파트 1: 연상 기억을 설정하고 행동 표현을 급격히 종료할 수 있는 도파민성 뉴런의 식별
Mar 19, 2022
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Michael Schleyer,1* Alice Weiglein,1 Juliane Thoener,1 Martin Strauch,2 Volker Hartenstein,3
Melisa Kantar Weigelt,1 Sarah Schuller,1 Timo Saumweber,1 Katharina Eichler,4,5,6 Astrid Rohwedder,4,7 Dorit Merhof,2 Marta Zlatic,5,7 Andreas S. Thum,4,8 및 Bertram Gerber1,9 ,10*
1Leibniz Institute for Neurobiology, Department Genetics of Learning 및메모리, 39118 Magdeburg, Germany, 2Institute of Imaging & Computer Vision, RWTH Aachen University, 52056 Aachen, Germany, 3분자, 세포 및 발달 생물학, University of California, Los Angeles, California 90095-1606, 4University of Konstanz, Institute for Biology, 78464 Konstanz, Germany, 5HHMI Janelia Research Campus, Ashburn, Virginia 20147, 6신경생물학 연구소, 푸에르토리코 대학 의료 과학 캠퍼스, 올드 산 후안, 푸에르토리코 00901, 7캠브리지, 케임브리지 동물학과, 캠브리지 대학{ {12}}EJ, 영국, 8University Leipzig, Institute for Biology, 04103 Leipzig, Germany, 9Centre for Behavioral Brain Sciences, 39108 Magdeburg, Germany 및 10Institute for Biology, Otto von Guericke University Magdeburg, Germany, 39106
필수 자원을 찾기 위해 환경을 탐색하는 것에서 탐색에 성공하면 이러한 자원을 활용하는 것으로의 적응적 전환은 모든 동물에게 중요합니다. 여기에서 우리는 두 성별의 애벌레 Drosophila melanogaster가 이 탐사-착취 전환을 협상할 수 있도록 하는 신경 회로를 연구합니다. 우리는 Pavlovian 조건화와 고해상도 행동 추적, 개별적으로 식별된 뉴런의 광유전학적 조작, 시냅스 조직의 EM 데이터 기반 분석을 결합하여 그렇게 합니다. 우리는 도파민성 뉴런 DAN-i1의 광유전학적 활성화가 둘 다메모리훈련 중 및 후속 회상 테스트에서 학습된 검색 행동을 급격히 종료합니다. 그러나 활성화는 타고난 행동에 영향을 미치지 않습니다. 특히, DAN-i1 활성화는 냄새에 대한 짝 및 비 짝 훈련 후 반대 원자가의 연상 기억을 설정할 수 있으며 회상 테스트 중 활성화는 이러한 기억 중 하나에서 발생하는 검색 행동을 종료할 수 있습니다. 우리의 결과는 행동적 중요성에서 DAN-i1 활성화가 유사하지만 설탕 보상과 같지 않음을 시사합니다. DAN-i1과 두 가지 주요 표적인 케년 세포, 버섯체 출력 뉴런 MBON-i1 사이의 모든 시냅스 연결에 대한 덴드로그램 분석은 훈련 중 및 회상 테스트 중 DAN-i1 신호가 다음으로 전달될 수 있음을 시사합니다. 이전에 인식되지 않은 국소적으로 제한된 분기 구조 내에서 각각 Kenyon 세포와 MBON-i1에 연결되었습니다. 이것은 성공적인 완료에 대한 검색을 종료하는 우아한 회로 모티브를 제공합니다.
키워드: 도파민; 탐사 착취; 버섯 몸체; 광유전학; 보강; 검색
의의
생존을 위한 투쟁에서 동물은 먹이를 찾아 환경을 탐색해야 합니다. 그러나 일단 음식이 발견되면 지금 쓰고 있는 안경을 찾는 것만큼 무의미한 검색을 계속하는 것보다 음식을 이용하는 것이 우선시됩니다. 이 탐사-착취 트레이드오프는 동물과 인간, 그리고 기술 검색 장치에 중요합니다. 우리는 초파리 유충의 10개{3}} 뉴런 중 어느 것이 이 균형을 맞출 수 있는지 조사하고 그렇게 할 수 있는 DAN-i1이라는 단일 도파민 뉴런을 식별합니다. 동물왕에서 도파민 뉴런 기능의 유사성을 감안할 때-
dom의 경우 검색이 성공하면 검색이 종료되는 일반적인 원칙을 반영할 수 있습니다.
소개
주변 환경을 탐색하는 동물은 과거 경험을 사용하여 음식 검색을 안내할 수 있습니다. 그러나 음식이 발견되면 검색을 종료하고 대신 음식 소스를 악용하는 적응형입니다. 여기에서 우리는 유충 Drosophila melanogaster가 이 탐사-착취 전환을 협상할 수 있도록 하는 회로를 연구합니다. 세포 특이적 이식유전자 발현 및 시냅스 연결에 대한 지식과 결합된 애벌레 뇌의 수치적 단순성(Pfeiffer et al., 2010; Li et al., 2014; Eichler et al., 2017; Saumweber et al., 2018; Eschbach et al., 2020)에 따르면 개별적으로 식별된 뉴런 수준에서 이를 조사할 수 있습니다.
D. melanogaster 유충은 음식 보상과 냄새를 쉽게 연관시킵니다(Scherer et al., 2003; Gerber and Hendel, 2006; Schipanski et al., 2008; Rohwedder et al., 2012; Apostolopoulou et al., 2014; Kudow et al., 2014). , 2017, 2019). 결정적으로, 이러한 냄새-음식 연관성에 기반한 학습된 행동은 회상 테스트 동안 보상이 존재하는 경우 중단됩니다(그림 1A). 따라서 학습된 행동은 추구한 결과(즉, 보상)에 의해 적응적으로 종료되는 탐색으로 볼 수 있습니다(Schleyer et al., 2011, 2013, 2015a). 타고난 후각 행동은 마찬가지로 영향을 받지 않으며(그림 1B), 이러한 타고난 행동이 반사와 같은 방식으로 구성되어 있음을 시사합니다(Schleyer et al., 2011, 2013, 2015a,b). 따라서 자연적 보상은 두 가지 효과를 유도할 수 있습니다. 훈련 중에 보상 검색을 안내하는 단서와 연관될 수 있는 보상 신호를 제공합니다. 리콜 테스트 동안 그들은 이 학습된 검색을 급격하게 종료하여 동물이 일단 발견되면 자원에서 표류하는 것을 방지할 수 있습니다. 따라서 이러한 전환은 동기의 변화가 아니라 보상을 획득하기 위한 전략의 전환을 반영합니다(즉, 보상에 대한 관심 상실이 아님).
무척추동물과 무척추동물 모두 도파민성 뉴런(DAN)은 연관 학습을 위한 강화 신호를 제공합니다(Waddell, 2013; Schultz, 2015; Kaun 및 Rothenfluh, 2017). D. melanogaster에서 별개의 DAN 세트는 각각 식욕 강화 및 혐오 강화를 전달합니다(유충: Schroll et al., 2006; Rohwedder et al., 2016; Saumweber et al., 2018; Eschbach et al., 2020; 성충 파리: Schwaerzel et al., 2003; Claridge-Chang et al., 2009; Liu et al., 2012) (유사한 시나리오가 무척추동물도 출현할 수 있음: Lammel et al., 2012; Groessl et al., 2018; Menegas et al. 알., 2018). 구획 구조를 구축하는 이 DAN은 버섯 몸체라고 하는 곤충의 최상위 후각 중추의 고유 뉴런인 케년 세포(KC)의 평행 섬유와 교차합니다. 이 동일한 구획 구조를 존중하여 버섯 몸체 출력 뉴런(MBON)은 KC를 통해 정보를 수집하고 원심성 회로(그림 2A-D 참조)로 보냅니다(유충: Selcho et al., 2009; Pauls et al., 2010 ; Eichler et al., 2017; Saumweber et al., 2018; Eschbach et al., 2020; 성인: Sejourne et al., 2011; Places et al., 2013; Aso et al., 2014a,b; Oswald and Waddell , 2015; Takemura et al., 2017). 특히, 최근의 전자 현미경 재구성은 DAN이 KC와 MBON의 두 가지 주요 표적을 가지고 있음을 보여주었습니다(그림 2B 참조)(유충: Eichler et al., 2017; 성충: Takemura et al., 2017).
D. melanogaster 유충에서 pPAM 클러스터의 DAN 활성화는 훈련 중에 보람 있는 효과를 발휘할 수 있습니다(Rohwedder et al., 2016). 이 클러스터의 4일 동안 2개는 개별적으로 이러한 보상 효과를 부여할 수 있습니다(DAN-h1 및 DAN-i1)(Saumweber et al., 2018). 여기에서 우리는 집중하기로 결정했습니다.
그림 1. Sugar는 보상 및 검색 종료 신호를 제공할 수 있습니다. 유충은 냄새가 설탕과 짝을 이루거나 짝을 이루지 않은 상태로 나타나도록 훈련되었습니다. 후속 회상 테스트에서 설탕이 없거나 존재할 때 냄새 선호도에 대해 분석되었습니다(위쪽 스케치). 설탕이 없는 상태에서 테스트하면 연관 후각이 드러났습니다.메모리, 양의 PI로 정량화됩니다. 이에 대한 행동적 표현메모리설탕이 있는 상태에서 종료되었습니다. 따라서 설탕은 두 가지 종류의 신호를 제공할 수 있습니다. 훈련 중에 나중에 보상 검색에서 동물을 안내하기 위해 냄새와 연관될 수 있는 보상 신호를 제공합니다. 그리고 회상 테스트 동안, 추구된 보상으로 설탕은 이 학습된 검색을 종료하라는 신호를 제공합니다. 샘플 크기: N=29, N =28. B, 유충은 설탕의 부재 또는 존재(위쪽 스케치)에서 타고난 냄새 선호도에 대해 테스트되었습니다. 설탕은 타고난 후각 행동에 영향을 미치지 않아 반사와 같은 조직을 나타냅니다. 샘플 크기: 각각 N=20. 상자 그림 위의 다른 문자는 쌍별 유의성을 나타냅니다(Mann–Whitney U 검정, p, 0.{10}}5, Bonferroni-Holm에 따라 수정됨). *0부터의 유의성(1-표본 부호 검정, p, 0.05, Bonferroni-Holm에 따라 수정됨). ns, 중요하지 않습니다. 모든 통계 테스트 및 그 결과는 확장 데이터 그림 1-1의 소스 데이터와 함께 보고됩니다. 이 실험의 PI 점수의 기본이 되는 냄새 선호도 값은 그림 9A를 참조하십시오.
그림 2. DAN-KC-MBON 매트릭스의 회로. 내측 엽의 교차. 냄새 정보는 버섯 몸체 KCs(보라색; 완전히 표시되는 것은 오른쪽에 하나의 예시 KC임)의 꽃받침 부위뿐만 아니라 타고난 접근을 유도하도록 처리됩니다. 맛 보상 정보는 마찬가지로 타고난 행동을 안내하고 대부분의 아민성 조절 뉴런(DAN-i1, 청록색/검정색으로 표시됨)을 통해 버섯 체엽의 개별 구획(왼쪽에 구획이 표시됨)을 안내하도록 처리됩니다. 내측 엽(hk)의 4개 구획 각각은 반대쪽 반구의 동일한 구획에도 분포하는 단일 DAN으로부터 입력을 받습니다. 내측 엽의 MBON은 일반적으로 두 반구의 단일 구획(MBON-i1, 마젠타/노란색으로 표시됨)에서 가져오고 반구 분할을 가로질러 구획 간에 다른 구성으로 출력을 전달합니다. 종합적으로 MBON은 다음을 담당합니다.메모리- 기반 검색 행동. 데이터는 Eichler et al. (2017) 및 Saumweber et al. (2018). B, i-구획의 DAN-KC-MBON 매트릭스. DAN-i1과 대부분의 KC는 상호 화학적 시냅스를 설정하고 DAN-i1과 KC는 모두 MBON-i1에 출력을 제공합니다. 단순화를 위해 왼쪽 DAN-i1 및 MBON-i1 뉴런과의 시냅스만 자세히 표시됩니다. 동일한 연결이 전부는 아니지만 대부분의 다른 구획에서 발견됩니다(Eichler et al., 2017; Saumweber et al., 2018). C, DAN-i1(청록색)은 세포체(1으로 표시된 영역)와 동측의 버섯체(진한 회색) 외부로부터 입력을 받은 다음 양쪽 반구(2 및 3으로 표시된 영역)의 i-구획에 신경을 공급합니다. MBON-i1(자홍색)은 정중선을 두 번 교차합니다. 두 반구의 i-구획에서 입력을 수신하고 두 반구의 버섯 몸체에 인접한 영역에서 출력을 제공합니다. D, C와 동일하지만 약간 기울어진 보기에서 왼쪽 DAN-i1 및 MBON-i1 뉴런의 골격 재구성과 한 가지 예 KC(검정색)를 보여줍니다. 데이터는 Eichler et al. (2017). E, 왼쪽 DAN-i1 뉴런의 덴드로그램. 컬러 점은 DAN-i1의 출력 시냅스를 나타냅니다. 삼각형은 DAN-i1에 대한 입력 시냅스를 나타냅니다. 색상은 해당 시냅스의 파트너 뉴런을 나타냅니다. 버섯 몸체 내의 다른 모든 시냅스는 "기타"로 표시됩니다. DAN-i1이 버섯 몸체 외부, 특히 영역 1에서 뉴런과 형성하는 시냅스는 표시되지 않습니다(Eschbach et al., 2020). 점선은 뉴런이 뇌의 정중선을 가로지르는 영역을 나타냅니다. F, E와 동일하지만 왼쪽 MBON-i1 뉴런에 대한 것입니다. MBON-i1이 버섯 몸체 외부의 뉴런과 형성하는 시냅스는 표시되지 않습니다. 두 반구의 DAN-i1 및 MBON-i1 뉴런의 고해상도 버전과 모든 성숙한 KC에 대해서는 각각 확장 데이터 그림 2-1, 2-2 및 2-3를 참조하세요. .
DAN-i1은 이전에 더 자세히 분석되었기 때문에(Saumweber et al., 2018) DAN-h1보다 더 강력한 보상 효과를 제공하기 때문입니다(Saumweber et al., 2018; 미공개 데이터). 우리는 먼저 DAN-i1과 주요 출력 파트너인 MBON-i1 및 KC 사이의 모든 시냅스의 공간적 배열에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 그런 다음 DAN-i1의 광유전학적 활성화가 훈련 중 보상 신호뿐만 아니라 회상 테스트에서 보상을 검색하는 학습을 급격히 종료하는 신호를 매개할 수 있는지 묻습니다.
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재료 및 방법
실험 모델 및 주제 세부 정보. 산란 후 5일령이 된 암수 3령 섭식기 유충(D. melanogaster)을 전체적으로 사용하였다. 파리는 표준 배지에서 25도, 60% -70 상대 습도 및 12/12시간 명암 주기의 대량 배양에서 유지되었습니다. 식품병에서 식용배지 한 숟가락을 취하여 원하는 수의 유충을 무작위로 선택하고 수돗물에 간단히 헹구고 실험을 시작했습니다.
우리는 DAN에서 ChR2-XXL 광 개폐 이온 채널을 표현하기 위해 유전자 변형 유충을 사용했습니다. 이를 위해 이펙터 균주 UAS-ChR2-XXL(Dawydow et al., 2014)(R. Kittel, University Leipzig에서 친절하게 제공)은 58E{{6 }}Gal4(Pfeiffer et al., 2008; Liu et al., 2012; Rohwedder et al., 2016)(Bloomington Stock Center no. 41347) 또는 split-Gal4 드라이버 균주 SS00864(Eichler et al., umweber; et al., 2018) 이중 이형 접합체 자손을 얻습니다. 드라이버는 w1118(Bloomington Stock Center #3605, #5905, #6326)의 로컬 복사본으로 교차된 드라이버 균주를 제어합니다. 이펙터가 Gal4(attP2) 또는 split-Gal4(attP40/attP2)에 사용된 착륙 지점을 운반하는 균주를 제어하지만 Gal4 도메인이 삽입되지 않은("비어 있음")(Pfeiffer et al., 2010) UAS- ChR2-XXL. pJFRC-10xUAS-IVS-mCD8::GFP(Pfeiffer et al., 2010)(Bloomington Stock Center #32185)와 교차하여 58E02 및 SS00864의 발현 패턴을 확인했습니다. ChR{41}}XXL은 햇빛에 의해 활성화될 만큼 민감하기 때문에(표시되지 않음) 검은색 판지 포장으로 지속적으로 어두워진 바이알에서 파리를 키웠습니다. 그림 8E에 제시된 실험에서 UAS-ChR2(Schroll et al., 2006)는 58E{47}}Gal4로 교차되었습니다.
실험 설정. 행동 실험을 위해 유충은 내부 직경 9cm의 페트리 접시에서 훈련되었고 그림 범례에 언급된 대로 내부 직경 9cm 또는 15cm(둘 다 Sarstedt 제품)의 페트리 접시에서 테스트되었습니다. 모든 경우에 1% 아가로스(전기 영동 등급)로 채워져 있습니다. ; 로스). 냄새와 마찬가지로 파라핀 오일에 1:20으로 희석한 n-아밀 아세테이트(AM; CAS: 628-63-7; Merck)를 사용했으며 경우에 따라 추가로 희석하지 않은 1-옥탄올(OCT, CAS: {{ 9}}; 머크).
실험은 24 12 LED 어레이(470nm; Solarox)와 젖빛 플렉시글라스의 6-mm 두께 확산판을 특징으로 하는 맞춤형 조명 테이블이 장착된 43 43 73cm 주변 상자 내에서 수행되었습니다. ChR{6}}XXL 활성화(120mW/cm2)를 위한 균일한 청색광을 보장하기 위해 상단에. 페트리 접시를 확산판 바로 위에 놓았다. 페트리 접시는 폴리에틸렌 확산 링으로 둘러싸여 있습니다. 확산 링 뒤에 30개의 적외선 LED(850nm, Solarox)가 장착되어 유충에게는 보이지 않는 조명을 제공하지만 오프라인 분석을 위해 행동을 기록하고 추적할 수 있습니다. 이를 위해 적외선 통과 필터가 장착된 카메라(Basler acA204090umNIR; Basler)를 페트리 접시 위에 놓았다. 실험 설정에 대한 자세한 내용은 Saumweber et al. (2018).
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연관 냄새 설탕 학습. 학습 실험은 확립된 프로토콜을 따랐습니다(Michels et al., 2017). 맞춤형 테프론 용기(각각 직경 0.5mm의 구멍이 7개 뚫린 뚜껑이 있는 내경 5mm, 내경 5mm)에 냄새 물질 10ml를 첨가하여 냄새 용기를 준비했습니다. 페트리 접시는 통기를 개선하기 위해 각각 직경이 1mm인 15개의 구멍으로 중앙에 천공된 수정된 뚜껑으로 덮였습니다.
후각-당 훈련을 위해 보상으로 2mol/L D-fructose(CAS: 57-48-7; Roth)를 함유하고 2가지 냄새가 장착된 agarose로 채워진 페트리 접시 중앙에 20마리의 유충을 배치했습니다. 양쪽에 AM(AM1)으로 채워진 컨테이너가 반대쪽에 있습니다. 2.5분 후, 유충은 2개의 빈 용기(EM)가 장착된 평범한 무미 아가로스가 있는 신선한 페트리 접시로 옮겨졌고, 여기서도 2.5분을 보냈습니다. 각각의 경우에 신선한 페트리 접시를 사용하여 3개의 이러한 "짝지어진" 훈련 주기를 수행했습니다. 절반의 경우 교육은 표시된 대로 보상이 포함된 페트리 접시로 시작되었지만(AM1/EM), 나머지 절반의 경우에는 순서가 반대였습니다(EM/AM1). 애벌레 훈련된 AM1/EM(또는 EM/AM1)의 각 코호트에 대해 두 번째 코호트는 냄새와 보상(각각 AM/EM1 또는 EM1/AM)의 "짝이 없는" 프레젠테이션에 의해 상호 훈련되었습니다.
훈련 후, 유충을 테스트 페트리 접시의 중앙으로 옮기고 냄새 선호도를 테스트했습니다. 중요하게, 회상 테스트는 평가하기 위해 일반 페트리 접시에서 수행되었습니다.메모리- 기반 검색 행동 또는 보상이 포함된 페트리 접시에서 보상의 존재가 종료되었는지 여부를 결정합니다.메모리- 기반 검색. 두 경우 모두 테스트 페트리 접시의 한쪽에는 AM 용기가 장착되어 있고 다른 한쪽에는 EM 용기가 장착되어 있습니다. 양쪽의 유충 수는 테스트 시작 후 3분에 카메라 이미지에서 결정되었습니다. 이 숫자로부터 냄새 선호도는 다음과 같이 계산되었습니다.
따라서 PI 값의 범위는 1에서 1까지이며 양수 값은 유충이 짝을 이루지 않은 훈련보다 짝을 이룬 후 냄새를 더 선호함을 나타냅니다. 따라서 양수 PI 값은 식욕을 돋우는 연상을 나타냅니다.메모리로 가장 잘 해석된다메모리- 기반 검색 행동. 대조적으로 음수 PI 값은 혐오적 연상을 나타냅니다.메모리.
광유전학적 DAN 활성화에 의한 연관 학습. 광유전학 실험의 경우 훈련과 테스트가 유사하게 수행되었습니다. 그러나 모든 페트리 접시는 일반 아가로즈로 채워졌습니다(즉, 보람 있는 맛은 사용되지 않음). 대신, 짝지음 훈련을 위해 AM을 2.5분 동안 58E02-DAN 또는 864- DAN을 활성화하기 위해 지속적인 청색광 자극과 짝을 지은 다음 2.5분 동안 냄새가 없는 어둠 속에서 짝을 지었습니다(AM1/EM). 짝을 이루지 않은 훈련의 경우 냄새 표시와 빛 자극이 별도로 발생했습니다(AM/EM1). 그림 8E에 제시된 실험을 위해 냄새와 빛이 각각 5분 동안 제시되었습니다. 그 실험은 그렇지 않으면 Rohwedder et al. (2016).
이러한 훈련 주기를 세 번 한 후 회상 테스트를 수행하고 설명된 대로 냄새 선호도와 PI를 계산했습니다. 결정적으로, 리콜 테스트는 DAN이 훈련 중 보상 신호를 중재하는지 여부를 결정하기 위해 블루 라이트 활성화 없이 수행되거나, 추가로 DAN이 검색을 종료하기 위해 신호를 중재할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 블루 라이트 활성화와 함께 수행되었습니다.
이 프로토콜의 변형은 그림 범례에 표시됩니다.
타고난 후각 행동. 냄새 용기 및 페트리 접시는 위에서 설명한 대로 준비되었습니다. 20마리의 유충 코호트를 바이알로부터 수집하고 수돗물로 간단히 세척하고 한쪽에는 AM 용기가 있고 다른 한쪽에는 빈 용기가 있는 페트리 접시에 놓았다. 3분 후, 타고난 냄새 선호도는 수학식 1에 따라 결정되었습니다. 이 선호도 테스트는 이러한 테스트 조건이 변경되는지 여부를 결정하기 위해 설탕의 부재 또는 존재, 또는 블루 라이트 활성화의 부재 또는 존재하에 수행되었습니다. 타고난 후각 행동.
864-DAN 활성화를 사용한 학습 후 행동 변조 분석. 애벌레 행동은 Paisios et al.에 의해 자세히 설명된 대로 비디오 추적 및 분석되었습니다. (2017). 간단히 말해서, 애벌레 chemotaxis의 두 가지 측면을 분석했습니다. 먼저 두부 거세의 변조(초당 HC)(HC/s)는 다음과 같이 계산되었습니다.
이 측정에서 방향각(HA)은 냄새에 대한 동물의 머리 방향을 나타내며, 절대 방향각(abs(HA))은 0도 또는 180도입니다. 각각 유충의 전면 또는 후면에 있습니다. 따라서 이 측정은 매력에 대해 긍정적인 점수를 산출하지만(즉, HC가 냄새 표적에서 멀어지기 보다는 유충을 향하게 할 때) 혐오에 대해 부정적인 점수를 산출합니다.
면역조직화학. Ca{0}}유리 식염수에서 유충의 뇌를 해부하고 Ca21-유리 식염수와 1:2로 희석한 Bouin 용액에 7분 동안 고정했습니다. PBST(PBS 중 0.3% Triton-X 100)에서 세 번의 세척 단계(각 10분)를 수행한 후 4도에서 밤새 1차 항체와 함께 인큐베이션했습니다. PBS에서 3회 세척(각 10분)한 후, 조직을 실온에서 1시간 동안 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다. PBS에서 3개의 최종 세척 단계(각 10분) 후, 샘플을 Vectashield(Vector Laboratories)에 장착했습니다. DM 6000 CS 공초점 현미경(Leica Microsystems)으로 제제를 검사했습니다.
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항체로 모노클로날 항-FASII 마우스 항체(DSHB, 4% 정상 염소 혈청을 포함하는 차단 용액에 1:5로 희석{21}}) 및 항-GFP 토끼 항체(A11122, Invitrogen, 1:1로 희석{21})를 사용했습니다. {28}}04% 정상 염소 혈청을 포함하는 차단 용액 중 0) 1차 항체 및 Cy3 항-마우스 항체(715-165-150, Jackson ImmunoResearch Laboratories) 및 Alexa{12}} 항-토끼 항체(A11034, Invitrogen), 둘 다 PBS에서 1:200으로 희석된 이차 항체로서; 또는 일차 항체로 0.3% PBST에 1:100으로 희석된 단일클론 항-ChR2 마우스 항체(ProGen Biotechnik), 0.3% PBST에 1:300 희석된 Cy3 항-마우스 항체(715-165-150, Jackson ImmunoResearch Laboratories)를 사용했습니다. , 2차 항체로 Alexa{30}} 항-HRP(Jackson ImmunoResearch Laboratories)를 대조염색을 위해 0.3% PBST에 1:300으로 희석했습니다.