파트 2 Echinacoside는 시상하부 안드로겐 수용체를 표적으로 하여 쥐의 정자 양을 증가시킵니다
Mar 10, 2022
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논의
민족약리학적 기록과 우리의 이전 연구13는시스탄체 튜불로사추출물은 성호르몬 수치를 효과적으로 증가시키고 정자의 질을 향상시켰습니다.ECH의 주요 화합물 중 하나로시스탄체 튜불로사19,20, 정자 수를 증가시키고 LH와 T의 분비를 증가시킬 수 있습니다(그림 1). 이 연구에서 우리는ECHECH가 고환에 미치는 간접적인 영향을 시사하는 고환 대신 시상하부에 분포했습니다. 실제로, ECH는 시상하부 AR 활성, 핵으로의 AR 전위 및 HPG-축 관련 유전자 발현을 직접 억제하고 BPA 유발 생식 손상에 대한 보호도 제공했습니다.
인간 성선 자극 호르몬 생산에 대한 연구에서 성 호르몬 수치는 HPG 축과 음성 피드백 루프에 의해 엄격하게 조절됩니다21. 즉, T 분비는 뇌하수체 및 시상 하부에 대한 음성 안드로겐 피드백의 부족에 대한 응답으로 혈액 LH 수준의 일관되고 지속적인 증가에 대한 응답으로 현저하게 증가합니다. 본 연구에서는,ECH뇌하수체와 뇌하수체에서 LH의 분비를 증가시키고 고환에서 테스토스테론의 생산을 증가시켰고 뇌하수체와 뇌하수체에서 LHR과 Gnrhr의 mRNA 수준을 증가시켰으며(그림 1 및 그림 4),ECHHPG 축 부정적인 피드백에 영향을 줄 수 있습니다. 당연히 AR 자체는 T 및 LH 수준의 피드백 조절에서 중요한 역할을 합니다22,23. 남성 HPG 축 패러다임은 시상하부 및 뇌하수체 수준에서 음성 피드백 억제를 제공하는 테스토스테론을 중심으로 합니다24,25. 이전 연구에서는 Foxg1-Cre를 사용하여 두 영역의 상대적 중요성을 결정하기 위해 뇌하수체에서 관심 유전자를 제거했지만 시상하부는 제거하지 않았습니다. 결과는 수컷 마우스의 뇌하수체에서 AR 신호가 LH 분비의 테스토스테론 의존적 조절과 관련하여 필수적임을 입증했습니다. 이러한 이유로 우리는 추가 연구를 위해 시상하부 AR에 초점을 맞추기로 결정했습니다.
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스테로이드 핵 호르몬 수용체로서 AR의 활성은 스테로이드 리간드 T에 의해 조절되며, 결합은 AR27의 핵 전위 및 전사 조절 기능을 개시합니다. 이 연구에서 우리는ECH처리는 시상하부의 핵으로의 세포질에서 AR 전위를 억제했습니다(그림 3). 또한, PK 연구는ECH고환보다는 시상하부에 현저하게 침투할 수 있으며, 이는 더 많은 ECH가 혈액 고환 장벽보다 엔도사이토시스를 통해 혈액-뇌 장벽을 통과함을 시사합니다. 또한 간접 ELISA를 통해 ECH와 AR의 결합 능력을 입증하여 ECH가 AR에 직접 결합할 수 있음을 시사했습니다. 이것은 ECH에 대한 추정 결합 부위가 AR 포켓의 Met{1}} 및 Val{2}}에 존재함을 나타내는 분자 도킹 분석 결과에 의해 추가로 뒷받침되었습니다(그림 5D). 이것은 AR이 부정적인 피드 루프의 조절에 참여하고 뇌에서 AR-T 상호작용의 감소가 LH 분비를 증가시킨다는 다른 연구 결과를 뒷받침합니다23,28,29
스테로이드 생성은 스테로이드 생성 단백질(StAR)30 및 CYP11A1, CYP17A1, 3 -하이드록시스테로이드 탈수소효소(HSD3) 및 17 -하이드록시스테로이드와 같은 스테로이드 생성 효소의 관여로 정자 생성의 발달을 위해 엄격하게 제어되고 필수적인 과정입니다. 콜레스테롤을 테스토스테론으로 전환시키는 탈수소효소(HSD17)31. 우리는 이러한 효소를 인코딩하는 유전자의 mRNA 수준이ECHStAR mRNA의 발현은 변하지 않는 반면 치료. 이것은ECH콜레스테롤이 미토콘드리아 내막으로 전달되는 데에는 영향을 미치지 않았지만 콜레스테롤이 테스토스테론으로 전환되는 것을 촉진하는 역할을 할 수 있습니다. 그러면 다음과 같은 결론을 내릴 수 있습니다.ECH치료는 테스토스테론 합성 및 분비를 증가시켜 정자 수를 상당히 증가시킵니다.
의 보호 효과를 조사하기 위해ECH정자 손상에 대해 전형적인 외인성 내분비 교란 물질인 비스페놀 A(BPA)가 생쥐의 수컷 생식 손상 모델로 사용되었습니다.ECH치료는 정자 수, 정자 운동성, BPA에 의해 감소된 T 및 LH 수준을 효과적으로 회복시켰으며(그림 6A, B), 이는 ECH가 정자 손상을 약화시킬 수 있음을 시사합니다.
호르몬 대체 요법을 위한 인공 합성 화학물질에 비해ECHHPG 축에 대한 부정적인 피드백에 영향을 주어 LH, T 및 정자의 질 분비를 증가시키는 천연 비호르몬 화합물입니다. 이 기계적인 경로는 남성의 생식 기관을 보호하고 따라서ECH잠재적인 천연 생식 보호제로 간주될 수 있습니다. 그러나 호르몬 조절은 복잡하고 종종 전신적 효과로 이어집니다. 그림 7에 표시된 것처럼 ECH는 T 및 LH 분비를 증가시키고 AR 활성화를 억제하여 골다공증33 및 남성의 우울증과 같은 다른 건강 또는 질병 관련 경로에 대한 결과를 초래할 수 있으므로 ECH의 포괄적인 효과는 더욱 확대되어야 합니다. 조사했다.
종합해보면, 우리의 결과는ECH시상하부의 AR에 결합하고 AR이 세포질에서 핵으로 전달되는 것을 억제합니다. 우리의 데이터는 ECH가 아미노산 Met{0}} 및 Val{1}}에서 AR 포켓의 부위에 결합함을 시사합니다. 이것은 LH 분비를 촉진하고 그에 따른 T 생산 및 정자 수의 증가를 통해 호르몬 수준의 균형을 유지하기 위한 전신 반응으로 T 및 AR 수준의 증가를 설명할 수 있습니다(그림 8).
행동 양식
윤리 선언문.
본 연구는 과학기술부(중국 베이징)에서 제정한 실험동물 가이드라인을 엄격히 준수하여 수행되었습니다. 모든 실험 프로토콜은 안양공과대학 윤리위원회에서 검토 및 승인되었습니다.
실험 동물.
4주령 근친교배 쿤밍 마우스(22g-25g)를 제4군사대학 동물센터(중국 시안)에서 얻었다. 동물은 22도 ± 2도의 온도, 70% ± 4% 습도, 12시간 명암 순환, 사료 및 물에 대한 자유로운 접근의 통제된 조건하에 유지되었습니다.
실험 치료.
실험 1. 마우스를 무작위로 6개의 그룹으로 나누었습니다. 각 그룹에는 7개의 마우스가 있었습니다(n=7).ECH(CAS: 82854-37-3; Chengdu Preferred Biotechnology Co., Ltd, Sichuan, China)는 위 내 튜브를 사용하여 투여되었고 테스토스테론 프로피오네이트(TP, CAS: 57-85-2; KingYork, Tianjin, China)가 투여되었습니다. 다음 실험 설계에 따라 14일 동안 1일 1회 근육주사: 대조군: 생리식염수(10mL/kg), ECH(L)군(5mg/kg), ECH(M)군(20mg/kg),ECH(H) 그룹(80mg/kg), TP(15mg/kg) 및 엔잘루타마이드(AR 억제제, 14일 동안 매일 1회, 20mg/kg, CAS: 915087-33-1, Aladdin, Shanghai, China).
2주간의 처리 후, 마우스를 디에틸 에테르로 마취하여 호르몬 수치 분석을 위한 혈액 샘플을 수집했습니다. 그런 다음 마우스를 해부하여 시상하부, 뇌하수체와 뇌하수체, 고환 및 부고환을 분리했습니다. 꼬리 부고환의 샘플은 정자 품질 평가를 위해 5% BSA가 포함된 생리 식염수에 넣고 시상하부, 뇌하수체 및 뇌하수체 및 고환을 액체 질소에서 동결하고 추가 조사를 위해 -80도에서 보관했습니다.
실험 2. 마우스를 무작위로 10개 그룹으로 나누었습니다. 그룹당 5마리의 동물이 있었습니다.ECH(20mg/kg)을 경구 투여하고 각 그룹의 마우스를 0.5h, 1h, 1.5h, 2h, 2.5h, 3h, 4h, 6h, 9h, 및 샘플 수집을 위한 투여 후 12시간. 혈장을 수집하고 심장을 노출시켰습니다. 좌심실로 생리 식염수를 주입 장치로 간과 폐가 희게 될 때까지 관류하였다. 10개의 시상하부 및 고환을 수집하여 ECH의 조직 농도를 결정했습니다.
실험 3. 마우스를 무작위로 각 그룹에 7개씩 4개의 그룹으로 나누었습니다.ECH및 BPA(CAS: 80-05-7; Aladdin, Shanghai, China)는 다음 실험 설계에 따라 6주 동안 하루에 한 번 위 내 튜브를 사용하여 투여되었습니다. 정상 그룹(옥수수 기름, 10mL/kg, bw/d) , 모델군: BPA군(BPA 200mg/kg, bw/d, 옥수수유), 실험군: BPA + ECH군(BPA 200mg/kg, ECH 20mg/kg). 처리 42일 후, 마우스를 디에틸 에테르로 마취시키고 호르몬 수준 분석을 위해 혈액 샘플을 수집하였다. 고환과 부고환을 분리하여 수집하였다. 꼬리 부고환은 정자 품질 평가에 사용되었으며 고환은 액체 질소에서 동결되었고 추가 조사를 위해 -80도에서 보관되었습니다.
정자의 질 결정. 정자 현탁액 준비. Cauda 부고환을 5% BSA가 포함된 생리 식염수 5mL에 넣고 내용물이 배지에 퍼질 수 있도록 37도에서 5분 동안 배양했습니다. 정자 수: Yokoi(2003)가 기술한 방법에 따라 희석된 정자 현탁액(1:10; v/v; 정자 현탁액/10% 메탄올)을 혈구계의 각 카운팅 챔버로 옮기고 5분 동안 방치했습니다. 그런 다음 X200 배율의 광학 현미경(Nikon, Instruments Inc., Japan)으로 계수했습니다. 정자 생존율: 총 20μL의 정자 현탁액을 동일한 부피의 에오신-니그로신 염색과 2분 동안 혼합했습니다. 염색되지 않은 정자를 200x 배율의 광학 현미경으로 계수했습니다. 정자 운동성: 총 10μL의 정자 현탁액을 유리 슬라이드에 놓고 200x 배율의 광학 현미경으로 이동성 또는 고정성을 기록했습니다.
호르몬 수치의 결정. 테스토스테론(T) 및 LH의 수준은 방사성면역검정(RIA) 키트(Beijing Sino-UK Institute of Biological Technology, Beijing, China)를 사용하여 혈청, 뇌하수체 및 뇌하수체 및 고환 균질액에서 정량화되었습니다. 간단히 말해서, 항테스토스테론 또는 항-LH IgG 항체(100μL) 및 125-I-접합된 항-마우스 항체를 샘플 또는 표준(100μL)에 첨가하고, 4도에서 밤새 로커 상에서 혼합하였다. PBS-Tween 20(500μL)으로 3회 세척한 후, 혼합물을 4도에서 15분 동안 원심분리(3500rpm/분)하였다. 침전물의 CPM 값은 radioimmunoassay instrument (Beijing Sino-western Technology Co. Ltd, CN202M/KZ4GC{18}}, Beijing, China)로 평가하였고, T와 LH의 농도는 표준의 공식에 따라 계산하였다. 곡선. Te T 및 LH 변동 계수는 샘플 그룹에서 각각 2.8% 및 3.2%, 표준 그룹에서 2.1% 및 2.8%입니다.
실시간 정량 PCR에 의한 유전자 발현의 결정. 총 RNA는 RNA Simple Total RNA 키트(Tiangen, Beijing, China)를 사용하여 동결된 고환 및 뇌와 뇌하수체 조직에서 분리되었습니다. 2xSYBR Green I PCR Master Mix(Vazyme, Nanjing, China)를 사용하여 cDNA의 적용을 위해 정량적 실시간 PCR(q RT-PCR)을 수행했습니다. PCR 절차는 95도 30초 후 95도 15초, 58도 30초, 72도 30초의 35주기로 구성되었다. 프라이머 특이성 및 생성물 순도를 확인하기 위해 PCR 생성물에 대해 용융 곡선 분석을 수행하였다. 단일 제품의 생산을 확인하기 위해 각 플레이트에 대해 해리 곡선을 수행했습니다. 각 mRNA의 상대적 풍부도를 계산했습니다. 연구에 사용된 PCR 프라이머는 표 2에 나와 있습니다.
웨스턴 블롯. AR 발현 분석을 위해 세포질 및 핵 단백질의 추출 및 분리는 제조사의 지침에 따라 세포질 및 핵 단백질 추출 키트(Beyotime, Nanjing, China)를 사용하여 수행되었습니다. Bradford Protein Assay Kit(Beyotime, Jiangsu, China)를 사용하여 세포질 및 핵 단백질의 농도를 평가했습니다. 단백질 샘플(80ug)을 12% 및 5% SDS-PAGE 겔에서 실행하고 PVDF 막으로 옮겼습니다. 차단 후, 막을 항-AR IgG 항체(1:1,{7}}; Bioss; Beijing China) 및 마우스 다클론 항-GAPDH 항체(1:1,{11}}; Wuhan Boster)와 함께 배양했습니다. 생물학적
Technology, 무한, 중국) 또는 마우스 다클론 항-라민 b1 항체를 2시간 동안 처리합니다. 막을 TBST로 3회 세척하고 HRP-접합 토끼 항-마우스 IgG 항체(1:5,000; Bioss, Beijing China)와 함께 인큐베이션했습니다. 신호는 ChemiDoc Imaging System(Tanon{8}},500, Shanghai, China)을 사용하여 시각화되었습니다.
고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석.
혈액은 헤파린 처리된 유리 튜브에 수집되었습니다. 혈장을 6,{1}} rpm에서 1{10}}분 동안 즉시 원심분리하여 분리하고 추가 실험을 위해 -20도에서 보관했습니다. 각 시점의 시상하부 및 고환 샘플을 모아 메탄올로 균질화했습니다. 10,{5}}rpm에서 4도에서 10분 동안 원심분리한 후 상층액을 N2로 농축하고 잔류물을 메탄올 50μL에 녹이고 0.45μm 필터를 통해 여과했습니다. 10 μL의 샘플 여과액을 분석을 위해 HPLC 시스템에 주입했습니다. 표준 곡선은 50, 100, 250, 500 및 750ng/mL의 ECH를 포함하는 샘플로 구성되었습니다(Chengdu Pufei De Biotech Co., Ltd, Sichuan, China). 75ng/mL(낮음), 150ng/mL(중간) 및 300ng/mL(높음)의 ECH로 스파이크된 혈장 품질 관리 샘플을 그에 따라 준비하여 방법의 정확도와 정밀도를 측정했습니다.
크로마토그래피는 UV 검출기(L-2400, Hitachi, Japan)에 결합된 HPLC 시스템(D2{{1{12}}}}00 Elite 시리즈, Hitachi, Japan)으로 수행되었습니다. 25도를 유지한 Termo-C18(250mm x 4.6mm id, 4.6μm 입자) 컬럼에서 분리를 수행했습니다. 이동상은 0.04% 트리메틸아민(성분 A)과 메탄올(성분 B)을 포함하는 0.1% 인산에서 준비된 구배였습니다. 선형 기울기는 다음과 같습니다. 0-2분 동안 70–90% A, 2–6분 동안 60–70% A, 6–8분 동안 55–60% B, 그런 다음 90% A로 돌아갔습니다. 즉시 8분. 유속은 0.8mL/분이었다. UV 검출기는 332 nm에서 작동되었다. 피크 면적은 분석적 측정으로 평가되었습니다.
생쥐의 약동학 연구. 시상하부 및 고환으로의 ECH 침투는 약물 및 통계 소프트웨어(Drug and Statistics, Mathematical Pharmacology Professional Committee of China)로 약동학 분석을 거쳤습니다. 약동학적 매개변수는 통계적 모멘트 이론에 기반한 비구획 방법을 사용하여 결정되었습니다. 피크까지의 시간 상수(Tmax), 피크 농도(Cmax), 제거율 상수(Ke), 제거 반감기(T0.5), 곡선 아래 면적(AUC{ {4}}–12), 겉보기 분포 부피(Vc) 및 클리어런스(CL)를 추가 분석을 위해 얻었습니다. 뇌/혈장 비율은 혈장 및 뇌의 AUC{6}}값을 기반으로 계산되었습니다.
ECH-Ovalbumin(ECH-OVA) 합성 및 식별. 총 9.8 mg의 ECH 및 1.{5}} mg의 부탄디올 무수물을 2mL 피리딘에 용해시키고 실온에서 교반하면서 12시간 동안 혼합하였다. 혼합물을 N2로 농축하고 잔류물을 10.8 mg의 N-히드록시숙신이미드(NHS) 및 19.3 mg의 디시클로헥실카르보디이미드(DCC)와 합하고 실온에서 교반하면서 12시간 동안 4mLN, N-디메틸포름아미드(DMF)에 용해시켰다. 2,{18}}g에서 4도에서 5분 동안 원심분리한 후, 상등액을 14.4mg 오브알부민(OVA)이 용해된 PBS 5mL에 첨가했습니다. 새로운 혼합물을 4도에서 24시간 동안 교반하였다. 그런 다음 반응 용액을 PBS에 대해 3일 동안 투석하였다. ECH-OVA의 존재는 190-400nm 범위의 파장에서 UV 스펙트럼(Shimadzu Scientifc Instruments, Inc. Columbia, MD USA)과 변성 PAGE에 의해 확인되었습니다.
간접 ELISA(iELISA). 마이크로타이터 플레이트를 ECH-OVA(2 ug/100 μL)로 코팅하고 4도에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 3회, PBS로 2회 세척하고, 5% PBSM(5% 탈지유를 함유하는 PBS)을 첨가하여 37도에서 2시간 동안 결합되지 않은 부위를 차단하였다. 플레이트를 PBST 및 PBS로 세척한 후, 웰을 4개의 그룹으로 나누었고; 실험군, 1ug AR 총단백질/100μL; 양성 그룹, 토끼 항-OVA 항체(1:1,{14}}); 음성 그룹, 소 혈청 알부민 1ug; 및 PBS를 포함하는 공백 그룹. 1.5시간 동안 배양한 후 플레이트를 세척하고 100μL/웰의 토끼 HRP-접합 IgG(1:1,{22}})를 양성 그룹에 첨가하고 100μL/웰의 항-AR을 첨가했습니다( 1:1,000)를 다른 그룹으로 보냅니다. 1.5시간 동안 인큐베이션한 후, 토끼 HRP-접합된 IgG(1:5,{33}}) 희석액을 플레이트에 첨가했습니다. 37도에서 1시간 동안 배양한 후, 플레이트를 PBST로 3회, PBS로 2회 세척하였다. 그런 다음 TMB를 첨가하고 실온의 암실에서 10분 동안 인큐베이션하고 2M H2SO4를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 흡광도는 450nm의 파장에서 판독되었습니다.
분자 도킹. Autodock vina 1.1.2(http://vina.scripps.edu)를 사용하여 인간 안드로겐 수용체(AR)에 대한 화합물 ECH의 결합 모드를 조사하기 위해 분자 도킹 연구가 수행되었습니다. AR의 3차원(3D) 구조(PDB ID: 2YHD)는 Protein Data Bank(http://www.rcsb.org/pdb/home/hone.do)에서 다운로드했습니다. ECH의 3D 구조는 ChemBioDraw Ultra 14.{8}} 및 ChemBio 3D Ultra 14.{11}} 소프트웨어로 얻었습니다. AutoDockTools 1.5.6 패키지(http://mgltools.scripps.edu)는 도킹 입력 파일을 생성하는 데 사용되었습니다. AR의 검색 그리드는 크기 x: 15, 크기 y: 15, 크기 z: 15와 함께 center x: 36.141, center y: 8.513, center z: 21.304로 식별되었습니다. Exhaustiveness 값은 20으로 설정되었습니다. Vina 도킹의 경우 언급되지 않은 경우 기본 매개변수가 사용되었습니다. Vina 도킹 점수로 판단되는 최고 점수 포즈를 선택하고 PyMOL 1.7.6 소프트웨어(http://www.pymol.org)를 사용하여 시각적으로 분석했습니다. 데이터 분석 및 통계 방법.
데이터 분석 및 통계 방법. 데이터는 통계 소프트웨어 SPSS 19.{1}}(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 분석되었습니다. 그룹 간의 비교를 위해 일원 ANOVA를 사용했습니다. 그룹 간의 유의미한 차이에 대한 Tukey의 비교 테스트가 결정되었습니다. 결과는 Graph Pad Prism 소프트웨어 v.7(GraphPad Sofware, Inc, California, USA)을 사용하여 평균±표준편차(SD)로 표시했습니다.
윤리 승인 및 참여 동의. 본 연구는 안양공업대학교 윤리위원회로부터 윤리적 승인을 받았습니다.
