파트 1 Echinacoside는 NO-cGMP-PKG-BKCa 채널을 열고 세포 내 Ca2 플러스 수준을 감소시켜 쥐의 폐동맥 혈관 이완을 유도합니다

에키나코사이드는 어떻게 정맥 이완을 유도합니까?

Xiang-Yun GAI1, 2, 3, Yu-hai WEI4, Wei ZHANG2, Ta-na WUREN2, Ya-ping WANG2, Zhan-Qiang LI2, Shou LIU2, Lan MA2, Dian-Xiang LU2, Yi ZHOU1, 2, Ri- li GE1, 2, * 1 Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China, 생명 과학 및 생물 의약 대학 약리학과; 2 중국 시닝 810001 칭하이대학교 의과대학 고지대 의학 연구센터; 3 중국 칭하이민족대학 약학대학 Xining 810007; 4 칭하이 출입국 검사검역국, Xining 810001, China

겨냥하다:높은 고도에서 경험한 지속적인 폐혈관 수축은 폐고혈압(PH)을 유발할 수 있습니다. 이 연구의 주요 목적은 혈관 이완 효과를 조사하는 것입니다.에키나코사이드(ECH), 티베트 허브 Lagotis brevituba Maxim의 페닐에타노이드 배당체 및시스탄체 튜불로사, 폐동맥과 그 잠재적 기전에 대해.

행동 양식:수컷 Wistar 쥐에서 얻은 폐동맥 고리를 Krebs-Henseleit 용액으로 채워진 장기 챔버에 매달고 힘 변환기를 사용하여 등척성 장력을 측정했습니다. 세포 내 Ca2 플러스 수준은 Fluo 4-AM을 사용하여 배양된 쥐의 폐동맥 평활근 세포(PASMC)에서 측정되었습니다.

결과: ECH(30–300 μmol/L) 농도 의존적 ​​방식으로 노르아드레날린(NE)에 의해 사전 수축된 쥐의 폐동맥을 이완시켰고, 이 효과는 손상되지 않은 내피 및 내피가 박탈된 고리 모두에서 관찰될 수 있었지만, 최대 반응이 현저히 낮고 내피가 박탈된 고리에서 더 높은 EC50. 이 효과는 L-NAME, TEA 및 BaCl2에 의해 크게 차단되었습니다. 그러나 IMT, 4-AP 및 Gli는ECH-유도된 이완. 세포외 Ca2+-free 조건에서 최대 수축은 각각 100 및 300μmol/L의 ECH로 처리된 고리에서 24.54% ±2.97% 및 10.60% ±2.07%로 감소했습니다. 세포외 칼슘 유입 조건에서 최대 수축은 각각 30, 100 및 300μmol/L의 ECH로 처리된 고리에서 112.42% ±7.30%, 100.29% ±8.66% 및 74.74% ±4.95%로 감소했습니다. 세포에 Fluo 4-AM을 로드한 후, 평균 형광 강도는ECH(100 μmol/L) NE보다.

결론: ECH세포내 Ca2 플러스 수준을 감소시켜 쥐 폐동맥의 NE 유발 수축을 억제하고 NO-cGMP 경로와 K 플러스 채널(BKCa 및 KIR)의 개방을 통해 이완을 유도합니다.

키워드:티베트 허브;에키나코사이드; 폐 고혈압; 높은 고도; 혈관 이완; 아니; BKCa; 키르; 동맥 고리; 폐동맥 평활근 세포.

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소개

높은 고도에서 경험하는 지속적인 폐혈관 수축은 폐고혈압(PH)과 내측 비대[1]를 유발할 수 있으며, 이는 우심실 비대 및 심부전의 주요 원인으로 확인되었습니다[2]. 높은 고도에 일시적으로 또는 영구적으로 거주하는 개인은 경증에서 중등도의 폐고혈압을 나타낼 수 있으며, 저산소증에 더 취약한 사람들은 폐혈관 수축이 과장되어 다음과 같은 심각한 이환율 및 사망률과 관련된 다양한 고지대 질병을 유발할 수 있습니다. 고지대 폐부종 및 심장병[3].에키나코사이드(ECH)(그림 1)은페닐에타노이드 배당체티베트 허브 Lagotis brevituba Maxim 및시스탄체 튜불로사[4, 5]. 라고스 브레비투바 막심(Lagos brevituba Maxim)은 덩굴과(Scrophulariaceae)에 속하는 라고티스속(Lagotis spp)의 일종으로 칭하이-티베트 고원의 해발 3000미터 이상에서 널리 자랍니다.ECH항산화, 항염, 신경보호, 간보호 및 산화질소(NO) 라디칼 소거 특성과 같은 다양한 바람직한 약리학적 특성을 가지고 있습니다[6]. 또한 쥐의 흉부 대동맥 고리에서 내피 의존적 이완을 유도하고 심혈관 질환을 치료할 수 있습니다[7]. 그러나 우리가 아는 한 폐동맥의 혈관긴장도에 미치는 영향을 조사한 연구는 없습니다. 이 연구의 목적은 다음과 같습니다: (1) ECH가 노르아드레날린(NE)으로 미리 계약된 쥐의 폐동맥에서 시험관 내 혈관 이완을 유도하는지, 그리고 이 효과가 있는 경우 이 효과가 내피 의존성인지 또는 혈관 평활근에 직접 작용하는지 여부를 조사합니다. ; (2) 쥐의 폐동맥 평활근 세포(PASMC)에서 세포외 칼슘 유입 및 세포내 칼슘 방출에 대한 ECH의 효과를 조사하기 위해; 및 (3) ECH 유도 이완과 관련된 가능한 경로 및 K 플러스 채널을 식별합니다.

재료 및 방법

시약

ECH는 Peking University(Beijing, China)의 Dr. Peng-fei TU에 의해 친절하게 제공되었으며 고성능 액체 크로마토그래피로 측정한 순도가 98% 이상입니다. 디메틸 설폭사이드(DMSO)는 Solar Science & Technology Co, Ltd(중국 베이징)에서 구입했습니다. NE, 아세틸콜린(ACh, 99% 이상), 인도메타신(IMT), Nω-니트로-L-아르기닌 메틸 에스테르 염산염(L-NAME), 염화테트라에틸암모늄(TEA), 염화바륨(BaCl2), {{ 9}}아미노피리딘({{10}}AP), 및 Sigma Chemical Co(St Louis, MO, USA)의 글리벤클라미드(Gli); Gibco BRL Co, Ltd(Gaithersburg, MD, USA)의 고글루코스 Dulbecco's Modified Eagle's 배지(DMEM), 태아 소 혈청(FBS) 및 트립신; Boshide Biotech Co, Ltd(중국 우한)의 마우스 항-쥐 1차 평활근 액틴(-SMA) 항체 및 염소 항-마우스 2차 항체; Invitrogen Corp(Carlsbad, CA, USA)의 Fluo Calcium Indicators(Fluo 4-AM); 및 Beijing Chemical Reagent Co, Ltd(Beijing, China)의 모든 무기염. IMT를 DMSO에 용해시키고 5% NaH2PO4, Gli, Fluo{19}}AM 및 ECH를 DMSO에 용해시키고 다른 모든 시약을 Krebs-Henseleit(KH) 또는 PBS 용액에 용해시켰다. 예비 실험에서는 0.1%(v/v) 미만의 DMSO가 분리된 폐동맥 고리의 긴장 발달에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다.

실험 동물

모든 절차와 프로토콜은 Qinghai University 의과 대학의 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 6-8주령, 250-300g 체중의 수컷 Wistar 쥐를 Lanzhou University 동물 센터(중국 란저우)에서 구입하여 표준 실험실 식단과 22±2°의 주변 온도에서 임의로 수돗물을 유지했습니다. 실험 내내 2도 및 상대 습도 45% –55%.

체외 폐동맥 관류

쥐 폐동맥 고리의 준비

체중이 25{25}}-300g인 쥐에게 펜토바르비탈 나트륨(40mg/kg)을 복강 내 주사하여 마취한 다음 심장과 폐를 제거하고 즉시 (mmol/L)가 포함된 얼음처럼 차가운 KH 용액에 담그었습니다. : 118 NaCl, 4.7 KCl, 2.5 CaCl2, 1.2 MgSO4·7H2O, 1.2 KH2PO4, 25 NaHCO3 및 11.1 포도당(pH 7.4). 폐내 동맥(직경 0.7~1.5mm)을 주변 결합 조직과 외막이 없는 상태로 절개한 다음 약 2~3mm 길이의 고리로 절단했습니다. 고리는 37도에서 10mL의 KH 용액으로 채워진 기관 챔버에 매달려 있고 95% O2–5% CO2로 가스가 공급되며 힘 변환기(JH{38}}, Space Medico -Engineering Institute, 베이징, 중국)

혈관 고리 활성 평가 및 내피 기능 평가

용기 고리는 400mg의 기본 장력 하에서 2시간 동안 평형을 이루도록 했으며, 이 시간 동안 KH 용액은 15분마다 교체되었습니다. 그런 다음 수축 백분율을 감지하여 각 링의 활성을 평가하기 위해 1 μmol/L의 NE를 챔버에 추가했습니다. 실험 프로토콜 전후에 수축률을 측정했습니다(그림 2A 및 2B). 일부 고리에서는 가는 강선으로 내피 표면을 부드럽게 문질러 내피를 제거하고, NE(1 μmol/L). ACh에 의한 이완이 80%보다 크면 내피는 양호한 상태를 유지했습니다. 이완이 30% 미만이면 내피가 파괴됩니다(그림 2A 및 2B)[9].

쥐 PASMC의 분리 및 배양

쥐의 폐엽에서 원위 폐동맥을 분리하고 내피와 외막을 조심스럽게 제거하였다. 조직을 {{0}}mm 조각으로 자른 후 즉시 플라스크에 넣고 37도, 5% CO2의 가습 인큐베이터에서 약 4시간 동안 유지한 후 고포도당 DMEM으로 배양하였다. 약 5일 동안 20% FBS, 100U/mL의 페니실린, 100U/mL의 스트렙토마이신을 보충했습니다. 세포가 나올 때 배양 배지의 절반을 새로운 배지로 교체했습니다. 세포가 80% 합류에 도달하면 0.125% 트립신으로 수확하고 10% FBS, 100U/mL의 페니실린 및 100U/mL의 스트렙토마이신이 보충된 고글루코스 DMEM을 포함하는 플라스크(1:2 비율)에 시딩했습니다. . 3-8개의 계대를 가진 세포가 모든 실험에 사용되었습니다.

면역조직화학에 의한 PASMC의 동정

PASMC는 전형적인 "언덕과 계곡" 특징이 관찰되었을 때 면역화학적 염색에 대해 양성이었습니다. 세포를 유리 커버슬립이 있는 6-웰 플레이트에 접종했습니다. 세포가 80% 컨플루언스에 도달하면 4% 파라포름알데히드에 고정하고 3% 과산화수소로 15분간 차단한 다음 마우스 항-랫트 1차 -SMA 항체와 함께 4도에서 밤새 배양하였다. PBS에서 10분 동안 3회 세척한 후, 세포를 상온에서 45분 동안 염소 항-마우스 2차 항체와 함께 배양하고, PBS에서 10분 동안 다시 3회 세척하고, 디아미노벤지딘으로 가시화하였다.

쥐 PASMC에서 세포 내 칼슘 농도 검출

PASMC를 유리 커버슬립이 있는 {{0}}웰 플레이트에 시딩했습니다. 세포가 8{18}}% 합류에 도달하면 배양 배지를 무혈청 DMEM으로 교체했습니다. 24시간 후, 세포는 5% CO2의 가습 대기에서 30분 동안 37도에서 7 μmol/L Fluo 4-AM으로 로드되었습니다. 잔류 염료를 하기를 함유하는 행크스 평형 염 용액(HBSS) 용액(mmol/L)으로 세척하였다: 1.26 CaCl2, 0.49 MgCl2·6H2O, 0.41 MgSO4·7H2O, 5.33 KCl, 0.44 KH2PO4, 4.17 NaHCO3, 137.93 NaCl, 0.34 Na2HPO4 및 5.56 D-글루코스, 페놀 레드 없음. Fluo 4-AM이 로딩된 세포는 세 가지 처리 조건 중 하나에 노출되었습니다. (2) 세포가 1 μmol/L의 NE로 보충된 무혈청 DMEM과 함께 10분 동안 배양된 NE 그룹; 및 (3) NE + ECH(100μmol/L) 그룹(NE + ECH100 그룹), 여기서 세포는 1μmol/L의 NE 및 100μmol/L의 ECH가 보충된 무혈청 DMEM과 함께 인큐베이션되었습니다. 20분 동안 형광강도는 형광현미경(IX71, Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰 및 사진촬영하였다[11]. 각 샘플에 대해 6개의 시야(200x)를 수집했습니다. Image Pro-Plus 6.0 소프트웨어를 사용하여 평균 형광 강도를 측정하여 세포 내 칼슘 농도를 정량화했습니다.

통계 분석

데이터는 평균±SD로 표현하였다. 적절한 경우, 일원 분산 분석(ANOVA) 후 다중 비교를 위해 Dunnett의 테스트 또는 Student-Newman-Keuls 테스트에 의해 유의미한 차이를 평가했습니다. P의 확률 수준<0.05 was="" considered="">

결과 분리된 폐동맥에 대한 ECH의 혈관 이완 효과

실험 초기에 30에서 300μmol/L로 ECH의 누적 첨가는 폐동맥의 기저 장력에 큰 영향을 미치지 않았습니다. NE 유도 혈관 수축이 안정기에 도달한 후, ECH는 손상되지 않은 내피(E plus, 그림 2C) 또는 내피가 제거된 고리(E-, 그림 2C)에 누적(30-300μmol/L) 추가되었습니다. 손상되지 않은 내피 고리에서 ECH의 누적 추가는 최대 농도 의존적 ​​방식으로 혈관을 확장했습니다.

300 μmol/L 및 EC50 51.60±0.57 μmol/L에서 89.22% ±{2}}.32%의 엄마 이완 비율(그림 2A 및 2C). 유사하게, 내피가 박리된 고리에서 ECH는 농도 의존적 ​​방식으로 혈관을 확장시켰지만 최대 반응은 67.72% ±1.69%로 현저히 낮았습니다(P<0.01 vs="" intact="" endothelium="" rings)="" and="" a="" higher="" ec50="" of="" 108.51±2.8="" μmol/l=""><0.01 vs="" intact="" endothelium="" rings,="" figure="" 2b="" and="" 2c).="" the="" sustained="" plateau="" of="" the="" high-contraction="" percentage="" induced="" by="" ne="" (1="" μmol/l)="" after="" the="" experimental="" protocol="" indicated="" that="" the="" rings="" pretreated="" with="" ech="" (30–300="" μmol/l)="" had="" good="" activity="" (figure="" 2a="" and="">

세포 내 칼슘 방출 및 세포 외 칼슘 유입에 대한 ECH의 효과

내피가 제거된 고리는 최대 수축에 도달할 때까지 1 μmol/L의 NE에 노출되었습니다. 세포외 Ca2+-free 조건에서 링은 실험을 시작하기 전에 0.2mmol/L의 EGTA를 포함하는 Ca2+-free KH 용액에서 평형을 이루었습니다. Ca2+ 및 EGTA가 없는 KH 용액으로 3회 세척한 후 링을 ECH(30, 100 및 300μmol/L)와 함께 20분 동안 사전 인큐베이션한 다음 1μmol/L의 NE에 다시 노출시켰습니다. 생산된 반지

기준으로 사용된 NE에 의해 유도된 초기 수축과 비교하여 기준선으로 빠르게 돌아온 지속되지 않는 수축. 대조군의 최대 수축은 33.27% ±2.94%(그림 3A 및 3E)였지만 ECH 100 및 300μmol/L로 전처리된 링에서 각각 24.54% ±2.97% 및 10.60% ±2.07%로 크게 감소했습니다(P<0.01 vs="" control="" group;="" figure="" 3c–3e).="" under="" extracellular="" calcium="" influx="" conditions,="" 2.5="" mmol/l="" cacl2="" was="" added="" to="" the="" chamber="" when="" the="" curve="" reached="" a="" plateau.="" the="" control="" group="" produced="" sustained="" contractions,="" with="" a="" maximum="" contraction="" of="" 139.89%±7.38%="" (figure="" 3a="" and="" 3e);="" but="" the="" maximum="" contraction="" was="" significantly="" reduced="" to="" 112.42%±7.30%,="" 100.29%±8.66%,="" and="" 74.74%±4.95%="" in="" rings="" pretreated="" with="" 30,="" 100,="" and="" 300="" μmol/l="" of="" ech,="" respectively=""><0.01 vs="" control="" group;="" figure="" 3b–3e).="" under="" these="" conditions,="" the="" maximal="" effect="" caused="" by="" ech="" was="" more="" pronounced="" with="" 300="" μmol/l="" than="" with="" 100="" or="" 30="" μmol/l=""><0.01 vs="" 30="" or="" 100="" μmol/l="" ech="" group).="" different="" concentrations="" of="" ech="" all="" shortened="" the="" platform="" of="" sustained="" contraction,="" which="" was="" induced="" by="" extracellular="" calcium="" influx="" at="" different="" levels="" (figure="">

ECH 유발 쥐의 폐동맥 혈관 이완에서 다양한 억제제의 역할

ECH에 의해 유도된 쥐의 폐동맥 혈관 이완은 다음 억제제의 존재 또는 부재하에 조사되었습니다. 내부 정류기 K + 채널 억제제), 4-AP(전압 의존성 K + 채널 억제제) 및 Gli(ATP-민감성 K + 채널 억제제). 고리는 1 μmol/L의 NE로 최대로 수축된 다음 L-NAME(100 μmol/L), IMT(10 μmol/L), TEA(1 mmol/L) , BaCl2(1mmol/L), 4-AP(1mmol/L) 또는 Gli(10μmol/L)를 각각 첨가하였다. 새로운 고원에 도달하면 ECH를 30에서 300μmol/L까지 누적 방식으로 추가했습니다. 다양한 억제제가 존재할 때의 농도-반응 곡선은 그림 4에 나와 있습니다. 1μmol/L의 NE로 수축된 폐동맥 고리에 대한 ECH의 혈관 이완 효과는 L-NAME(100μmol/L), TEA( 1mmol/L) 및 BaCl2(1mmol/L), 최대 이완은 각각 64.41% ±3.20%, 84.38% ±0.70% 및 75.27% ±0.93%(P<0.01 vs="" the="" control="" group="" of="" 89.22%±0.32%),="" and="" the="" values="" of="" ec50="" were="" increased="" to="" 197.32±2.75="" μmol/l,="" 91.42±2.11="" μmol/l,="" and="" 115.49±1.75="" μmol/l,="" respectively=""><0.01 vs="" the="" control="" group="" of="" 51.60±0.57="" μmol/l)="" (table="" 1).="" however,="" imt="" (10="" μmol/l),="" 4-ap="" (1="" mmol/l),="" and="" gli="" (10="" μmol/l)="" did="" not="" inhibit="" the="" ech-induced="" relaxation="" (figure="" 4="" and="" table="" 1).="" to="" validate="" the="" effects="" of="" these="" inhibitors="" on="" ech-induced="" relaxation,="" the="" rings="" precontracted="" with="" 1="" μmol/l="" of="" ne="" were="" treated="" with="" l-name="" (100="" μmol/l),="" imt="" (10="" μmol/l),="" tea="" (1="" mmol/l),="" bacl2="" (1="" mmol/l),="" 4-ap="" (1="" mmol/l),="" and="" gli="" (10="" μmol/l).="" after="" a="" new="" plateau="" was="" reached,="" ech="" was="" added="" to="" the="" chamber="" at="" a="" single="" concentration="" of="" 300="" μmol/l="" rather="" than="" in="" a="" cumulative="" manner.="" the="" maximum="" relaxation="" was="" reduced="" to="" 56.33%±0.90%,="" 82.21%±0.92%,="" and="" 72.16%±0.76%="" following="" the="" addition="" of="" l-name,="" tea,="" and="" bacl2,="">

쥐 PASMC의 식별

At low magnification, spindle cells were densely packed, and almost all the cells were stained positively for PASMCs (the PASMC purity was >95%)(그림 6A). 갈색으로 염색된 근섬유는 세포질에서 고배율로 명확하게 관찰되었습니다(그림 6B).

시스탄체에키나코사이드저항할 수 있다세포자멸사

랫트 PASMC에서 세포내 칼슘 농도에 대한 ECH의 효과

NE(1 μmol/L)는 세포내 칼슘 농도를 유의하게 증가시켰습니다(n=6, P<0.01 vs="" the="" control="" group)="" in="" rat="" pasmcs,="" and="" ech="" could="" decrease="" the="" mean="" fluorescence="" intensity="" (n="6,"><0.01 vs="" the="" ne="" group)="" (figure="">