파트 1: Echinacoside는 쥐의 대뇌피질 신경 말단에서 전압 의존성 Ca2와 진입 및 단백질 키나제 C를 억제하여 글루타메이트 방출을 억제합니다
Mar 05, 2022
연락처: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 이메일:audrey.hu@wecistanche.com
Cheng Wei Lu 1,2, Tzu Yu Lin 1,2, Shu Kuei Huang 1 및 Su Jane Wang 3,*
추상적인:
글루타메이트성 시스템은 신경보호 요법의 효과에 관여할 수 있습니다.에키나코사이드, 한약재에서 추출한 페닐에타노이드 배당체허바 시스탄체, 신경 보호 효과가 있습니다. 이 연구는에키나코사이드4-쥐의 대뇌피질 신경 말단(시냅토솜)에서 아미노피리딘 유발 글루타메이트 방출. Echinacoside는 농도 의존적 방식으로 Ca2+의존성 4-아미노피리딘 유발 글루타메이트 방출을 억제했지만 Ca2+비의존적 억제는 억제하지 못했습니다. Echinacoside는 또한 4-아미노피리딘에 의해 유발된 세포질 유리 Ca2 플러스 농도 증가를 감소시켰지만 시냅토솜 막 전위는 변경하지 않았습니다. 4-아미노피리딘 유발 글루타메이트 방출에 대한 에키나코사이드의 억제 효과는 Cav2.2(N형) 및 Cav2.1(P/Q형) 채널의 광범위한 차단제인 o-코노톡신 MVIIC에 의해 방지되었습니다. , 그러나 세포내 Ca2와 방출 억제제인 단트롤렌 및 7-클로로-5-(2-클로로페닐)-1,5-디하이드로-4에는 둔감했습니다. ,{30}}벤조디아제핀{31}}(3H)-온(CGP37157). 또한 echinacoside는 4-aminopyridine에 의해 유도된 protein kinase C의 인산화를 감소시켰고, protein kinase C inhibitors는 glutamate 방출에 대한 echinacoside의 효과를 없앴다. 이러한 결과에 따르면, 우리는 유발된 글루타메이트 방출에 대한 에키나코사이드의 억제 효과가 감소된 전압 의존성 Ca2 플러스 진입 및 후속적인 단백질 키나제 C 활성 억제와 관련이 있음을 시사한다.
키워드:에키나코사이드; 글루타메이트 방출; 대뇌피질 신경 말단; 전압 의존성 Ca2 플러스 채널; 단백질 키나제 C
1. 소개
에키나코사이드에 존재하는 주요 페닐에타노이드 배당체허바시스탄체, 건망증, 발기 부전 및 만성 변비 치료에 사용되는 잘 알려진 한약[1].에키나코사이드항산화, 항염, 항암, 간보호, 면역조절과 같은 다양한 생리활성을 가지고 있다[2-4]. 특히 echinacoside는 신경 보호 효과가 있습니다. 예를 들어, 쥐의 일차 피질 뉴런, 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포 및 갈색세포종(PC12) 세포에서 산화 스트레스 또는 신경독으로 유발된 신경 독성으로부터 보호할 수 있습니다[5-8]. 또한 echinacoside는 파킨슨병, 알츠하이머병 및 중뇌동맥 폐쇄 동물 모델에서 뇌 손상을 약화시키고 인지 기능을 향상시킵니다[9-12]. 그러나 그 메커니즘을 통해에키나코사이드신경 보호를 유도하는 것은 완전히 이해되지 않습니다.
신경 보호는 독성 손상 시 신경 구조와 기능을 보존하는 복잡한 과정입니다. 글루타메이트 흥분독성 감소는 뇌 신경보호와 관련된 잠재적인 메커니즘으로 간주됩니다. 흥분성 아미노산 신경전달물질인 글루타메이트는 여러 뇌 기능에서 중요한 역할을 합니다[13]. 그러나 높은 글루타메이트 농도에서 글루타메이트 수용체의 과활성화는 세포 내 Ca2와 과부하, 미토콘드리아 기능 장애, 자유 라디칼 생성 및 신경 세포 사멸을 유발합니다[14,15]. 이 병리학적 과정은 뇌허혈, 외상성 뇌손상, 간질 및 신경퇴행성 질환을 포함한 수많은 뇌 장애에 연루되어 있습니다[16,17]. 따라서 병태생리학적 글루타메이트 전달을 차단하는 억제제는 잠재적인 신경 보호 약물로 간주됩니다. 이들의 주목할만한 예는 글루타메이트 수용체 길항제[18,19]; 그러나 이러한 약물에 대한 임상 시험은 덜 효과적이고 바람직하지 않거나 심지어 세포 독성 부작용으로 인해 실패했습니다[20,21]. 직접적인 글루타메이트 수용체 차단에 더하여, 글루타메이트 방출 억제는 신경보호를 위한 효과적인 전략일 수 있습니다. 여러 신경 보호제(예: 메만틴 및 릴루졸)는 쥐의 뇌 조직에서 글루타메이트 방출을 감소시킬 수 있습니다[22-24].
흥분독성에서 글루타메이트의 역할과 에키나코사이드의 신경보호 프로필을 고려하여, 본 연구는 글루타메이트 방출에 대한 에키나코사이드의 영향을 조사하기 위해 쥐 대뇌 피질에서 정제된 분리된 신경 말단(시냅토솜)을 사용하고 잠재적인 메커니즘을 추가로 탐구했습니다. 분리된 신경 말단 준비는 시냅스 후 효과가 없는 약물에 의한 신경 전달 물질 방출의 시냅스 전 조절을 연구하기 위한 잘 정립된 모델입니다[25]. 이 모델을 사용하여 우리는 글루타메이트 방출, 막 전위, 시냅스 전 Ca2 플러스 유입 및 단백질 키나제 C 활성에 대한 echinacoside의 효과를 평가했습니다. 문헌에 대한 우리의 검토에 따르면, 이것은 echinacoside가 시냅스 전 수준에서 내인성 글루타메이트 방출을 억제하는 메커니즘을 문서화한 첫 번째 보고서입니다.
2. 결과
2.1. 에키나코사이드4-수포성 엑소사이토시스를 감소시켜 쥐의 대뇌피질 신경 말단에서 아미노피리딘 유발 글루타메이트 방출을 억제합니다.
그림 1은 정제된 쥐의 대뇌피질 시냅토솜에서 4-아미노피리딘 유발 글루타메이트 방출에 대한 에키나코사이드의 농도 의존적 효과를 보여줍니다. 1mM CaCl2로 배양된 시냅토솜에서 1mM 4-아미노피리딘은 7.4 ± {{1{{20}}}.1nmol/mg/5분의 글루타메이트 방출을 유발했으며, 이는 감소했습니다. 1, 5, 1{28}}, 30 및 50uM 에키나코사이드를 6.5 ± 0.2, 5.8 ± 0.3, 4.8 ± 0.2로,
각각 4.1 ± 0.1 또는 2.3 ± 0.4 nmol/mg/5분(F(5,24)=67.1, p=0. 000). 용량 반응 곡선에서 유도된 {{17}아미노피리딘 유발 글루타메이트 방출의 에키나코사이드 매개 억제에 대한 IC50 값은 24uM이었습니다. 더욱이, 300uM 에틸렌 글리콜 비스(-아미노에틸 에테르)-N,N,N/,N/-테트라아세트산(EGTA)을 함유하는 세포외 Ca2+-무함유 용액에서 1mM 4-아미노피리딘에 의해 유발된 글루타메이트 방출 2.1 0.2 nmol/mg/5분(F(2,12)=310.65, p=0.{38}}),
4-아미노피리딘 유발 글루타메이트 방출의 이 Ca2+독립적 성분은 20uM 에키나코사이드(1.8 ± 0.2 nmol/mg/5분, p {{1 0}}.58, 그림 1). 0.1 uM 바필로마이신 A1으로 처리된 시냅토솜에서 소포 수송체 억제제[26], 4-아미노피리딘 유발 글루타메이트 방출이 현저히 감소했습니다(2.2 ± 0.2 nmol/mg/ 5분, F(2,12)=249.518, p=0.000). bafilomycin A1이 있는 경우 2{65}} uM echinacoside는 글루타메이트 방출을 유의하게 억제하지 못했습니다(2.1 ± 0.2 nmol/mg/5 min; p{37}}.94; 그림 1). 대조적으로, 10 uM DL-트레오-베타-벤질-옥시아스파테이트(DL-TBOA, 글루타메이트 재흡수 억제제)[27]는 4-아미노피리딘 유발 글루타메이트 방출을 11.8 ± 0.4 nmol/mg/5분으로 증가시켰습니다( t(8)=-11.31, p=0.{58}}). DL-TBOA가 있는 경우에도 20uM echinacoside는 4-아미노피리딘 유발 글루타메이트 방출을 유의하게 억제했습니다(7.7 ± 0.2 nmol/mg/5 min; F(2,12)=87.23, p=0.000; 그림 1).
2.2 Echinacoside는 세포질 Ca2와 농도를 감소시키지만 시냅스막 전위를 변경하지 않습니다
1mM 4-아미노피리딘에 의한 시냅토솜 탈분극은 Ca2 + 농도를 증가시켰습니다(p=0.000; 표 1). 20 uM 에키나코사이드의 적용은 기초 Ca2 + 농도(t(8)=0.06, p=0.95)에 유의미한 영향을 미치지 않았지만 4-아미노피리딘으로 유도된 Ca2 플러스 농도(t(10)=6.16, p=0.{20}}). 또한, 1mM 4-aminopyridine은 3',3',3'-dipropylthiadicarbocyanine iodide[DiSC3(5)] 형광에서 증가했습니다(p= 0.{30}}). 20 uM 에키나코사이드의 추가는 휴지 막 전위(t(8)=0.976, p=0.36)를 변경하지 않거나 DiSC3의 4-아미노피리딘 매개 증가를 유의하게 변경하지 않았습니다. (5) 형광(t(8)=-0.014, p=0.99; 표 1).
2.3 감소된 Ca2와 Cav2.2(N-유형) 및 Cav2.1(P/Q-유형) 채널을 통한 유입은 Echinacoside에 의한 4-아미노피리딘 유발 글루타메이트 방출 억제와 관련될 수 있습니다
그림 2는 N형 및 P/Q형 Ca2 플러스 채널 차단제인 2uM o-코노톡신 MVIIC가 4-아미노피리딘 유발 글루타메이트 방출을 7.4 ± {{1{13}}}}로 감소시켰음을 보여줍니다. 2 ~ 2.0 ± 0.1nmol/mg/5분(t(9)=25.35, p=0.{21}}). o-코노톡신 MVIIC가 있는 경우 4-아미노피리딘 유발 글루타메이트 방출에 대한 20μM 에키나코사이드의 효과는 중요하지 않았습니다(1.{27}}± + 0.2nmol/mg/5분, t(8)=1.06,p=0.32). Dantrolene (10 uM), 소포체에서 세포내 Ca 방출 억제제
그물[28], 감소된 4-아미노피리딘 유발 글루타메이트 방출(5.6 ± 0.3 nmol/mg/5분; F(2,14) {{1{17}}}}. 95, p=0.{13}}). 그러나 dantrolene이 있는 경우 20uM echinacoside는 여전히 글루타메이트 방출을 상당히 억제할 수 있습니다(3.3 ± 0.2nmol/mg/5분; p=0.{21}}). 100 uM 7-클로로{24}}(2-클로로페니){26}},{27}}디히드로{28}},{29}}벤조티아제핀을 사용해도 유사한 결과가 관찰되었습니다. -2(3H)-온(CGP37157), 미토콘드리아 Na + /Ca2 + 교환의 막 투과성 차단제. 5개의 검사된 시냅토솜 제제에서 100uM CGP37157과 결합된 20uM 에키나코시드는 4-아미노피리딘 유발 글루타메이트 방출을 48.3% ± 5.2% 감소시켰습니다(F(2,13) = 136.79, p {{ 49}}.{50}}), echinacoside 단독에 의한 억제와 유사합니다(46.2% ± 2.3% ; p=0.89; 그림 2).
2.4 에키나코사이드4-단백질 키나제 C를 통한 신호 전달로 아미노피리딘 유발 글루타메이트 방출 억제
도 3에 도시된 바와 같이, 10 uM 2-[1-(3-디메틸아미노프로필)인돌-3-일]-3-(인돌{7}}일)말레이미드 (GF109203X), 일반적인 단백질 키나제 C 억제제[29]는 4-아미노피리딘 유발 글루타메이트 방출을 감소시켰습니다(F(2,13) = 19.46, p{16}}.{17 }}). GF109203X 처리 시냅토솜에서 20uM 에키나코사이드는 아미노피리딘 유발 글루타메이트 방출을 5.5% ± 1.8%(p=0.89)만 감소시켰으며, 이는 에키나코사이드 단독(42.4% ± 2.3%)보다 적습니다. 퍼센트 ; p=0.000). 5,6,7,{38}}테트라하이드로{39}}메틸{40}}옥소{41}}H-인돌로[2,{44}}a]피롤로[3 ,4-c]카르바졸{47}}프로판니트릴(Go6976), Ca2+의존성 단백질 키나제 C 이소폼(, I, II, y)에 대한 선택성 [29]. 3 uM Go6976이 있을 때 20 uM 에키나코사이드는 글루타메이트 방출을 11.9% ± 2.9% 감소시켰으며(p{59}}.59), 이는 에키나코사이드 단독(42.4% 2.3%, p {{ 65}}.000; 그림 3). 대조적으로, Ca2+독립적 단백질 키나제 C6 억제제인 3uM rottlerin[30]은 4-아미노피리딘(1mM) 유발 글루타메이트 방출을 크게 변경하지 않았습니다(p=0.45). 그럼에도 불구하고, rottlerin이 있는 경우 20uM echinacoside는 평균 37.1% ± 5.6%의 방출 억제를 효과적으로 유발했습니다(F(2,13) = 19.72, p=0.{88 }}), echinacoside 단독에 의한 것과 유사합니다(p=0.41; 그림 3). 또한, 미토겐 활성화 단백질 키나제 억제제2-(2-아미노-3-메톡시페닐)-4H-1-벤조피란-4-온)(PD98059 )(50 uM) 및 단백질 키나제 A 억제제 N-[{102}}(p-브로모신나밀아미노)에틸]{104}}이소퀴놀린설폰아미드(H89)(100 uM)는 아미노피리딘 유발 글루타메이트 방출 감소 (p=0.{110}}). PD98059 또는 H89가 있는 경우에도 20uM 에키나코사이드는 방출을 효과적으로 감소시켰습니다(F(2,13) = 52.3, p=0.{119}}, 그림 3).
그림 4는 1mM 4-아미노피리딘이 시냅토솜에서 단백질 키나제 C의 인산화를 증가시켰음을 보여줍니다(t(4)=-6.871, p=0.002). 4-아미노피리딘을 첨가하기 전에 시냅토솜을 20 uM 에키나코사이드로 10분 동안 전처리한 경우, 4-아미노피리딘 유도 단백질 키나제 C의 인산화가 상당히 감소했습니다(F(2,6)=29.202 , p=0.001).
2.5 글루타메이트 방출의 Echinacoside 매개 억제는 감마-아미노부티르산 A형(GABAA) 수용체를 포함하지 않습니다
그림 5에서는 SR95531(GABAA 수용체의 길항제)의 부재 또는 존재 하에서 4-아미노피리딘 유발 글루타메이트 방출에 대한 에키나코사이드의 효과를 비교했습니다. 또한, 100μM SR95531은 4-아미노피리딘(1mM) 유발 글루타메이트 방출을 크게 변경하지 않았습니다. SR{9}} 처리된 시냅토솜에서 20 uM 에키나코사이드의 적용은 4-아미노피리딘 유발 글루타메이트 방출(F(2,12)=42.63, p { {18}}.{19}}), echinacoside 단독에 의해 생성된 억제와 크게 다르지 않았습니다(40% ; p=0.{22}}). 다른 GABAA 수용체 길항제인 비쿠쿨린(50 uM)에서도 유사한 결과가 얻어졌습니다. 비쿠쿨린과 에키나코사이드의 존재하에서 측정된 방출은 비쿠쿨린 단독 존재하에서 얻은 것과 상당히 달랐습니다(p=0.{25}}).
3. 토론
본 연구에서는,에키나코사이드, Herba의 활성 화합물시스탄체, 4-쥐의 대뇌 피질 신경 말단에서 아미노피리딘 유발 글루타메이트 방출을 억제했습니다. 가능한 기본 메커니즘에키나코사이드-글루타메이트 방출의 매개된 억제는 여기에서 더 조사되고 논의됩니다.
3.1 글루타메이트 방출의 Echinacoside 매개 억제의 기초 메커니즘
4-아미노피리딘에 의해 유발되는 글루타메이트 방출은 2가지 구성요소를 포함합니다. 생리학적으로 관련된 Ca2+의존성 성분, 이는 글루타메이트를 함유하는 시냅스 소포의 세포외 배출을 통해 생성되고; 및 Ca2+-독립적 성분은 장기간의 탈분극으로 인해 막 전위 매개된 글루타메이트 수송체 정상 상태의 외부 방향으로의 이동을 유발하여 세포질 글루타메이트 유출에 영향을 미칩니다[31]. 여기에서 우리는 echinacoside가 Ca2+-free 배지(Ca2+-독립적 방출)의 존재하에서 4-아미노피리딘 유발 글루타메이트 방출을 유의하게 억제하지 않는다는 것을 관찰했습니다. 또한 관찰된 4-아미노피리딘 유발 글루타메이트 방출의 에키나코사이드 매개 억제는 바필로마이신 A1(시냅스 소포의 글루타메이트 함량 고갈)에 의해 효과적으로 방지되었지만 DL-TBOA(모든 흥분성 아미노산을 비선택적으로 억제 트랜스포터 서브타입). 이러한 결과는 echinacoside가 신경 말단 원형질막 글루타메이트 수송체의 역전을 통한 글루타메이트의 Ca2 플러스 독립적 세포질 유출에 영향을 미치지 않으면서 글루타메이트 방출의 Ca2 플러스 의존성 엑소사이토시스에 영향을 미친다는 것을 시사한다. 시냅스 말단에서 Na+채널 억제 또는 K+채널 활성화는 막 흥분성을 안정화시키고 결과적으로 유발된 Ca2+ 진입 및 신경전달물질 방출을 감소시킨다[32,33]. 따라서 에키나코사이드 매개 글루타메이트 방출 억제의 잠재적 메커니즘은 시냅토솜 흥분성의 감소를 포함합니다. 그러나 이 가능성은 두 가지 관찰에 근거하여 지지할 수 없습니다. (1) 4-막 전위에 민감한 염료 DiSC3(5)로 측정한 4-아미노피리딘 유발 막 전위 탈분극은 에키나코사이드의 첨가에 의해 영향을 받지 않았습니다. (2) echinacoside는 4-아미노피리딘에 의해 유발된 Ca2+-독립적인 글루타메이트 방출에 영향을 미치지 않았으며, 이는 막 전위에만 의존하는 방출 성분입니다[31]. 효과가 시냅토솜 흥분 억제에 의한 것이 아니라면, Cav2.2(N-형) 및 Cav2.1(P/Q-형) Ca2 플러스 채널의 활성 감소를 통해 나타날 수 있습니다. 신경 말단 [34-36]. fura{47}}를 사용하여 우리는 echinacoside가 4-아미노피리딘에 의해 유발된 Ca2 + 농도 증가를 상당히 감소시킨다는 것을 보여줍니다. 또한, 우리 데이터에 따르면 아미노피리딘 유발 글루타메이트 방출에 대한 에키나코사이드의 억제 효과는 Cav2.2(N형) 및 Cav2 차단제에 노출된 후 42.4% 2.3%에서 12.1% 3.9%로 감소했습니다. .1(P/Q형) Ca2 플러스 채널. 또한, 우리는 세포 내 Ca2와 방출 억제제의 존재 하에서 에키나코사이드가 4-아미노피리딘 유발 글루타메이트 방출을 유의하게 계속 억제한다는 것을 관찰했습니다. 이러한 결과는 Cav2.2(N형) 및 Cav2.1(P/Q형) Ca2 플러스 채널 활성의 동시 억제가 에키나코사이드 매개 글루타메이트 방출 억제의 잠재적인 메커니즘임을 나타냅니다. 그러나 Cav2.2(N형) 및 Cav2.1(P/Q형) Ca2 + 채널 활성의 결합된 활성화는 에키나코사이드의 작용을 완전히 차단할 수 없습니다. 따라서 다른 미확인 유형의 Ca2 플러스 채널 또는 다른 시냅스 전 경로가 억제에 관여할 수 있습니다. 예를 들어, GABAA 수용체는 시냅스 전 수준에 존재하며 이들의 활성화는 Ca2와 유입 및 글루타메이트 방출을 억제하는 것으로 나타났습니다[37]. 현재의 연구에서 GABAA 수용체 길항제 SR95531과 비쿠쿨린은 에키나코사이드 매개 글루타메이트 방출 억제를 차단하지 않았으며, 이는 GABAA 수용체가 전압 의존성 Ca2 플러스 채널 활성의 감소와 글루타메이트 방출의 후속 억제에 관여하지 않는다는 것을 시사합니다. 전압 의존성 Ca2 플러스 채널을 통한 Ca2 플러스 진입은 미토겐 활성화 단백질 키나제, 단백질 키나제 C 및 단백질 키나제 A를 포함하여 신경 말단에서 글루타메이트 방출과 관련된 여러 단백질 키나제를 활성화합니다. 여기에서 우리는 단백질 키나제 C 억제제가 에키나코사이드를 효과적으로 길항한다는 것을 입증합니다. -글루타메이트 방출의 매개 억제; 그럼에도 불구하고, mitogen-activated protein kinase inhibitor PD98059 또는 protein kinase A inhibitor H89는 효과가 없었다. 또한 {{101}단백질 키나제 C의 아미노피리딘 유도 인산화는 글루타메이트 방출 억제에 효과적인 농도의 에키나코사이드로 전처리한 후 시냅토솜에서 감소했습니다. 따라서 에키나코사이드 매개 글루타메이트 방출 억제의 신호 전달 경로는 단백질 키나제 C를 포함할 수 있습니다. 단백질 키나제 C는 시냅스 전 수준에 존재하고 신경전달물질 엑소사이토시스에서 중요한 역할을 하는 중요한 세포내 신호전달 시스템입니다. 예를 들어, myristoylated alanine-rich C kinase 기질과 같은 시냅스 소포 트래피킹 또는 모집 및 엑소사이토시스에 관여하는 여러 시냅스 단백질은 단백질 키나제 C에 의해 인산화됩니다[38,39]. 이 인산화 과정은 탈분극으로 자극된 Ca2와 글루타메이트 방출을 촉진하는 유입에 의해 증가될 수 있습니다[40]. 따라서 우리는 여기서 관찰된 Ca2 플러스 진입에 대한 에키나코사이드의 억제 효과가 단백질 키나제 C 활성을 감소시키고 결과적으로 글루타메이트 방출을 감소시킬 수 있다고 합리적으로 추측할 수 있습니다.
