 상대적 FRAP(또는 Cu2+-환원력) 백분율을 증가시켰다. 상대적 금속-환원 수준의 이들의 순서는 액테오사이드 > 포스토사이드 B > 폴리우모시드의 순서로 대략 감소하였다(표 1).

표 1. 액테오사이드, 포시토사이드 B, 폴리우모사이드의 IC50 값은 다양하다.산화 방지 제분석.

2.2. PTIO·-청소 분석

PTIO·-청소 분석은 최근 우리 실험실에서 개발되었습니다 [16]. 그것은 항산화 수준을 평가하고 항산화 경로를 탐구하는 데 사용될 수 있습니다. Suppl. 1에서 볼 수 있듯이, 액테오사이드와 그 유도체는 PTIO· pH 4.5 및 pH 7.4에서. 그러나, 표 1의 IC50 값에 따르면, 동일한 pH 값에서의 이들의 상대적인 PTIO·-스캐빈징 수준은 서로 상이하였다. 또한, 각각의 액테오시드와 그 유도체는 pH 4.5와 pH 7.4 사이에서 상이한 PTIO·-스캐빈징 수준을 나타내었다. 일반적으로, 7.4에서의 PTIO·-소거능 수준은 pH 4.5에서의 것보다 높았다.

2.3. ABTS+·-청소 및 DPPH·-청소 분석

ABTS+·-scavenging 및 DPPH·-scavenging은 현재 순수 화합물 또는 추출물의 항산화 연구에 널리 사용되고 있습니다. Suppl. 1에서 볼 수 있듯이, 액테오사이드와 그 유도체 농도는 ABTS+·-스캐빈징 또는 DPPH·-스캐빈징 백분율을 의존적으로 증가시켰다.

그러나, 표 1의 IC50 값의 관점에서, 이들의 상대적인 ABTS+·-스캐빈징 수준은 악테오사이드 > 포스토토시드 B > 폴리우모사이드 > 트롤록스의 순서로 발견되었다. DPPH·-청소 분석에서도 유사한 순서가 관찰될 수 있었다.

2.4 UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS. DPPH· 반응 생성물

The reaction product of DPPH· 세 가지 각각과 함께페닐프로파노이드배당체UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS 분석을 사용하여 탐구되었습니다. 분석 (Suppl. 2)에서, 세 페닐 프로파노이드 배당체 중 어느 것도 RAF 생성물 피크를 생성하지 않았다. 비교해 보면, 카페산은 이량체 생성물을 산출하는 것으로 밝혀졌다 (m / z 359-360, Suppl. 2).

2.5. Fe2+-킬레이트화 제품의 UV-비스-스펙트럼 분석

UV-vis-spectra가 금속 착물을 특성화 할 수 있기 때문에이 연구는 UV-vis-spectra를 사용하여 세 가지로 가능한 Fe2 + 킬레이트 반응을 분석했습니다.페닐프로파노이드 배당체. 도 2에 도시된 바와 같이, 이들 각각은 UV 스펙트럼에서 목욕 변색 이동(335 nm●364 nm)을 생성할 수 있었다. 한편, 이들 각각은 가시 스펙트럼 (480nm 및 719nm)에서 두 개의 약한 비스 스펙트럼 피크를 제공하고 연한 녹색 외관을 유발할 수 있습니다. 그러나, 피크 강도는 폴리우모시드 > 포스토사이드 B > 액테오사이드의 내림차순이었다.

2.6. 슈퍼옥사이드 음이온에 대한 피로갈롤 자가산화 분석(· O2.) 청소

pyrogallol 자동 산화 분석은 2012 년에 우리 실험실에 의해 개선되었습니다 [17]. 를 추정하기 위해 사용되었다 · O2.-소거능은 본 연구에서 있다. Suppl. 1에서 볼 수 있듯이, 모든 액테오사이드와 그 유도체는 용량 의존적으로 · O2.-청소 백분율. 그러나, 표 1의 IC50 값에 따라 폴리우모시드 > 포시토시드 B >액터사이드의 상대적 생체활성이 감소하였다.

2.7. 산화적으로 스트레스를 받는 bmMSCs에 대한 세포 보호 효과 (MTT 분석)

액테오시드 및 그의 유도체의 세포 보호 효과를 평가하기 위해, 우리는 MTT 분석을 수행하였다. 분석에서, bmMSCs는 산화 시약 H2O2에 의해 손상되었고, 손상된 bmMSCs는 이어서 액테오시드 및 그의 유도체에 의해 처리되었다. A490nm 값을 사용하여 상대적인 세포보호 효과를 평가하였다. 표 2에서 보는 바와 같이, 각각의 액테오시드 및 그의 유도체는 용량-의존적으로 A490nm 값을 증가시켰다. 그러나, 동일한 농도에서, 폴리우모사이드는 가장 높은 A490nm 값을 생성하였다.

3. 토론

천연 페놀 화합물의 항산화 작용은 전자 전달(ET)에 관여하는 것으로 알려져 있다[18,19]. 따라서, 일부 ET 기반 금속-환원 검정은 FRAP 및 CUPRAC 분석과 같은 페놀학의 항산화 수준을 평가하기 위해 널리 사용되어 왔다. FRAP 분석 가이드라인은 3.6 미만의 pH로 이행되어야 한다. 이러한 산성 환경은 페놀류로부터의 H+ 이온화를 성공적으로 억제하였다; 따라서, FRAP 분석은 단순한 ET 공정으로 간주된다[20,21]. FRAP 분석에서 액테오사이드와 그 유도체의 유효성은 액테오사이드와 그 유도체가 다음과 같이 작용할 때를 의미한다.산화 방지 제, 그들은 항산화 작용을 발휘하기 위해 ET 경로를 사용할 수 있습니다.

게다가, 우리는 또한 pH 7.4 완충액에서 CUPRAC 분석을 수행했다. Suppl. 1에서 볼 수 있듯이, 액테오사이드와 그 유도체는 용량-의존적으로 그들의 Cu2+-환원 파워 퍼센트를 증가시켰으며, 이는 이들이 생리학적 pH에서 ET 전위를 유지할 수 있음을 나타낸다. 그러나, 이들의 ET 전위는 다음의 순서로 감소하였다: 액테오시드 > 포스토시드 B > 폴리우모시드(표 1). 이러한 역동성은 폴리우모시드의 포시토사이드 B 및 람노실 잔기의 아피오실 잔기가 ET 전위를 낮췄다는 것을 명백히 시사한다.

시스탄체는 티로시나제 억제제이다.

ET가 라디칼 소거과정 중에 발생할 가능성을 시험하기 위해, 산소 중심의 자유 라디칼 PTIO· 이 연구에서 소개되었다. 순환 전압전류법 증거는 pH 5.0 이하의 PTIO·-소거가 단일 전자-산화환원 반응이라는 것을 밝혀냈다[22]. 액테오사이드와 그 유도체가 PTIO· pH 4.5에서 라디칼은 라디칼 소거과정 동안 ET의 가능성을 시사한다. 분명히,이 발견은 FRAP 및 CUPRAC 분석에서 앞서 언급 한 결과와 공여 전자 (e)가 페놀의 특징이라는 이전 결과를 더욱 뒷받침합니다.산화 방지 제[23]. 그러나 생리학적 pH 7.4에서, PTIO-scavenging 에세이는 ET 경로일 뿐만 아니라 양성자-(H+) 전달 경로를 포함한다. 이 과정에서 PTIO는 페놀학으로부터 H+를 받아 생성물 피크([PTIO-H]+)를 생성하도록 제안되었다[16]. H+-전달은 항상 단계적 또는 동기식 메커니즘에서 ET를 수반하기 때문에[24], 현실적(또는 최종) 생성물은 [PTIO-H] 분자이다[22]. pH 7.4 (Suppl. 1)에서의 PTIO·-scavenging은 acteoside와 그 유도체가 H + 전달 잠재력을 가지고 있음을 의미합니다. 상기 IC50 값(표 1)은

상대적 H+-전달 전위는 액테오사이드 > 포스토사이드 B > 폴리우모사이드의 내림차순이었다. 분명히, 아피오실 및 람노실 잔기는 또한 항산화 과정 동안 H+-전달 전위를 약화시켰다.

앞서 논의한 바와 같이, 페놀학의 항산화 과정 동안, ET는 일반적으로 수소-원자 전달(HAT)[23,25-27], 순차적 전자-양성자 전달(SEPT)[26,27], 순차적 양성자 손실 단일 전자 전달(SPLET)[26], 양성자 결합 전자 전달(PCET)[24-26,28]과 같은 몇 가지 항산화 메커니즘을 형성하기 위해 양성자(H+) 전달을 수반한다.

예를 들어, 단일 전자 전달 (SET) [29]에 의해 지배되는 반응 인 ABTS + ·-scavenging은 최근 H + 수준에 의해 영향을받는 것으로 입증되었습니다 [30]. 따라서 ABTS+·-scavenging은 다중 경로 기반 항산화 분석이다[21,31]. 액테오사이드와 그 유도체가 ABTS+· 라디칼은 그들의 항산화 작용이 또한 다중 경로를 통해 매개될 수 있음을 나타낸다. 이 가설은 HAT, ET, SEPT 및 PCET 다중 경로를 포함하는 반응인 DPPH·-scavenging assay로부터의 증거에 의해 추가로 확인된다[26,32]. 그러나, IC50 값에 기초한 정량적 분석(표 1)은 다중 경로 기반 ABTS+·-소거와 DPPH·-소거면에서, 액테오사이드가 그의 아피오시드 포시토시드 B 및 람노사이드 폴리우모시드보다 우수하다는 것을 밝혀냈다. 따라서, 아피오실 및 람노실 잔기가 결국 자유 라디칼-소거-소거 과정 동안 다중 경로 전위(특히 ET 및 H+-전달)를 방해한다는 것이 추론될 수 있다. 저자와 다른 사람들 [14,26]에 의해 언급 된 바와 같이, 항산화 과정 중에 RAF 반응이 또한 발생할 수 있습니다. 그러나 RAF 가능성을 확인하려면 세 가지페닐프로파노이드배당체카페산과 함께 UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS 분석을 사용하여 연구하였다. 카페산은 이량체 생성물을 생산하는 것으로 밝혀졌으며, 세 가지페닐프로파노이드배당체RAF 제품의 피크를 생성하지 않았습니다.

이 발견은 분명히 세 가지를 암시합니다.페닐프로파노이드배당체그들의 항산화 작용을 발휘하기 위해 RAF 경로를 겪을 수 없습니다. 세 개의 페닐프로파노이드 배당체가 카페산의 에스테르로 간주될 수 있기 때문에(도 1), 카페산과 카페산 에스테르 사이의 이러한 차이는 또한 거대한 모이어티가 RAF의 생성을 방해할 수 있음을 나타낸다.

종합하면, 자유 라디칼-소거성 측면에서, 액테오시드 및 그의 유도체는 그들의 항산화 작용을 발휘하기 위해 다수의 경로를 겪을 수 있다. 이러한 항산화 경로는 적어도 ET 및 H + 전달 (RAF는 아님)에 관여합니다. 우리의 발견은 acteoside가 SPLET 경로를 통해 항산화 작용을 발휘할 수 있다는 이론적 연구에 의해 부분적으로 뒷받침됩니다. 이 과정에서 액테오사이드는 먼저 음이온을 생성하기 위해 디프로토네이트(H+-transfer)할 수 있다. 탈양성자화는 약한 산도를 갖는 카테콜 잔기에서 발생하는 것으로 생각된다. 이어서, 음이온은 페녹시 라디칼 형태를 발생시키기 위해 전자를 기증하였다[33]. 그러나 p-u 접합을 갖는 페녹시 라디칼은 어느 정도 안정하다. 물론,이 점에서 앞으로 더 많은 실험 작업이 필요합니다.

세포 산화 스트레스는 또한 전이 금속 (특히 Fe2 +)에서 비롯될 수 있음을 언급 할 가치가 있습니다. 그러나 Fe2+ 이온은 H2O2 분자를 가장 해로운 · 펜톤 반응을 통한 OH 라디칼(Fe2+H2O2●Fe3+· OH + OH.). 따라서, Fe2+ 수준의 감쇠는 효과적으로 억제할 수 있다· OH 라디칼은 세포 산화 스트레스를 방출한다. 사실, 천연 페놀에 의한 철 킬레이트화산화 방지 제이제 일부 산화 스트레스 질환에 대한 효과적인 치료법으로 개발되었습니다 [34,35].

본 연구에서, 액테오시드 및 그의 유도체는 분광법 및 용액 색상의 변화에 의해 효과적인 Fe2+-킬레이터로서 제안되었다(도 2). 그럼에도 불구하고, 액테오사이드는 아피오실 잔기를 갖는 Fe2+ 및 forsythoside B를 킬레이트화하는 2개의 글루코시드보다 열등하며, 람노실 모이어티를 갖는 폴리우모시드보다 열등하다. 이들의 우선적 입체형태(도 1, 오른쪽)의 비교에 기초하여, 아피오실(또는 람노실) 잔기가 주 리간드(페닐프로파노이드그룹)에서 Fe2+를 킬레이트화한다. 이러한 상승 효과는 의심 할 여지없이 Fe2 + 킬레이트 능력을 강화하고 UV-vis 피크를 확대합니다. 그러나, 람노실은 그것의 Fe2+-킬레이트화 능력에서 아피오실보다 더 효과적이다. 그 차이는 람노실이 헥소사이클릭 형태(즉, /-L-람노피라노실)에서 발생하는 반면, 아피오실은 펜타사이클릭 형태(즉, α-D-apiofuransyl)로 발생한다는 사실에 기인할 수 있다. 헥소사이클릭 형태는 더 크고 더 안정한 것으로 알려져 있다. 따라서, 헥소사이클릭 람노실은 그것의 Fe2+-킬레이트화 능력에서 펜타사이클릭 아피오실에 비해 더 효과적이다.

액테오사이드와 그 유도체가 ROS를 제거할 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 우리는 피로갈롤 자가분해 분석을 수행하였다. Suppl. 1에서 볼 수 있듯이, 모든 사람들은 효율적으로 · O2. 라디칼, 세포에서 발생하는 전형적인 ROS. 그러나, 상대적으로 생체활성은 폴리우모시드 > 포스토시드 B>액터사이드의 순으로 감소하였다. 이 순서는 또한 세포 보호 효과의 순서와 평행하다(표 2). 이러한 발견은 람노실 모이어티 또는 아피오실 모이어티의 일반적인 효과가 ROS 소거용 또는 세포보호 효과를 향상시키는 것임을 나타낸다.

시스탄체있다기능의미 백피부

4. 재료 및 방법

4.1. 화학 물질 및 동물

Acteoside (CAS 번호: 61276-17-3, 97%), forsythoside B (CAS 번호: 81525-13-5, 97%)를 BioBioPha (중국 쿤밍, Suppl. 3)로부터 수득하였다. 폴리우모사이드(CAS 번호: 94079-81-9, 97%)는 우리 팀에 의해 중국 전통 허브인 칼리카르파 페이 H.T. 창(Suppl. 3)으로부터 분리되었다. DPPH·, (o)-6-히드록실-2,5,7,8-테트라메틀리크로만-2-카복실산(트롤록스), 2,9-디메틸-1,10-페난트롤린(네오쿠프로인), 2,4,6-트리피리딜트리아진(TPTZ), 및 피로갈롤을 시그마-알드리치 상하이무역회사(중국 상하이)로부터 구입하였다. (NH4)2ABTS[2,2→-아지노비스(3-에틸벤젠티아졸린-6-설폰산디암모늄염)]를 암레스코 케미칼(솔론, 오하이오, 미국)로부터 얻었다. PTIO· 라디칼은 TCI Development Co., Ltd. (중국 상하이)로부터 구입하였다. 카페산은 국립 제약 및 생물 제품 통제 연구소 (중국 베이징)에서 구입했습니다. 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM), 태아 소 혈청(FBS) 및 트립신을 깁코(Grand Island, NY, USA)로부터 구입하였다. 아넥신 V/프로피듐 요오드화물 (PI) 분석 키트는 인비트로겐 (칼스배드, 캘리포니아, 미국)으로부터 구입하였다. 다른 모든 시약은 분석 등급이었다.

4주령의 Sprague-Dawley(SD) 래트를 광저우 한의과 대학의 동물 센터로부터 수득하였다. 이 실험의 프로토콜은 광저우 대학 (승인 번호 20170306A)의 기관 동물 윤리위원회의 감독하에 수행되었습니다.

4.2. 금속 저감 분석(FRAP & CUPRAC)

금속 환원 분석에는 Fe3+ 환원력 분석 및 Cu2+ 환원력 분석이 포함됩니다. Fe3+-환원 분석은 Benzie와 Strain에 의해 확립되었으며 공식적으로 FRAP로 명명되었습니다 [20]. 이 분석의 실험 프로토콜은 이전 보고서 [9]에 기술되었다. 간략하게, FRAP 시약은 pH 3.6에서 1:1:10의 비율로 10 mM TPTZ, 20 mM FeCl3, 및 0.25 M 아세테이트 완충액을 혼합함으로써 신선하게 제조되었다. 시험 샘플 (x = 4-20 βL, 0.05 mg/mL)을 95% 에탄올 중 (20 . x) βL에 첨가한 다음, FRAP 시약 80 βL를 첨가하였다. 주위 온도에서 30분 인큐베이션한 후, 마이크로플레이트 리더(Multiskan FC, Thermo Scientific, 상하이, 중국)를 사용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 샘플의 상대적 환원력은 다음 공식을 사용하여 계산하였다:

여기서 Amax는 샘플과의 반응 혼합물의 최대 흡광도이고, Amin은 시험에서 최소 흡광도이다. A는 샘플의 흡광도입니다.

Cu2+-환원력은 또한 항산화 수준을 특성화할 수 있으며, 따라서 CUPRA라고 불린다. 이 분석은 이전에 공개된 방법에 따라 수행되었다[36]. 간략하게, CuSO4 수용액 (10 mmol/L) 중 12 βL, 네오쿠프로인 에탄올 용액 12 βL (7.5 mmol/L) 및 CH3COONH4 완충 용액 (0.1 mol/L, pH 7.5)의 βL를 상이한 부피의 샘플 (0.05 mg/mL, 4-20 βL)을 갖는 웰에 첨가하였다. 30분 후 450 nm에서의 흡광도를 전술한 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 측정하였다. 상대적인 CUPRAC 파워는 FRAP에 대한 공식을 사용하여 계산되었다. Amax는 sa를 사용한 반응 혼합물의 최대 흡광도였다.mple, 및 Amin은 시험에서 최소 흡광도이다. A는 샘플의 흡광도입니다.

시스탄체피부를 미백하는 효과가 있습니다.

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