파트 2 UPLC-QTOF/MS 및 DNA 바코드를 기반으로 한 Cistanches Herba의 화학적 및 유전적 판별
Mar 03, 2022
연락처: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 이메일:audrey.hu@wecistanche.com
OPLS-DA 및 마커 식별 두 종의 식별을 위한 잠재적인 화학적 마커를 식별하기 위해 OPLS-DA의 S-플롯이 생성되었습니다(그림 3). S-플롯에서 각 점은 하나의 tR-m/z 이온 쌍을 나타냅니다. X 및 Y 축은 각각 이온의 기여도와 신뢰도를 나타냅니다. 이온 tR–m/z 쌍이 0에서 멀리 떨어져 있을수록 이 아이콘의 기여도/신뢰도는 두 그룹 간의 차이에 더 커집니다. 따라서 'S'의 두 끝을 가리키는 tR-m/z 이온은 각 그룹에서 가장 높은 신뢰도를 갖는 특성 마커를 나타냅니다. OPLS-DA 결과는 UPLC-QTOF/MS가시스탄체 데저티콜라~에서시스탄체 튜불로사(그림 3). 이 그룹의 구별을 용이하게 하기 위해 총 6개의 신뢰할 수 있고 중요한 마커가 결정되었습니다(표 3). 3개의 잠재적 마커의 ID가 잠정적으로 할당되었습니다. 이 세 가지 이온과 상관관계가 있는 성분은 잠정적으로 campneoside II, cistanoside C 및 cistanoside A의 이성질체로 확인되었습니다. 마커 화합물 a, b 및 c는 두 식물 종을 구별하는 데 사용할 수 있습니다.시스탄체 데저티콜라에서보다 높았다시스탄체 튜불로사(그림 4A, 4B) 및 마커 c는시스탄체 튜불로사, 하지만 안에시스탄체 데저티콜라(그림 4C).
DNA 바코드: 염기서열 정보 및 식별 효율
서열 정보는 표 4와 같다. psbA-trnH(0.1732)의 평균 유전 거리는 다른 두 영역(0보다 컸음.074{24}} , 0.1197) 유의하게. psbA-trnH의 평균 GC 함량(20.64%)은 다른 두 지역(55.{12}}%, 55.{14}}%)보다 작았습니다. 본 연구에서는 ITS와 ITS2의 성공률을 얻지 못했지만, psbA-trnH 영역은 PCR 증폭 및 시퀀싱에서 우수한 성능을 보였다(100%, 87.23%). 식별 효율은 BLAST1 분석과 최근접 거리법으로 달성하였으며, 주로 바코드의 성공률을 반영하였다. psbA-trnH 영역은 두 가지 방법을 기반으로 한 식별 효율성에서 다른 두 바코드보다 분명히 높았습니다. 서열의 부족은 ITS 영역이 BLAST1 방법을 기반으로 100% 식별 효율을 나타내고, 근거리 방법을 기반으로 0을 나타내는 이유일 가능성이 높습니다.
6가지 매개변수를 이용한 유전적 다양성 분석
6개의 매개변수를 사용하여 3개의 바코드를 사용하여 종내 변이 및 종간 발산을 분석했습니다(표 5). 특이적 변이와 특이적 변이 사이의 상당한 차이는 DNA 바코드의 유용성을 나타냅니다. 여기서, 3개의 바코드의 최소 종간 거리는 최대 종간 거리보다 모두 높았다. 또한, psbA-trnH 영역은 다른 2개의 바코드보다 최대 종내 거리 및 평균 종간 거리가 더 크게 나타났으며, 이는 psbA-trnH 영역이 Cistanches Herba의 두 기점을 구별하는 데 잘 수행되었음을 나타냅니다.
식별을 위한 바코드 갭 분석
시스탄체 데저티콜라그리고시스탄체 세뇨관바코드 간격은 종간 및 종내의 현저한 변화를 나타내며 종내 및 종간 샘플 사이에 별도의 겹치지 않는 분포를 보여줍니다. 이 연구(그림 5)에서 거리 범위는 0–0.45로 설정되었습니다.시스탄체 데저티콜라그리고시스탄체 세뇨관0.45에 가까웠습니다. 3개의 바코드는 특이적 내 및 특이적 변이 분포에서 뚜렷한 격차를 보였다. 또한, psbA-trnH의 간격은 다른 두 바코드보다 훨씬 더 컸습니다. 따라서 psbA-trnH 영역은시스탄체스허바.
이웃 결합(NJ) 트리
NJ 트리는 종 간의 관계를 설명하고 클러스터링의 결정을 용이하게 합니다. 본 연구에서는 K2P 모델을 기반으로 3개의 바코드로 구성된 NJ 트리를 구축하였다(Fig. 6). 결과는 Cistanches Herba의 두 가지 기원이 개별적으로 두 개의 분기군으로 클러스터링되었음을 보여주었습니다. 따라서 NJ 트리는 다음과 같이 명확하게 구별됩니다.시스탄체 데저티콜라그리고시스탄체 세뇨관.
토론 및 결론
Cistanches Herba는 아시아 공동체에 영양을 공급하는 데 일반적으로 사용되는 중요한 약재입니다[38]. 그러나 두 가지 기원은시스탄체스허바, 시스탄체 데저티콜라그리고시스탄체 세뇨관, 각각 다른 화학적 조성과 약리학적 활성을 갖는다. 동시에 두 가지 기원은 임상 적용과 상품 시장에서 다릅니다. Cistanche Herba의 자원 부족과 특별한 재배 환경으로 인해 Cistanche의 분류가 혼란스럽고 막대한 대체 물질과 불순물이 시장에 넘쳐납니다. Cistanche 속은 4개의 종과 1개의 변종을 포함하는 것으로 인정됩니다.시스탄체 데저티콜라, 시스탄체 세뇨관, 시스탄체 시넨시스, 시스탄체 살사, 그리고시스탄체살사변수 알비플로라 [39]. 일본의 연구원들은 그 기원을 고려했습니다.시스탄체스허바시스탄체 살사[40-43],시스탄체 데저티콜라투 [44–46]. 따라서 Cistanche의 분류에 혼동이 있으며 Cistanches Herba의 두 가지 기원을 구별하기가 어렵습니다. Cistanches Herba의 품질 관리를 위한 전통적인 방법은 형태학적 식별[47,48], 현미경 식별[49] 및 TLC(Thin-Layer Chromatography)[50,51], FTIR(Fourier Transform Infrared Spectroscopy)[14], HPLC(고 성능 액체 크로마토그래피) [52,53]. 형태학적 및 미시적 방법은 형태적, 미시적 특성에 큰 차이를 보이는 다른 속 또는 과와 종을 쉽게 구별할 수 있는 반면, 형제종은 구별하기 어렵다. TLC와 FTIR은 다른 종류의 화학 조성을 가진 종을 명확하게 구분할 수 있지만 화학 성분과 함량을 결정하는 것은 어렵습니다. HPLC는 화학 원소 함량이 다른 종을 구별하는 데 주로 사용되지만 UPLC에 비해 분석 시간이 길고 감도가 상대적으로 낮습니다. 이에 따라 UPLC-QTOF/MS 기술은 다른 화학적 방법보다 화학적 조성을 더 빠르고 정확하게 결정할 수 있었습니다. 분자식별법은 SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-Polycrylamide Gel Electrophoresis)[54], AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)[55,56]와 같이 유전적 변이에 따른 감별이 잘 나타난다. 그러나 이러한 분자 방법은 작동하기 쉽지 않고 보편적이지 않습니다. 이에 따라 DNA 바코드는 다른 분자 방법보다 더 보편적이고 빠르고 정확하게 종을 구별할 수 있습니다. 같은 속과 밀접한 유전적 관계에 있는 종의 경우 이러한 방법만으로는 식별이 잘 수행되지 않을 수 있습니다.
여기에서 UPLC-QTOF/MS와 DNA 바코드를 결합하여시스탄체 데저티콜라그리고시스탄체 세뇨관구별할 수 있는 화학적 및 분자적 마커를 평가했습니다. UPLC-QTOF/MS를 사용하여 23개의 적격한 질량 피크가 검출되었고 16개가 식별되었으며, PCA 및 OPLS-DA 분석에 의해 두 가지 기원의 구별을 용이하게 하는 3개의 잠재적 마커 화합물이 먼저 발견되었습니다. 또한 식별 효율성, 유전 효율성, 바코드 간격 및 NJ 트리 분석이라는 두 가지 기원을 구별하는 능력 측면에서 DNA 바코드 기술을 통해 4가지 지표를 평가했습니다. psbA-trnH 영역은 식별에 적합한 DNA 바코드로 지원되었습니다.시스탄체 데저티콜라그리고시스탄체 세뇨관. 결론적으로 우리는 Cistanches Herba의 두 가지 기원에 대한 식별 및 품질 관리를 위한 새로운 분자 및 화학 분석 결합 방법을 먼저 확립했습니다. DNA 바코드는 유전적 변이의 두 가지 기원을 구별하고 종을 보편적이고 정확하게 인증할 수 있습니다. UPLC-QTOF/MS 기술은 화학 성분을 분석하여 의약품의 품질을 빠르고 정확하게 평가할 수 있습니다. DNA 바코딩과 UPLC-QTOF/MS 기술의 결합은 여러 원료의약품의 동정을 보다 정확하고 과학적으로 보장하며, 분류 시 혼동되는 다른 종이나 속을 식별하는 방법으로 활용될 수 있다.
저자 기여
실험 구상 및 설계: LFH SHZ LBW. 실험 수행: SHZ LBW. 데이터 분석: SHZ LBW. 기여한 시약/재료/분석 도구: LFH. 논문 작성: SHZ XJ LBW. 원고를 확인하십시오: ZHW.
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