파트 1: 복제된 개를 생산하기 위한 세포 보호제로서의 악테오사이드의 효과
Mar 05, 2022
이지혜1☯, 천주란1☯, 김근정1, 김은영1, 김동희1, 이보명1, 한길우1, 박강선1, 이경본2, 김민규1*
1충남대학교 농업생명과학대학 축산낙농과학부, 대전, 대한민국,
2 사범대학 생물학교육과,전남대학교, 광주, 대한민국
연락하다:joanna.jia@wecistanche.com
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추상적인
체세포 핵 이식(SCNT)은 잘 알려진 실험실 기술입니다. SCNT의 원리는 핵이 제거된 수용 난모세포에 체세포를 주입하여 체핵을 재프로그래밍하는 것을 포함합니다. 따라서 핵 공여 세포는 SCNT에서 중요한 요소로 간주됩니다. G{1}}/G1 단계에서 핵 공여 세포의 세포 주기 동기화는 접촉 억제 또는 혈청 기아에 의해 유도될 수 있습니다. 본 연구에서는,악티오사이드페닐프로파노이드 배당체 화합물인 페닐프로파노이드 배당체 화합물이 송곳니 태아 섬유아세포에서 세포 주기 동기화, 세포 보호 및 SCNT 효율 개선에 적용 가능한지 여부를 조사했습니다. 일차 송곳니 태아 섬유아세포는악티오사이드(10, 30, 50 μM) 다양한 기간(24, 48, 72시간). G0/G1 단계에서 세포 주기 동기화는 유도 방법과 크게 다르지 않았습니다.악티오사이드치료, 접촉 억제 또는 혈청 기아. 그러나 이 세 가지 치료 중 혈청 기아는 활성 산소종(ROS) 수준(99.5 ± 0.3%)과 세포 사멸 수준을 유의하게 증가시켰습니다. 결과는 또한악티오사이드송곳니 태아 섬유아세포의 괴사를 포함한 ROS 및 세포자멸사 과정 감소 및 세포 생존 개선. 송곳니 태아 섬유아세포로 치료악티오사이드G{0}}/G1 단계에서 성공적으로 체포되었습니다. 또한, 액테오사이드를 처리한 핵공여체 세포를 이용하여 재건된 배아는 건강한 복제견을 생산했지만, 접촉억제된 핵공여체 세포를 사용하여 생산된 배아는 그렇지 않았다. 결론적으로,악티오사이드핵 기증자 세포의 유도된 세포 주기 동기화는 세포 보호 효과 때문에 개 SCNT의 효율성을 향상시키는 대안적인 방법이 될 것입니다.
Cistanche acteoside는 면역을 강화할 수 있습니다
소개
SCNT 기술은 농업 목적 및 생물 의학 자원으로 유전적으로 우수하거나 조작된 동물을 생산하는 데 사용되었습니다. 질병의 동물 모델, 멸종 위기에 처한 동물의 구조, 재생 의학을 위한 줄기 세포, 장기 이식 등의 필요성이 증가함에 따라 최근 SCNT를 이용한 동물 복제에 대한 관심이 증가하고 있다[1-5]. 복제 동물의 생산이 성공적이었음에도 불구하고 SCNT의 효율성은 여전히 매우 낮다[6]. 낮은 SCNT 배아 발달 능력의 원인은 수용 난모세포의 질, 핵 기증 세포의 질, 대리모의 상태와 관련된 많은 요인을 포함한다[7-10].
활성산소종(ROS)과 세포자멸사는 생체 내 및 시험관 내 난모세포 발달을 포함한 여성 생식 과정에 관여하는 것으로 알려져 있습니다[11-14]. ROS는 배아에서 세포질 응축, DNA 손상 및 세포자멸사를 유도하여 배아 발달을 방해합니다. 지원 연구에 따르면 ROS를 감소시키면 체외 배양 동안 SCNT 배아 발달 능력이 향상됩니다[15-17]. Apoptosis는 정상적인 착상 전 배아 발달 중에 DNA 손상/오작동 세포를 제거하여 세포 항상성을 유지하기 위해 자발적으로 발생하는 생리학적 과정입니다. ROS는 DNA 단편화를 일으키고 배아 발달을 방해하는 세포자멸사 할구를 증가시킵니다. ROS와 apoptosis의 사건은 체외 수정보다 SCNT 후에 더 자주 관찰됩니다[18, 19]. 많은 연구에서 SCNT 배아 발달 능력은 셀레늄[20], 인슐린-트랜스페린-셀레늄[17, 21], 멜라토닌[22], 글루타티온[23]과 같은 항산화제를 사용하여 ROS와 세포자멸사 수준을 줄임으로써 구제된다고 보고했습니다.
이전 연구는 G{0}}/G1 단계에서 정지된 기증자 세포의 사용이 SCNT의 효율성을 향상시켰다고 보고했습니다[7, 9, 24-28]. G{13}}/G1 단계에서 기증자 세포의 염색질은 SCNT 배아 발달 능력에 가장 효과적인 것으로 간주되었습니다. 기증자 세포주기를 동기화하기 위해 접촉 억제, 혈청 기아 및 화학적 처리가 자주 사용되었습니다 [7, 25, 29, 30]. 그러나 혈청 기아는 세포 생존을 감소시키고 DNA 단편화를 증가시켜 세포자멸사를 유도한다[31]. 화학적 억제는 roscovitine[29, 32], 디메틸 설폭사이드(DMSO)[33], cycloheximide(CHX)[34]와 같은 억제제를 사용하여 G0/G1 단계에서 세포 주기를 정지시키는 또 다른 전략입니다. 동기화에 사용되는 방법의 효율성은 기증자 셀의 유형 및 종에 영향을 받습니다. 최적의 기증자 세포 동기화를 위해 사용된 방법의 다양한 측면을 신중하게 평가해야 합니다.
악티오사이드(베르바스코사이드라고도 함) [{{0}}(3, 4-디히드록시 페닐 에틸)-1-OaL-람노피라노실-(1/3)-bD-({{13} }O-caffeoyl)-glucopyranoside]는 Syringa vulgaris의 보라색 꽃에서 분리됩니다. Acteoside를 함유한 식물은 항균 및 항진균 활성을 갖고 [35-37] 염증을 예방하는 것으로 알려져 있습니다. 실제로 acteoside는 cyclin 의존성으로 G{28}}/G1 단계에서 항산화 활성, 항세포자멸 활성, 다양한 종양 세포에 대한 세포 독성 및 세포 주기 동기화와 같은 생체 외 및 생체 내에서 다양한 생물학적 활성을 나타냅니다. 키나제(CDK) 억제제[38]. 예를 들어 Lee et al.[38] Acteoside 치료는 G0/G1 단계에서 세포 주기 정지를 유도하여 인간 전골수구성 HL{27}} 백혈병 세포의 증식을 억제할 수 있다고 보고했습니다. 그러나 개 SCNT의 효율성에 대한 악테오사이드 처리 공여자 세포의 효과는 아직 연구되지 않았습니다.
이 연구에서는악티오사이드세포주기 동기화, ROS 및세포자멸사송곳니 태아 섬유아세포에 대해 조사했습니다. 세포주기 동기화, ROS 및 세포 사멸의 분석은 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여 수행되었습니다. Acteoside로 처리된 기증자 세포의 효율성을 입증하기 위해 SCNT 배아를 배양하고 수용견에게 이식하여 건강한 복제견을 성공적으로 생산했습니다.
시스탄체치료할 수 있다신장질병 개선신장기능
재료 및 방법
윤리 선언문
본 연구에서는 44마리의 암컷 잡종견(1~6세)을 난모세포 기증자와 배아 이식 대리인으로 사용하였고 암컷 비글(2세)을 태아 섬유아세포주 확립에 사용하였다. 모든 동물 실험은 충남대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았으며(승인 번호: CNU{4}}) IACUC에서 발행한 "실험실 동물의 관리 및 사용에 관한 지침"에 따라 수행되었습니다. 충남대학교의. 개는 온도 및 환기 제어 시스템이 있는 별도의 케이지에서 실내에서 키웠습니다. 개에게 하루에 한 번 상업적인 식이를 공급하고 물을 자유롭게 제공했습니다. 모든 동물 실험에서 개는 처음에 6 mg/kg 케타민과 자일라진으로 마취되었고 2% 이소플루란으로 마취된 상태를 유지했습니다. 수술이 끝나면 감염을 예방하기 위해 항생제(Procaine Penicillin G, Benzathine Penicillin G, Dihydrostreptomycin sulfate)를 투여하였다. 수술 후 개들은 담수와 함께 각자의 우리로 옮겨져 모니터링을 하고 담당 수의사의 특별한 관리를 받아 필요에 따라 필요한 치료를 할 수 있도록 하였다.
화학
모든 화학 물질은 달리 명시되지 않는 한 Sigma-Aldrich Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입했습니다. Acteoside는 중국 Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd.에서 입수했습니다.
송곳니 태아 섬유아세포의 분리
송곳니 태아 섬유아세포는 {0}}일 된 태아로부터 얻었습니다. 간단히 말해서 암컷 비글이 수컷 비글의 정자로 인공 수정되었습니다. 28일 후 암컷 비글의 임신이 확인되었고 자궁적출술로 5마리의 태아를 얻었다. 태아는 인산완충식염수(PBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, USA)에서 세 번 세척되었습니다. 태아의 머리, 내장 및 사지를 수술용 칼날로 제거하고 나머지 신체 부위를 PBS로 잘게 썬다. 태아 조각을 400x에서 5분 동안 원심분리하여 두 번 세척하고 1% 페니실린-스트렙토마이신(제품 번호 P4458) 및 20% 소 태아 혈청(FBS, Gibco)이 보충된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM; Gibco)에서 배양했습니다. 5% CO2 및 95% 공기의 가습된 대기에서 39도. 세포가 5-7일 후 합류에 도달하면 0.25% 트립신-EDTA(Gibco)로 2분 동안 처리하고 수확했습니다. 2개의 개별 태아로부터 2개의 송곳니 태아 섬유아세포 세포주가 확립되었습니다. 세포를 FBS의 10% DMSO에 동결하고 사용할 때까지 -196도의 액체 질소에 보관했습니다.
세포 치료
냉동 송곳니 섬유아세포를 해동하고 8% 합류가 될 때까지 배양했습니다. 세포를 수확하고 후속 실험을 위해 4-7회 계대했습니다. 세포를 60mm 배양 접시에 106/mL의 농도로 시딩했습니다. 세포를 (1) 5일 동안 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM(접촉 억제), (2) 0.5% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM(혈청 기아)에서 배양했습니다. 또는 (3) 24시간, 48시간 및 72시간 동안 10μM, 30μM 또는 50μM에서 악테오사이드를 함유하는 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 DMEM(악테오사이드 처리).
유세포 분석에 의한 세포 주기 분석
세포 주기 단계의 분석을 위해 {{0}}.25% 트립신-EDTA를 사용하여 세포를 수확하고 원심분리에 의해 PBS로 3회 세척했습니다. 마지막 세척 후, 상층액을 버리고 세포를 0.3mL PBS에 재현탁했습니다. 고정을 위해 {{10}}.7 mL의 차가운 무수 에탄올을 세포 현탁액에 적가하고 부드러운 볼텍싱으로 혼합하고 4도에서 밤새 보관했습니다. 고정된 세포를 원심분리하고 차가운 PBS로 2회 세척하였다. 세포를 5 μL의 10 mg/mL RNase가 보충된 0.25 mL PBS에 재현탁하고 37도에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 1mg/mL 요오드화 프로피듐(PI) 10μL를 첨가했습니다. 세포 주기는 FACS Calibur 유세포 분석기(Becton Dickinson, San Jose, CA , 미국).
유세포 분석에 의한 ROS 검출
살아있는 세포의 ROS는 Image-iT™ Live Green Reactive Oxygen Species Detection Kit(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)를 사용하여 평가되었습니다. 간단히 말해서, 배양 배지를 제거한 후 세포를 PBS로 세척하고, 100μM tert-부틸 하이드로퍼옥사이드(TBHP) 작업 용액 2mL를 첨가하였다. 37도에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, TBHP 작업 용액을 제거하고 세포를 따뜻한 Dulbecco's phosphate-buffered saline(DPBS; Gibco)에서 부드럽게 3회 세척하였다. 그런 다음 세포를 25μM 5-(및{10}})-카르복시{12}},7-디클로로디히드로플루오레세인 디아세테이트(카르복시-H2DCFDA) 작업 용액에서 37도에서 30분 동안 암실에서 배양했습니다. . 산화되면 카르복시-H2DCFDA는 녹색 형광을 방출하여 유세포 분석에 의한 ROS 평가를 용이하게 합니다. ROS 생성 유도제인 TBHP를 양성 대조군으로 사용하였다. 세포의 핵은 Hoechst 33342로 염색하였다. PBS로 3회 세척한 후 세포를 트립신 처리하여 회수하고 PBS에 현탁하고 FACS Calibur flow cytometer(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 이용하여 ROS 검출에 사용하였다. ). ROS 형성 속도는 ROS 양성 세포의 수를 전체 세포 수로 나누고 값을 백분율로 변환하여 계산했습니다.
유세포 분석에 의한 세포자멸사 분석
세포 사멸 분석은 Vybran1 Apoptosis Assay Kit #2 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)를 사용하여 수행되었습니다. 간단히 말해서, 세포를 트립신 처리에 의해 수확하고 차가운 PBS로 2회 세척하였다. 그 후, 100 μL의 1x annexin-binding buffer, 5 μL의 Alexa Fluor 488 annexin V 및 1 μL의 PI를 세포에 첨가하였다. 실온에서 15분 동안 인큐베이션한 후, 400 μL의 1x 아넥신 결합 완충액을 첨가하고 세포 현탁액을 부드럽게 혼합하였다. Ca2+의존성 인지질 결합 단백질인 Annexin V는 포스파티딜세린(PS)에 대해 높은 친화성을 가지고 있습니다. 살아있는 세포에서 PS는 내부 세포질 막에 위치하고 세포 사멸 세포에서 외부 세포질 막으로 전위됩니다. Apoptotic 세포는 외부 막의 PS에 결합하는 Alexa Fluor 488로 표지된 Annexin V에 의해 구별됩니다. 또한 핵산 결합 염료인 PI는 괴사 세포를 적색 형광으로 염색합니다. 따라서 녹색 형광을 갖는 세포 사멸 세포, 적색 형광을 갖는 괴사 세포 및 세포에서 형광이 거의 또는 전혀 없는 살아있는 세포를 FACS Calibur 유세포 분석기(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 사용하여 분석했습니다. 비율은 살아있는 세포, 괴사 세포 또는 세포 사멸 세포의 세포 수를 전체 세포 수로 나누고 계산 된 값을 백분율로 변환하여 계산했습니다.
생체 내 성숙 난모세포 수집
각 개의 배란을 감지하기 위해 DSL{1}}ACTIVE 프로게스테론 코팅된 튜브 방사선면역분석 키트(Diagnostic Systems Laboratories, Inc., TX, USA)를 사용하여 혈청 프로게스테론(P4) 농도를 측정했습니다. 앞서 기술한 바와 같이 [39, 40], P4 농도가 4ng/mL를 초과하는 날을 배란일로 간주하였다. 배란 후 72시간에 무균 수술 절차를 사용하여 개복술로 난모세포를 회수했습니다. 난관의 fimbria는 bursal slit을 통해 접근하고 거꾸로 된 플랜지 전구 강철 바늘(18 게이지, 7.5 cm)을 사용하여 캐뉼러를 삽입했습니다. 24 게이지 정맥 카테터(Angiocath™ Plus, Becton Dickison Korea Inc., Seoul, Korea)를 자궁경부 접합부 근처의 난관 협부에 삽입하고 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 배지 199(Gibco)를 삽입하였다. 5% FBS는 IV 카테터를 통해 난관에 도입되었습니다. 난모세포는 즉시 실험실로 이송되었습니다. 총 316개의 난모세포가 31마리의 개에서 수집되었습니다.
체세포 핵 이식 및 배아 이식 SCNT는 이전에 설명한 대로 수행되었습니다[39]. 간단히 말해서, 생체 내 성숙된 난모세포에서 난운 세포를 제거하기 위해 cumulus-oocyte-complexes(COC)를 0.1% hyaluronidase에서 반복적으로 피펫팅했습니다. 첫 번째 극체와 중기 II 염색체는 흡인에 의해 제거되었습니다. 제핵은 Hoechst 33342(bisbenzimide)로 염색하여 확인하였다. 송곳니 태아 섬유아세포를 48시간 동안 30 μM 악테오사이드로 처리한 다음 0.25% 트립신-EDTA로 수확했습니다. 평활한 세포막을 가진 단일 세포를 제핵된 난모세포의 난자주위 공간으로 옮겼다. 커플렛은 평형 주입 배지로, 0.1mM HEPES, 0.5mM MgSO4 및 0.05% BSA를 함유하는 0.26M 만니톨 배지이고 2개의 펄스로 융합되었습니다. Electro-Cell Fusion 장치(NEPA gene Co., Chiba, Japan)의 직류(15μs 동안 69–75V). 이 커플렛은 1시간 30분 동안 10% FBS가 보충된 배지 199에서 배양되었습니다. 융합된 SCNT 배아를 확인하고 4분 동안 10 μM calcium ionophore(제품 번호 C7522, Sigma)에서 배양하여 화학적 활성화를 유도했습니다. SCNT 배아를 세척한 다음 1.9mM 6-디메틸아미노퓨린(6-DMAP)을 함유하는 변형된 합성 난관액 배지(mSOF)[41]에 3시간 30분 동안 두었습니다. 조작된 배아는 SCNT 후 4시간 이내에 발정 동기화 대리모의 난관으로 외과적으로 이식되었습니다. 배아 이식 후 26일(빠르게는)에 초음파 검사로 임신을 확인했습니다.
활성 성분악티오사이드안에시스탄체
복제된 배아의 체외 배양
SCNT 후, 복제된 배아는 5% CO2 및 95% 공기에서 38.5도의 미네랄 오일로 덮인 변형된 합성 난관액 배지(mSOF)의 40μL 마이크로 방울에서 배양되었습니다. SCNT 배아 발달은 2일부터 8일까지 관찰되었습니다.
복제된 개의 미세위성 및 미토콘드리아 DNA 분석
G-spin™ Genomic DNA Extraction Kit (iNtRON BIOTECHNOLOGY, Seongnam, Korea)를 이용하여 제조사의 가이드라인에 따라 난모세포 기증견, 대리견, 복제견의 핵 기증 세포와 피부에서 총 DNA를 추출하였으며, 그런 다음 1{6}}0μL의 TE 완충액(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0)에 용출되었습니다. DNA의 양은 BioSpec-nano Spectrophotometer(Shimadzu Corp., Japan)로 측정하였다.
미세위성 유전형 분석을 위해 다음 7개의 특정 유전자가 선택되었습니다: PEZ1, PEZ3, PEZ8, PEZ12, FH2010, FH2054 및 FH2079. PCR은 95도에서 10분 동안 초기 변성, 95도에서 30초 동안 변성, 58도에서 30초 어닐링(-0.1도/사이클), 1분 연장으로 구성된 20주기로 수행되었습니다. 72도, 95도에서 30초 변성, 56도에서 30초 어닐링, 72도에서 1분 연장, 72도에서 10분 최종 확장으로 구성된 15개의 추가 사이클.
미토콘드리아 DNA 시퀀싱을 위해 개 mtDNA(GenBank 수탁 번호: U96639)의 완전한 뉴클레오티드 서열을 사용하여 다음 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성했습니다. 시토크롬 c 산화효소 소단위 II(L7,{41}}54—L7,465) F: ATGGCGTACCCATTTCAACT,R: GGATGGTTATTTCTATTGG; 16S rRNA(L2,033 –L2,472) F: GCAAAGGTAGCATAATCAT, R: AGGACTTTAATCGTTGAAC; D-루프 영역(L15,622 – L16,030) F: CATAGGACATATTAACTCAATC,R: AAGTCCAGCTACAAGTTATTTG [42]. 이 분석을 위한 PCR 주기는 다음을 포함합니다: 5분 동안 95도 초기 변성, 95도에서 30초 동안 5회 변성, 60도에서 40초 어닐링(-1도/주기), 1분 연장 72도, 95도에서 30초 동안 변성, 55도에서 40초 어닐링, 72도에서 1분 확장, 72도에서 10분 최종 확장의 다음 30주기. 다양한 실험의 PCR 단편을 ABI Prism 3100 Genetic Analyzer(Applied Biosystems Inc., USA)를 사용하여 분석했습니다. BioEdit 소프트웨어(v.7.0.5.3)를 사용하여 제어 영역에 대한 시퀀스 어셈블리, 다중 정렬 및 정렬 트리밍을 수행했습니다.
악티오사이드안에시스탄체면역 체계를 강화할 수 있습니다
