파트 2: Echinacoside는 ROS/ATF3/CHOP 경로 조절을 통해 MPP 플러스 유도된 신경 세포 사멸로부터 보호합니다.

에키나코사이드MPP 플러스 - ROS/ATF3/CHOP 경로 조절을 통한 유도된 신경 세포 사멸로부터 보호

Qing Zhao1 • Xiaoyan Yang2 • Dingfang Cai3,4 • Ling Ye5,6 • Yuqing Hou1 •

장리준1 • 청지웨이1 • 위안셴1 • 왕카이즈5 • 위바이1

1mmol/L MPP?, 4{12}} LG/mL ECH, 또는 MPP의 조합? 및 ECH. 그런 다음 세포를 30분 동안 실온(RT)에서 차단 완충액(PBS 중 3% BSA)에서 인큐베이션했습니다. 그런 다음, 항-ATF3, 항-CHOP 또는 항-절단된 카스파제 3 항체를 차단 완충액(PBS 중 1% BSA 및 0.3% Triton X{14}})에서 1:100으로 희석하고 4C에서 밤새 배양했습니다. PBS로 3회 세척한 후, 세포를 RT에서 Alexa 488-염소 항토끼 IgG(Life Technologies, Carlsbad, CA)와 함께 인큐베이션했습니다.

1시간 핵은 Hoechst 33342로 염색되었습니다. 이미지는 공초점 현미경(Leica SP8, Wetzlar, Germany)으로 캡처되었습니다.

말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 매개 dUTP Nick-End Labeling(TUNEL) 분석

우리는 bregma -2.92 nm에서 -3.64 mm까지 SNc를 통해 10번째 관상 섹션(총 14-15개)마다 염색했습니다.

각 그룹의 동일한 수준에서 SNc를 통한 4개의 일반적인 섹션이 TH 및 TUNEL 카운트에 사용되었습니다[10]. TUNEL 분석은 제조사의 지시에 따라 in situ 세포 사멸 검출 키트(Roche, Rotkreuz, Switzerland)를 사용하여 조직 절편에서 세포자멸사를 분석하기 위해 수행되었습니다. DNA 라벨링 후, 절편을 항-TH 항체로 면역형광 염색에 사용하고, 이미지를 공초점 현미경(Leica SP8, Wetzlar, Germany)으로 캡처하였다. 마우스 뇌 지도[20]에 따라 저배율(10 9 대물렌즈)에서 SNc를 묘사한 후, TH-양성 세포와 TH/TUNEL 이중 양성 세포가 더 높은 배율에서 계수되었습니다({{7} } 목적) 두 관찰자에 의해 치료에 눈이 멀었습니다. TH/TUNEL 이중 양성 세포 대 TH 양성 세포의 비율을 계산하였다.

Phenylethanoid Glycosides in cistanche (2)

시스탄체에키나코사이드는항염증속성

통계 분석

모든 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. 일원 ANOVA에 이어 Tukey의 HSD 및 Student-Newman-Keuls 다중 비교 테스트를 사용한 사후 분석이 통계 목적으로 수행되었습니다. P \ 0.05의 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

결과

ECH는 ROS 제품을 감소시키고 감쇠시킵니다.

MPP{0}}유도된 아폽토시스

ECH는 동물 모델에서 세포자멸사로부터 뉴런을 보호할 뿐만 아니라 신경모세포종 세포에서 염증성 사이토카인 수준을 감소시키는 것으로 나타났습니다[12]. 그러나 ECH가 MPP에 의해 유도된 신경 세포 사멸을 직접 조절하는지 여부는 불분명합니다. 우리의 데이터는 ECH가 SH-SY5Y 세포의 증식이나 사멸에 영향을 미치지 않았으며(그림 1B), 그 형태가 변하지 않았다는 것을 보여주었습니다(그림 1C). 흥미롭게도 SH-SY5Y 세포를 MPPα에 노출시킨 후 ECH 처리(10-40 lg/mL) 후 생존율이 용량 의존적으로 증가했습니다(그림 1B, C).

이전 연구에 따르면 MPP? 특히 미토콘드리아에서 전자 수송 사슬을 억제하고 ROS 생성과도 관련이 있습니다[6, 21]. DCFH-DA를 형광 프로브로 사용하여 ROS 수준의 변화를 평가한 결과 ECH가 MPPα에 의해 유도된 ROS 생성을 현저하게 억제한다는 것을 발견했습니다(그림 2A). 공초점 현미경은 감소된 ROS 생성물이 ECH 수준과 관련이 있음을 보여주었습니다(그림 2C). ECH는 또한 ROS로부터 세포막을 보호하고 지질 과산화의 최종 생성물인 MDA 수준을 감소시키는 것으로 나타났습니다(그림 2B). 함께 찍은,

ECH는 뉴런에서 MPPα-유도된 ROS 생성물을 감소시켜 세포 생존을 촉진합니다.

ECH는 ROS 스트레스 관련/MPP를 억제합니다.1-유전자 발현을 유도하고 GDNF를 증가시킵니다.

MPP{0}}처리된 세포에서의 발현

ROS 제품은 펼쳐진 단백질 반응을 자극하고 ATF3, ATF4 및 CHOP를 포함한 스트레스 관련 유전자의 발현을 유도하는 것으로 나타났습니다[22]. ATF3와 CHOP는 스트레스로 인한 신경 세포 사멸에서 특히 중요한 역할을 합니다[9, 23]. 비정상적인 α-시누클레인 발현은 또한 PD 병리학에서 중요한 마커 중 하나입니다[2]. qRT-PCR을 사용하여 MPP에서 ATF3, CHOP, SNCA 및 glial cell line-derived neurotrophic factor(GDNF)의 발현을 분석했습니다. 세포 모델과 그 MPP를 찾았습니까? PBS 대조군에 비해 ATF3, CHOP 및 SNCA의 발현이 유의하게 향상되었습니다. ECH는 MPPα를 처리하지 않은 SH-SY5Y 세포에서 이들 유전자의 발현에 영향을 미치지 않았다. 그러나 ECH는 MPPα에 의해 유도된 발현을 중단시켰다(Fig. 3). 또한, MPP? SH-SY5Y 세포에서 GDNF의 발현을 유의하게 억제했지만 ECH는 이 현상을 부분적으로 역전시켰다(그림 3B).

ECH는 SH-SY5Y 세포에서 MPP1-유도된 카스파제{1}} 활성화를 억제합니다

높은 수준의 ATF3와 CHOP는 신경 세포 사멸을 직접적으로 촉진합니다[9, 23]. 우리의 데이터는 ECH가 용량 의존적 방식으로 ATF3 및 CHOP 발현을 억제한다는 것을 보여주었다(그림 4A). ECH는 또한 MPP? 유도 카스파제를 차단했습니다-3

활동(그림 4A, B). 절단된 형태의 caspase-3에 대한 면역형광 분석은 추가로 ECH가 MPPβ 처리된 세포에서 절단된 caspase-3 단백질 발현을 현저히 감소시키는 것으로 나타났습니다(그림 4C).

ECH는 MPP를 역전시킵니다1-SH-SY5Y 세포에서 ATF3 및 CHOP 축적 유도

환경 독소에 노출된 후 ATF3 및 CHOP 단백질은 세포질과 핵에 국한되어 [24, 25], 이는 세포 사멸을 유도합니다. 우리의 결과는 MPP? 처리는 핵에서 ATF3와 CHOP 발현을 증가시켰고, ECH는 이 과정을 효과적으로 약화시켰다(그림 5A, B). Western blotting 분석 결과 MPP? 세포질과 핵에서 두 단백질의 수준이 현저히 증가했습니다. 흥미롭게도 ECH는 MPP를 폐지했습니까? 효과가 있고 핵에서 ATF3 및 CHOP 축적이 억제되었습니다(그림 5C-E).

ATF3는 MPP{1}}SH-SY5Y 세포에서 세포자멸사를 유도하는 데 중요한 역할을 합니다.

ATF3는 SH-SY5Y 세포에서 세포자멸사를 유도하는 것으로 나타났으며[23], 본 연구의 결과는 ECH가 MPP에 의해 유도된 ATF3 mRNA와 단백질 발현을 유의하게 억제한다는 것을 나타낸다. 이 세포에서. 그러나, 세포 생존의 세포자살 및 ECH 보호에서 ATF3의 역할은 불분명하게 남아있다. 그래서 우리는 ATF3에 특정한 small hairpin RNA(shRNA)를 사용하여 이를 조사했으며 정상 조건에서 ATF{7}}녹다운 그룹과 대조군 사이의 생존력에 차이가 없음을 발견했습니다(그림 6A). 그러나 ATF3 억제 또는 ECH 처리는 MPP에 의해 유발된 형태학적 변화를 유의하게 구출하였다. (그림 6B). ATF{11}}녹다운 세포가 MPP에 노출된 후 대조군보다 생존력이 더 높았나요? (그림 6C). CHOP 및 활성화된 카스파제{13}} 단백질 수준은 ATF 녹다운 세포에서{14}}보다 낮았습니다.

비특이적 shRNA가 있는 대조군 세포에서(그림 6C, D). 이러한 데이터는 ATF3가 신경모세포종 세포의 MPPα-유도된 아폽토시스에서 중요한 역할을 한다는 것을 나타내었다. 따라서 이러한 결과는 ECH가 ROS/ATF3/CHOP 경로의 하향 조절을 통해 MPPβ 유도 효과에 대해 SH-SY5Y 세포를 보호한다는 가설을 뒷받침합니다. 흥미롭게도, 우리 데이터는 ECH가 SH-SY5Y 세포에서 p53과 PUMA(p{10}upregulated modulator of apoptosis) 수준의 MPPα 유도 증가도 억제한다는 것을 보여주었습니다(그림 7).

echinacoside in cistanche (2)

시스탄체에키나코사이드향상시키는 효과가 있다면역

ECH는 세포 사멸로부터 DA 뉴런을 보호합니다

시험관 내 MPP1 또는 생체 내 MPTP 유도

PD에서 ECH의 작용을 확인하기 위해 1차 DA 뉴런에 MPP? 또는 MPP? 및 ECH. 시험관 내 실험에서 MPP? DA 뉴런의 생존력을 현저히 감소시켰고 이는 ECH에 의해 방지되었습니다.

(그림 8). 우리는 MPTP로 유도된 PD 및 대조군을 가진 마우스에서 다른 처리 후 SNc의 DA 뉴런에서 세포자멸사를 추가로 평가했습니다. MPTP 그룹보다 대조군에서 이 영역에서 더 많은 TH 양성 뉴런이 발견되었습니다(그림 9A). TUNEL 분석은 NS와 ECH가 SNc의 DA 뉴런에서 세포자멸사를 유도하지 않았지만 MPTP는 유도했고 ECH는 이에 대해 뉴런을 보호한다는 것을 보여주었습니다(그림 9B, S2). 흥미롭게도, PD의 마우스 모델에서 SNc의 용해물의 웨스턴 블로팅은 ATF3 및 CHOP 단백질 수준도 ECH에 의해 감소되었음을 보여주었다(그림 10).

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