1부 UPLC-QTOF/MS 및 DNA 바코드를 기반으로 한 Cistanches Herba의 화학적 및 유전적 판별
Mar 03, 2022
연락처: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 이메일:audrey.hu@wecistanche.com
추상적인
시스탄치스 허바'사막의 인삼''으로 알려진 (Rou Cong Rong)은 기력과 영양, 특히 신장을 강화하여 양을 강화하는 놀라운 치료 효과가 있습니다. 그러나 Cistanches Herba, Cistanche Deserticola 및 Cistanche tubulosa의 두 가지 식물 기원은 약리학적 작용 및 화학적 성분 측면에서 다릅니다. Cistanches Herba의 식물 기원을 식별하기 위해 본 연구에서는 먼저 UPLC-QTOF/MS 기술과 DNA 바코드의 화학적 및 유전적 결합 방법 시스템을 사용했습니다. 결과는 PCA 및 OPLS-DA 분석에 의해 두 가지 기원을 구별하기 위해 세 가지 잠재적 마커 화합물(campneoside II, cistanoside C 및 cistanoside A의 이성질체)을 얻었다는 것을 나타냅니다. DNA 바코드로 두 개의 기원을 정확하게 구별할 수 있습니다. NJ 트리는 2개의 기원이 2개의 clades로 클러스터링됨을 보여주었다. 우리의 연구 결과는 Cistanches Herba의 두 가지 기원이 서로 다른 화학적 조성과 유전적 변이를 가지고 있음을 보여줍니다. 이것은 Cistanches Herba의 두 가지 기원에 대한 최초의 보고된 평가이며, 이 발견은 품질 관리 및 임상 적용을 용이하게 할 것입니다.
소개
시스탄치스 허바'사막의 인삼''으로 알려진 (Rou Cong Rong)은 말린 다육 식물 줄기에서 유래합니다.시스탄체 데저티콜라YC 마와시스탄체 튜불로사(Schrenk) 중국 약전(2010년판)에 의거한 가발로 신장을 튼튼하게 하고 생명의 에센스에 도움이 되며 장을 편안하게 해준다고 알려져 있습니다. 현재,시스탄치스 허바주로 중국 북서부의 건조하고 따뜻한 사막, 특히 신장과 내몽골 지방에 분포한다. 그러나 두 가지 기원은시스탄치스 허바약리학적 활성과 화학 성분이 다릅니다. Tu et al. 세 가지 Cistanche 종의 달인을 조사했습니다 (C. 데저티콜라, C. 튜불로사, 시탕슈 살사) 그리고 그것을 발견C. 튜불로사양 결핍 마우스 모델에서 가장 낮은 효과를 보였다[1]. Zhang et al. 사이의 약리 활성을 비교C. 데저티콜라, C. 튜불로사,그리고C. 살사,그리고 이들 종은 항피로 및 저산소 내성과 같은 의약 기능을 가지고 있지만 그 정도는 아니라는 것을 발견했습니다[2]. 이전 연구에서는 화학 성분을 보고하고 식물 기원에 대한 화학 성분 및 함량의 차이를 표시했습니다.시스탄치스 허바[삼]. 임상 적용 및 시장 유통에 관해서는 강장제로,C. 튜불로사일본에서는 전통적으로 혈액 순환 촉진제로 발기 부전, 불임, 요통, 허약 치료에 사용되어 왔습니다[4-8]. 따라서 두 가지 기원을 구별하는 것은 매우 중요합니다.시스탄치스 허바품질 관리 및 임상 적용을 위해 그러나 두 가지 기원의 차별에 초점을 맞춘 연구는 없습니다.시스탄치스 허바. 현미경, 자외선, 적외선 검출, 단순 염기서열 반복법을 포함한 많은 연구 방법이 속을 식별하는 데 사용되었습니다.시스탄체스, 그러나 특히 [9-20] 두 가지 기원에 대해서만은 아닙니다. 여기에서 우리는 Cistanches Herba, UPLC QTOF/MS(4중극자 비행 시간 질량 분석과 결합된 초고성능 액체 크로마토그래피) 및 DNA 바코드의 두 가지 기원을 구별하기 위해 화학 및 분자 기술을 결합하여 활용했습니다. UPLC-QTOF/MS는 다른 기술보다 빠르고 효율적으로 정보를 제공합니다. UPLC-QTOF/MS의 높은 선택성과 감도는 한의학에서 대사 산물 분석 및 복합 화합물 식별뿐만 아니라 정량적 및 정성적 분석 모두에 적용하게 되었습니다[21-22]. 잠재적인 마커 화합물을 식별하기 위해 PCA(주성분 분석) 및 OPLSDA(잠재 구조 판별 분석에 대한 직교 투영)도 개발되었습니다. 보다 쉽고 보편적인 분자 마커 기술인 DNA 바코드는 DNA 단편을 사용하여 종 또는 속을 식별합니다. 기존의 식별 방법 및 기타 분자 마커 기술보다 객관적이고 정확하며 수행하기 쉽습니다. 또한, DNA 바코드는 약용 식물을 포함한 동식물 식별에 성공적으로 적용되었습니다[23-26]. 이 연구의 목적은 UPLC-QTOF/MS와 DNA 바코드를 결합한 과학적 방법 시스템을 구축하여 두 식물 기원의 구별을 위한 것입니다.시스탄치스 허바.
Cistanches 전체 뿌리
재료 및 방법
윤리 선언문 우리는 현장 연구가 멸종 위기에 처하거나 보호받는 종을 포함하지 않았음을 확인합니다. GPS 좌표가 샘플 정보에 포함되었습니다. 표 1을 참조하십시오."
식물 재료 및 시약
Cistanches Herba의 다육 줄기는 2012년 5월 내몽골, 칭하이성, 신장 위구르 자치구의 야생 사막 지역에서 2012년 5월에 수집되었습니다(표 1). 특별한 허가가 필요하지 않은 사유지에서. 줄기의 식물 정체성은 Dr. Linfang Huang에 의해 확인되었습니다. 바우처 표본은 약용 식물 개발 연구소에 기탁되었습니다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 등급 아세토니트릴(Merck KGaA, Darmstadt, Germany) 및 포름산(Tedia, USA)을 UPLC 분석에 사용했습니다. 탈이온수는 Milli-Q 시스템(Millipore, Bedford, MA, USA)을 사용하여 정제되었습니다. 다른 모든 화학 물질은 분석 등급이었습니다.
샘플 준비
Cistanches Herba 샘플(1.{1}}g, 65-메쉬)을 50-mL 원뿔형 플라스크로 옮기고 70% 메탄올 5{13}}mL를 첨가했습니다. 30분 동안 담근 후, 상온에서 30분 동안 초음파 처리(35kHz)를 수행하였다. 10분 동안 10분 동안 원심분리한 후, 상청액을 4uC에서 저장하고 분석을 위해 UPLC-QTOF/MS 시스템에 주입하기 전에 0mm 막을 통해 여과했습니다.
UPLC-QTOF/MS
UPLC 분석을 위해 다음 시스템/파라미터가 사용되었습니다: Waters Empower 2 데이터 스테이션에 연결된 바이너리 용매 전달 펌프, 자동 샘플러 및 PDA 검출기가 장착된 Waters Acquity 시스템(Waters); 초음파 처리(25{12}} W, 5{14}} kHz, Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Zhejiang, China); 및 전자 분석 저울 모델 AB135-2(Mettler Toledo., Greifensee, Zurich, Switzerland). Waters Acquity UPLC BEH C18 컬럼(1.7mm, 2.161{42}}0mm, Waters)과 Waters C18 가드 컬럼(동일 재료, 물)을 사용하고 30uC에서 유지했습니다. 이동상은 0.1% 포름산 수용액(A)과 아세토니트릴(B)로 구배 프로그램은 다음과 같습니다. 0–3분, 10–22% B; 3-4분, 22-23% B; 4-6분, 23-35% B; 6-8분, 35-37% B; 8-11분, 37-42% B; 11-12분, 42-48% B; 12–15분, 0.3mL/min의 유속에서 48% –50% B. 주입 부피는 5mL였다.
UPLC/MS 분석은 음이온 모드에서 작동되는 ESI(electrospray ionization) 소스가 장착된 QTOF Synapt G2 HDMS 시스템(Waters, Manchester, UK)에서 수행되었습니다. N2는 탈용매 가스로 사용되었다. 탈용매 온도는 45{1{12}}}}uC, 유속 800L/h, 소스 온도는 120uC로 설정했습니다. 모세관 및 콘 전압은 각각 2500 및 40V로 설정되었습니다. 50~1200Da 사이에서 0.{11}s 스캔 시간과 0.{13}}분 분석 시간 동안 0.{13}s간 스캔 지연으로 데이터가 수집되었습니다. 아르곤은 7.06661023 Pa의 압력에서 충돌 가스로 사용되었습니다. 모든 MS 데이터는 질량 정확도와 재현성을 보장하기 위해 LockSpray 시스템을 사용하여 수집되었습니다. m/z 554.2615에서 류신-엔케팔린의 [MH]- 이온은 음의 ESI 모드에서 잠금 질량으로 사용되었습니다.
데이터 분석
Cistanches Herba 샘플에 대한 UPLC-QTOF/MS 데이터를 분석하여 잠재적인 판별 변수를 식별했습니다. ES 원시 데이터의 피크 찾기, 정렬 및 필터링은 Marker Lynx 응용 프로그램 관리자 버전 4.1(Waters, Man Chester, UK)을 사용하여 수행되었습니다. 사용된 매개변수는 다음과 같습니다. 0–15분의 머무름 시간(tR), 50-12{9}}0 Da의 질량, 0.02분의 체류 시간 허용 오차 및 질량 허용오차 0.02 Da. 각 지리적 위치에서 수집된 3개의 복제 샘플이 사용되었습니다(n=3). 총 6,339개의 변수가 모델을 생성하는 데 사용되었습니다.
DNA 바코드: DNA 추출, PCR 증폭 및 시퀀싱
C. Deserticola 및 C. tubulosa(30mg)의 건조 다육질 줄기에서 채취한 샘플을 30r/s의 빈도로 2분 동안 문지릅니다. 제조사의 지침(Tiangen)에 따라 DNA를 추출했습니다. 구체적으로, 프로토콜은 클로로포름이 클로로포름:이소아밀 알코올(동일 부피에서 24:1) 및 이소프로판올이 포함된 완충 용액 GP2(동일 부피)의 혼합물로 대체되도록 수정되었습니다. 문지른 분말을 1.5 ml eppendorf 튜브에 넣고 700 ml 65uC 예열된 GP1 및 1 ml b-mercaptoethanol을 첨가하여 vortex를 사용하여 10-20초 동안 혼합하고 65uC에서 60분 동안 배양했습니다. 클로로포름:이소아밀 알코올(24:1)의 혼합물 700mL를 첨가하고, 12000rpm에서 5분 동안 원심분리(,134006g); 700mL 이소프로판올을 추가하고 15-20분 동안 혼합하면서 상층액을 새 튜브에 피펫팅합니다. 모든 혼합물을 스핀 컬럼 CB3에 배관하고 12000rpm에서 40초 동안 원심분리합니다. 여액을 버리고 GD 500mL를 첨가(사용 전 정량적 무수 에탄올 첨가), 12000rpm에서 40초 동안 원심분리; 여과액을 버리고 700mL PW(사용 전 정량적 무수 에탄올 첨가)를 첨가하여 막을 세척하고 12000rpm에서 40초 동안 원심분리합니다. 여액을 버리고 500mL PW를 추가하고 12000rpm에서 40초 동안 원심분리합니다. 잔류 세척 완충액 PW를 제거하기 위해 12000rpm에서 2분 동안 여과액과 원심분리기를 버리고; 스핀 컬럼 CB3을 깨끗한 1.5ml eppendorf 튜브에 옮기고 실온에서 3-5분 동안 건조합니다. 12000rpm에서 2분간 원심분리하여 전체 DNA를 얻습니다. 중합효소연쇄반응(PCR)을 위한 프라이머는 이전에 보고된 시퀀스를 기반으로 했습니다[4,5]. PCR 반응 혼합물에는 2-mL DNA 템플릿, 8.{51}}mL ddH2O, 12.{54}}mL 26Taq PCR Master Mix(Beijing TransGen Biotech Co., China), 1/{57 }}mL 정방향/역방향(F/R) 프라이머(2.5mM), 최종 부피 25mL. PCR 증폭은 Kress et al. [4]. PCR 반응의 프라이머는 fwd PA: GTTATGCATGAACGTAATGCTC(59- 39) 및 rev TH: CGCGCATGGTGGATTCACAATCC(59-39)였습니다. PCR 생성물을 분리하고 1% 아가로스 겔 전기영동으로 검출하였다. PCR 산물은 제조사의 프로토콜에 따라 정제되었고 직접 시퀀싱을 거쳤습니다.
cistanche의 주요 유효 화합물: Acteoside
결과
UPLC-QTOF/MS에 의한 임시 피크 할당 다른 생산 지역의 C. Deserticola 및 C. tubulosa의 대표적인 크로마토그램이 그림 1에 나와 있습니다. 지문 크로마토그램은 Cistanches Herba 샘플 간의 유사성을 나타냅니다. 머무름 시간 및 질량 스펙트럼을 이전에 보고된 것과 일치시켜 총 23개의 적격한 질량 피크가 감지되었고 16개의 피크가 식별되었습니다(표 2)[29-35]. 피크 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 17, 20, 21, 22 및 23은 잠정적으로 cistanoside F, mussaenoside acide, cistanbuloside C1/C2, campneoside II로 확인되었습니다. , campneoside II의 이성질체, echinacoside, cistanoside A, acteoside, isoacteoside, syringalide A-39-aL-rhamnopyranoside, cistanoside C, 29-acetylacteosid, osmanthhuside B, cistanoside D, tubuloside B, 및 cistancinen . 화학 성분은 주로 페닐에타노이드 배당체(PhGs)인 것으로 결정된 반면, 한 화합물인 무사에노사이드 산은 이리도이드 다당류였습니다. PhGs는 신장 결핍증 치료, 항산화 및 신경 보호 효과 측면에서 주요 활성 화합물입니다 [36]
C. Deserticola 및 C. tubulosa의 PCA
PCA는 다른 식물 종의 샘플을 구별하는 데 사용되었습니다. PCA는 2차 대사산물 구성의 다변수 데이터 내 유사점 및/또는 차이점을 시각화하는 것을 목표로 하는 감독되지 않은 다변수 데이터 분석 방법입니다[37]. 2성분 PCA 모델은 누적 변동의 46.04%를 설명했습니다(PC1, 36.43%; PC2, 9.61%). 그림 2는 24개의 샘플이 종의 기원에 따라 플롯된 PCA 점수에서 두 그룹으로 클러스터링되었음을 보여줍니다.
cistanche의 주요 유효 화합물: Echinacoside
