제 1 부 : 쥐의 알츠하이머 병과 결합 된 골다공증의 동시 실험 모델 수립 및 Cistanche Tubulosa의 Echinacoside와 Acteoside의 이중 효과
Mar 24, 2022
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이순신, Ying-Qi Li, Jia-Yi Fang, Ping Li, Fei Li
추상적인
민족 약리학 적 관련성 : Cistanche tubulosa골다공증의 치료에 널리 사용 된 귀중한 전통 중국 의학이며알츠하이머 병.에키나코사이드acteoside는 연구 가치를 지닌 약리학 적 활동을하는 Cistanche tubulosa의 주요 활성 성분입니다. 에키나코사이드와액테오사이드학습 및 기억 능력을 향상시키고 조골 세포의 증식과 분화를 촉진 할 수 있습니다. 연구의 목적 : Echinacoside와 acteoside에서Cistanche tubulosa항 골다공증과 항 알츠하이머 병의 중요한 활성을 보여 주었지만, 이러한 효과는 쥐 모델에서 동시에 연구되지 않았습니다. 이 연구의 목적은 골다공증의 모델을 수립하고 검증하는 것이 었습니다.알츠하이머 병쥐에서 그리고 이중 효과를 조사하기 위하여에키나코사이드그리고이 동시 모델에 acteoside.
재료 및 방법 :난소 절제술 (OVX), D-갈락토오스 및 AlCl3 (D)를 사용한 가짜 수술, D- 갈락토오스 및 AlCl3 (OVX + D)를 사용한 난소 절제술의 세 가지 모델 그룹이 동시에 설정되었습니다. 약물 치료 그룹의 래트를 난소 절제술하였다. 약물 치료군의 래트에 D-갈락토오스의 복강내 주사 및 AlCl3의 위내 투여를 실시하면서, 래트를 경구 투여하였다.에키나코사이드(90 밀리그램/kg/d),액테오사이드(90 mg/kg/d) 및 에스트라디올 발레레이트(0.6 mg/kg/d), 도네페질 HCl(0.8 mg/kg/d)의 양성 대조군 약물. 8주의 약물 처리 후, 6일 동안 모리스 워터 미로(MWM) 시험을 먼저 수행하였다. 그런 다음 쥐를 희생시켜 혈액, uteri, 대퇴골, 경골 및 뇌 조직을 수확했습니다. 혈청을 생화학적 시험에 사용하였다. uteri는 조직소모홈계에 사용되었다. 오른쪽 대퇴골은 Micro-에 사용되었습니다.코네티컷및 히스토모포홈트리, 각각. 오른쪽 경골이 생체역학적 시험에 사용되었다. 아이스박스에 수집된 해마는 생화학적 시험에 사용되었다. 관류에 의해 수집된 뇌(41)를 조직호화성 측정에 사용하였다.
결과:Sham과 비교하여 OVX + D 그룹은 산화 손상을 일으키고 해마의 뉴런을 손상시키고 아세틸 콜린의 가수분해 및 합성에 영향을 미침으로써 학습 및 기억 능력을 크게 감소시킬 수 있습니다. 한편, OVX+D 그룹에서 BALP 및 TRAP의 활성이 유의하게 증가하였다(P<0.001) as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" in="" addition,="" compared="" with="" the="" sham="" group,="" the="" mean="" bone="" mineral="" density="" obviously="" decreased=""><0.05), the="" trabecular="" bone="" mass="" and="" microarchitecture="" were="" also="" destroyed="" significantly="" in="" the="" ovx+d="" group.="" furthermore,="" the="" maximum="" load="" and="" maximum="" stress="" significantly="" reduced=""><0.01) and="" the="" energy="" 50="" absorption="" also="" decreased="" greatly="" as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" after="" being="" administrated="" with="">에키나코사이드그리고액테오사이드골다공증의 전형적인 병리학 적 특징과알츠하이머 병개선되었다.
결론:골다공증의 모델과 결합알츠하이머 병쥐에서 실현 가능하고 성공적으로 확립되었습니다.에키나코사이드acteoside는이 동시 모델에 몇 가지 중요한 영향을 보여 주었고 잠재적 인 56 후보가 될 수 있습니다.Cistanche tubulosa추가 연구를위한 이중 효과.
키워드:골다공증; 알츠하이머 병; 이중 효과; 에키나코사이드; 액터사이드; Cistanche tubulosa
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1. 소개
골다공증은 뼈 질량의 점진적 손실과 취약성 골절의 위험을 증가시킬 수있는 미세 구조의 파괴를 특징으로하는 퇴행성 골 질환입니다 (Rachner et al., 2011).알츠하이머 병(AD)는 임상에서 지속적인 정신 쇠퇴,인지 장애 및 독립적 인 생활 능력의 상실을 특징으로하는 노인의 일반적인 신경 퇴행성 질환입니다 (Reitz 76 et al., 2011). 노인성 플라크의 형성-β-아밀로이드 침착, 타우 과인산화에 의한 신경세동 엉킴, 및 뇌에서의 뉴런 변성에 의해 유도된 것은 AD의 전형적인 병리학적 특징이다(Serrano-Pozo et al., 2011). 표면적으로, OP와 AD는 다른 병리학 및 임상 적 특징을 가진 완전히 독립적 인 질병입니다. 그러나, OP 및 AD는 종종 임상 실습에서 공동-발생하는 것으로 관찰된다 (Zhang et al., 2001; Lui et al., 2003; Luckhaus et al., 2009). 두 질병의 유병률은 나이가 들수록 특히 폐경 후 여성에서 증가했습니다 (Li et al., 2017; 스턴, 2012). 점점 더 많은 증거가 AD로 진단 된 사람들이 OP의 위험이 증가한다는 것을 나타냅니다 (Zhou et al., 2014).
골다공증과 골다공증의 관계를 연구하고 명확히 할 필요가 있습니다.알츠하이머 병시험관 내 및 생체내에서. 연구가 생체내에서 수행되기 전에, 골다공증 또는 알츠하이머병의 적용 가능한 동물 모델을 선택하는 것이 중요하다. 골다공증 모델은 레티노산의 위내 투여, 난소 절제술 수술 및 글루코 코르티코이드의 근육 내 주사와 같은 여러 종류의 방법에 의해 확립 될 수 있습니다 (Wei et al., 2007; 코모리, 2015). 특히, 쥐의 난소 절제술에 의해 유도되는 폐경 후 골다공증 모델은 고전적이었고대부분의 연구에서 널리 사용되어 왔다 (Miao et al., 2012; Liu et al., 2017).산발적 인 알츠하이머 병은 알츠하이머 병의 주요 유형입니다. 동물산발적 인 모델알츠하이머 병다음과 같은 다양한 방법에 의해 유도될 수 있었다.D- 갈락토오스의 주입 또는β-아밀로이드, AlCl의 위내 투여3,등등(Bagheri et al., 2011; Gao et al., 2015; Justin thenmozhi et al., 2017). 또한,장기 복강내 침강에 의해 유도되는 알츠하이머병의 결합 모델난소 절제술과 결합 된 D- 갈락토오스의 주입 또한 많이 연구되어 왔습니다 (Liuet al., 2010; Zhao et al., 2012). 골다공증의 관련성을 밝히기 위해알츠하이머 병, 골다공증의 결합 모델을 수립 할 필요가있다알츠하이머 병으로 의약품의 일반적인 메커니즘을 연구하기 위해골다공증과알츠하이머 병 디스효소.
Cistanche tubulosa(셴크) 와이트는 주로 중국 북서부의 사막에 분포하는 기생 식물입니다. 말린 즙이 많은 줄기의Cistanche tubulosa(CT)는 중국 약전 (2015)에서 Roucongrong의 중국 이름을 가진 Cistanches Herba라는 유명한 강장제로 사용됩니다. 그것은 "사막의 인삼"으로 영예를 얻었으며 전통 한의학에서 허리와 무릎 통증, 여성 불임 및 변비 치료에 널리 사용됩니다 (Jiang and Tu, 2009). CT의 주요 활성 성분은 페닐에타노이드 배당체 (PhGs), 에키나코시드 (ECH) 및액테오사이드(ACT)는 PhGs에서 대표적인 화합물이다(Morikawa et al., 2014). 특히, ECH 및 ACT는 일반적으로 높은 함량과 신경 보호, 뼈 보호의 효과와 같은 다양한 약리학 적 활동으로 인해 CT의 품질 관리를위한 마커로 선택되며,
항산화제, 노화방지, 학습능력 및 기억력 향상 (Wang et al.,2012; Li et al., 2016). 그러나 ECH와 ACT가 골다공증에 미치는 영향와 결합알츠하이머 병아직 쥐 모델에서 함께 연구되지 않았다.따라서, 본 연구의 목적은 골다공증이 결합된 래트 모델을 확립하는 것이었다.알츠하이머 병과 함께 그 효과를 탐구하십시오.에키나코사이드그리고 이것에 액테오사이드동시 모델, 그래서 추가 연구를위한 실험 증거를 제공하기 위해다음 연구에서 에키나코사이드 또는 액테오사이드의 분자 메카니즘.
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2. 재료 및 방법
2.1. 동물
체중이 180~200g인 여덟 여덟 명의 8주령 암컷 위스타 쥐(증명서번호: SCXK 2018-0006)를 중영영국 SIPPR/BK Lab. Animal Ltd(중국 상하이)로부터 인수하여 중국 제약대학교 제약동물 실험센터에서 기른다.
2.2. 화학물질 및 시약
클로랄 하이드레이트, 페니실린 G 나트륨, D-갈락토오스, 염화알루미늄 헥사하이드레이트, 에스트라디올 발레레이트, 도네페질 HCl은 알라딘 공업사(중국 상하이)로부터 구입하였다.에키나코사이드(HPLC 94%)는 청두 Wecistanche Bio-Technology Co., Ltd. (중국 청두)로부터 입수하였다.액테오사이드(HPLC 98%)는 Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd.(Baoji, China)로부터 구입하였다. 골 특이적 알칼리성 포스파타제(BALP), 타르트레이트 내성 산 포스파타제(TRAP), 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD), 말론알데히드(MDA), 아세틸콜린에스테라제(AChE), 및 콜린 아세틸트랜스퍼라제(ChAT) 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 키트는 상하이 효소 결합 생명공학(주) 주식회사(상하이, 중국)로부터 구입하였다. 유니버설 조직 고정제는청두 Wecistanche 생명 공학 유한 회사 (청두, 중국).
에키나코사이드
2.3. 동물 모델 및 치료
모든 동물 실험은 중국 제약 대학의 동물 윤리위원회에 의해 승인되고 감독되었습니다. 쥐는 온도 조절 실 (22 ±2 ° C)에서 12 시간의 빛 / 어두운 사이클로 유지되고 표준 펠릿 사료 및 수돗물을 공급했습니다.
일주일의 적응 후, 골다공증 모델은 난소 절제술 수술을 실시함으로써 달성되었다 (French et al., 2008). 수술이 끝난 후, 페니실린 G 나트륨을 감염을 예방하기 위해 상처 봉합사에 한 번 뿌렸다. 그 후 쥐들은 삼주 동안 정상적으로 먹이를 주었다. 참고문헌에 따르면 (Hua et al., 2007; Alawdi et al., 2017), 모델알츠하이머 병난소 절제술과 결합된 D-갈락토오스의 장기 복강내 주사 또는 AlCl3의 장기 위내 투여에 의해 유도될 수 있었다. 알츠하이머병과 결합된 골다공증 모델의 타당성을 연구하기 위해, 난소 절제술의 세 가지 모델 그룹(OVX 그룹), 150mg/kg/d D-갈락토오스의 복강내 주사를 통한 가짜 수술, 30mg/kg/d AlCl3(D 군)의 위내 투여, 150mg/kg/d D-갈락토오스의 복강내 주사를 통한 난소 절제술 및 30mg/kg/d AlCl3(OVX+D 그룹)의 위내 투여가 본 연구에서 설정되었다.
따라서 쥐는 3 주 후에 무작위로 8 그룹 (각 그룹마다 n = 9)으로 나뉘어지고 8 주 동안 의약품으로 경구 치료되었습니다 : 샴 그룹; OVX 기; D 기; OVX+D 그룹; 에스트라디올 발레레이트 처리군 (EV 군, OVX+D+0.6 mg/kg/d 에스트라디올 발레레이트); 도네페질 HCl 처리군 (DPZ 군, OVX+D+0.8 mg/kg/d 도네페질 HCl);에키나코사이드치료 그룹 (ECH 그룹, OVX+D+90 mg/kg/d 에키나코사이드);액테오사이드치료군 (ACT 그룹, OVX+D+90 mg/kg/d acteoside). 인간-쥐 등가 용량 전환 원리 및 관련 기준으로부터의 투여량에 따르면 (Li et al., 2013; Gao et al., 2014), 본 연구에서 약물 치료 그룹의 투여량이 채택되었다.
각 랫트의 체중은 매주 측정하였다. 8 주 동안 지속되는 약물로 전체 치료 후, 6 일 동안 모리스 워터 미로 (MWM) 테스트가 처음 수행되었습니다. 그 후, 각 그룹으로부터 6마리의 래트를 희생시켜 재료를 수확하였다. 쥐는 3.0 mL / kg의 복강 내 주사로 마취되어 10 % 염소 수화물을 섭취하고 대동맥 복부에서 혈액을 채취했습니다. 혈액을 응고시키기 위해 실온에서 배치하고, 3500 r/min에서 10분 동안 원심분리하였다. 혈청을 1.5mL 원심분리 튜브(NEST Biotechnology)에서 수확하고 생화학 시험에 사용할 때까지 -80°C에서 보관하였다. 그런 다음 uteri, femora, tibiae 및 뇌 조직을 수집했습니다. uteri는 조직소모홈계에 사용되었다. 우측 대퇴골을 Micro-CT 및 조직호모홈계에 각각 사용하였다. 오른쪽 경골이 생체역학적 시험에 사용되었다. 아이스박스에 수집된 해마는 생화학적 시험에 사용되었다. 그 후, 각 그룹의 다른 세 마리의 쥐를 식염수와 보편적 인 조직 고정제로 심장에서 관류시켜 조직 소모 홈을 위해 뇌를 수확했습니다.
2.4. 모리스 워터 미로 (MWM) 테스트
래트는 개입 8주 후에 MWM 테스트에서 공간 기준 학습 및 기억 테스트를 실시하였다. MWM 시험은 이전에 보고된 방법에 따라 수행되었다(Morris, 1984; Gao et al., 2016). 간략하게, 하루에 네 번의 시험으로 5 일 연속으로, 쥐는 무독성 탄소 잉크 착색 된 물로 채워진 원형 수영장 (직경 130cm, 높이 50cm)에서 숨겨진 침수 플랫폼 (직경 11cm, 높이 29cm)을 찾기 위해 수영장 벽에 위치한 다양한 시각적 단서를 사용하도록 훈련되었습니다. 수영장은 상상 할 수 있듯이 네 개의 사분면으로 나뉘어졌으며 네 개의 시작 위치는 사분면의 교차로에 위치했습니다. 플랫폼은 사분면 중 하나의 중앙에 위치하고 있었고 재판 중에 위치가 일정했습니다. 각 시험에서, 래트는 선택된 위치에 무작위로 배치되었고, 수영장의 벽을 향하게 하였다. 각 임상시험은 쥐가 플랫폼에 도달했을 때 또는 60초 후에 종료되었고, 경과 시간은 탈출 지연 시간으로서 기록되었다. 플랫폼에 도달하지 못한 쥐가 그 플랫폼으로 안내되었습니다. 각 숨겨진 플랫폼 시험 후, 쥐는 10 초 동안 플랫폼에 남아있었습니다. 하루에 네 번의 시험의 평균 대기 시간은 훈련 결과로 계산되었습니다. 6 일째에, 모든 쥐는 플랫폼이없는 수영장에서 60 초 동안 수영하는 프로브 시험을 받았다. 플랫폼 위치에서의 횡단 시간과 목표 사분면에서의 이동 시간이 최종 결과로 기록되었습니다. 쥐는 수영장 바로 위의 천장에 장착 된 카메라로 모니터링되었으며, 모든 시험은 베이징 중시디창 과학 기술 개발 유한 회사 (중국 베이징)에서 제공 한 MORRIS MAZE 프로그램을 사용하여 기록 및 분석되었습니다.
2.5. ELISA에 의한 생화학적 시험
ELISA 키트의 제조사의 지시에 따라, 혈청 중의 골 특이적 알칼리성 포스파타제(BALP) 활성, 타르트레이트 내성 산 포스파타제(TRAP) 활성, 수퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 활성, 및 말론디알데히드(MDA) 함량을 BioTek Synergy 2 다중 모드 마이크로플레이트 리더(BioTek, USA)에 의해 시험하였다. 각 그룹으로부터의 해마 조직을 PBS (0.01 M, pH 7.4)로 세척하여 조직 표면에 남아있는 혈액 또는 불순물을 제거하였다. 한쪽의 해마 조직을 칭량 한 다음 가능한 한 작은 조각으로 자릅니다. 해마 조직을 1:9(조직 중량: PBS 부피)의 비율에 따라 균질화하였다. 균질액을 4°C, 3000 r/min에서 15분 동안 원심분리하였다. 상청액을 수집하고 희석하여 BCA 방법으로 단백질 농도를 측정하였다. 해마 조직에서의 아세틸콜린에스테라제 (AChE) 활성, 콜린 아세틸트랜스퍼라제 (ChAT) 활성, 수퍼옥사이드 디스뮤타제 (SOD) 활성, 및 말론디알데히드 (MDA) 함량을 ELISA 방법에 의해 시험하였다.
2.6. 해마 조직협착
뇌 조직 (n = 3 / 그룹)은 보편적 인 조직 고정제로 고정되었습니다. 이어서, 뇌 조직 샘플을 세척하고, 구배 에탄올로 탈수시키고, 파라핀 왁스로 포매하고, 5 μm의 코로나 절편으로 슬라이스하였다. 절편을 헤마톡실린 및 에오신(HE)으로 염색하였다. 그 후, 뇌 조직의 관상 동맥 절편을 거꾸로 형광 현미경 (Nikon, Japan)으로 촬영하였다. 해마에서 CA1, CA2, CA3 및 DG의 형태학적 변화가 특히 관찰되었다.
2.7. 자궁 조직형성학 및 형태학
선택된 uteri (n=3/group)를 유니버설 조직 고정제로 고정시켰다. 이어서, 자궁 조직 샘플을 세척하고, 구배 에탄올로 탈수시키고, 파라핀 왁스로 포매하고, 5 μm의 횡단 절편으로 슬라이스하였다. 절편을 헤마톡실린 및 에오신(HE)으로 염색하였다. 자궁의 횡단 절편을 관찰하고 촬영하였다. 다섯 개의 시야를 랜덤하게 선택하였고, 자궁 횡단 단면의 직경 및 자궁 점막 상피 두께를 Image-Pro Plus 6.0 소프트웨어를 사용하여 측정하였다. 라미나 프로프리아의 자궁 땀샘 수도 계산되었습니다.
2.8. 마이크로 CT
선택된 우측 대퇴골(n=3/group)을 SkyScan 1176 마이크로 X선 컴퓨터 단층촬영(Micro-코네티컷) 스캐너 (브루커, 독일). 원위 성장 플레이트를 기준 표면으로서 선택하였다. 기준 표면 아래 1mm의 거리로, 1.8mm 두께의 영역이 관심 있는 부피(VOI, 100층)로서 선택되었다. 생성된 그레이스케일 이미지는 뼈 재구성으로부터 17.76 μm의 픽셀 크기를 가졌다(65 kV, 385 μA). 반자동 윤곽 그리기 방법이 피질 뼈에서 trabeculae를 선택하기 위해 사용되었습니다. 직접 3D 측정 방법을 사용하여 동일한 VOI에 대한 골량 (BV / TV), 골 표면 밀도 (BS / TV), 섬유주 분리 (Tb. Sp), 섬유주 수 (Tb. N), 섬유주 두께 (Tb. Th), 구조 모델 지수 (SMI), 섬유주 패턴 인자 (Tb. Pd) 및 평균 골밀도 (평균 BMD)의 백분율을 평가하는 데 사용되었습니다.코네티컷분석기 프로그램 (브루커, 독일). 적응형 렌더링 알고리즘을 이용한 VOI의 3D 시각화는 CTvol 소프트웨어(Bruker, 독일)로 수행되었다.
시스탄체 식물 추출물
2.9. 뼈 조직종합
선택된 우측 대퇴골 (n=3/군)을 만능 조직 고정제에 고정시킨 다음, 3주 동안 10% EDTA-2Na의 용액에서 탈석회화시켰다. 탈석회화된 샘플을 세척하고, 구배 에탄올로 탈수시키고, 파라핀 왁스로 포매하고, 5 μm의 세로 절편으로 슬라이스하였다. 절편을 헤마톡실린 및 에오신(HE)으로 염색하였다. 대변의 세로 부분이 촬영되었습니다. 각 그룹의 뼈 조직 구조, 특히 섬유주 골 구조가 관찰되었다.
2.10. 생체역학적 시험
무작위로 선택된 오른쪽 경골 (n = 4 / 그룹)은 보편적 인 시험기 (SHIMADZU, 일본)를 사용하여 3 점 굽힘 테스트에 대해 평가되었습니다. 이들 샘플의 직경은 2.16-2.38 mm (d)의 범위에서 버니어 캘리퍼에 의해 측정되었다. 이어서, 샘플을 두 레일 사이의 거리가 25 mm (L)인 두 개의 지지 크로스바 상에 놓고, 시편의 생리학적 곡률이 위쪽으로 되었다. 하중의 적재봉은 시편의 중앙에 위치하여 시편이 파손 될 때까지 1.5mm / min의 일정한 속도로 떨어졌습니다. 힘(F)과 변위 데이터는 시험기와 인터페이스된 컴퓨터에 자동으로 기록되었고 하중 변형 곡선은 동시에 플로팅되었습니다. 최대 하중(N)과 에너지 흡수(mJ)의 값은 재료 시험 소프트웨어 TRAPEZIUM X에 의해 동시에 기록되었다. 최대 응력(MPa)의 값은 다음 공식에 따라 계산되었다: 응력(σ) = 굽힘 모멘트(M) / 단면 계수(Z) = (8×L×F)/(π×d3)
2.11. 통계 분석
모델 그룹의 결과를 Sham군과 비교하였고, 약물처리군의 결과를 OVX+D 군과 비교하였다. 데이터는 단방향 ANOVA를 사용하여 분석한 후 Graph Pad Prism 5.0 소프트웨어를 사용하여 Bonferroni의 다중 비교 테스트를 수행했습니다. 데이터는 SD± 평균으로 표시되었고, 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
미리세틴그리고시스탄체
