2부|요로 박리 세포의 글리코겐 합성 효소 키나제 3b 과잉 활동은 당뇨병성 신장 질환의 진행을 예측합니다
Mar 05, 2022
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논의
미국 및 기타 서방 국가에서 DKD는 진행성 질환의 주요 병인으로 남아 있습니다.만성 신장 질환아직 사용할 수 있는 확실한 치료법이 없는 상태에서 재무 및 의료 시스템에 큰 부담을 줍니다.5 모든 당뇨병 환자가 DN으로 발전하지는 않는다는 것이 오랫동안 인식되어 왔습니다.5 연구된 코호트에 따라 DN이 당뇨병 환자의 30~50%가 앓고 있습니다. 현재 임상에서 DKD 발병 위험이 있는 당뇨병 환자를 식별하기 위해 채택한 조치는 망막병증에 대한 눈 검사와 알부민뇨에 대한 소변 검사에 주로 국한되어 있습니다. DKD.12,13,26,27 따라서 DN의 위험이 있는 당뇨병 환자의 정확한 계층화를 위한 새로운 바이오마커 개발이 시급합니다. 본 연구는 처음으로 GSK3b가 실질에서 과발현되고 과활성화되었음을 보고합니다.신장실험 및 임상 DN 모두의 세포,신장 질환 진행. 더욱이, 요로 박리된 세포에서 GSK3b 과다활동은 DN의 진행을 예측할 수 있을 가능성이 있습니다.
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![Deterioration of human diabetic nephropathy (DN) is associated with glycogen synthase kinase 3b (GSK3b) overexpression and hyperactivity in renal glomeruli and tubules. (a) Representative microscopic images of periodic acid–Schiff staining or peroxidase immunohistochemistry staining for GSK3b or the activated form of GSK3b (phosphorylated GSK3b at Y216 [p-GSK3b]) in normal control kidney specimens and in kidney biopsy tissues from diabetic patients, stratified according to histological classes of DN. Specific staining in glomerular podocytes and mesangial cells is indicated by black arrows and black arrowheads, respectively; specific staining in renal tubules is indicated by white arrowheads. Bar ¼ 50 mm. (b) Computerized morphometric analysis was performed on kidney sections stained for GSK3b and integrated pixel density is presented. *P < 0.05 versus glomerular staining in other DN classes; &P < 0.05 versus glomerular staining in other DN classes except class IV; $P < 0.05 versus glomerular staining in other DN classes except class III; #P < 0.05 versus tubulointerstitial staining in other DN classes. n ¼ 6–10. (c) Computerized morphometric analysis was performed on kidney sections stained for p-GSK3b and integrated pixel density presented. *P < 0.05 versus glomerular staining in other DN classes; &P < 0.05 versus glomerular staining in other DN classes except class IV; $P < 0.05 versus glomerular staining in other DN classes except class III; #P < 0.05 versus tubulointerstitial staining in other DN classes.](/Content/uploads/2021842169/202112101057096935b7a7e83b420997b0a2b2ccb12176.png "Deterioration of human diabetic nephropathy (DN) is associated with glycogen synthase kinase 3b (GSK3b) overexpression and hyperactivity in renal glomeruli and tubules. (a) Representative microscopic images of periodic acid–Schiff staining or peroxidase immunohistochemistry staining for GSK3b or the activated form of GSK3b (phosphorylated GSK3b at Y216 [p-GSK3b]) in normal control kidney specimens and in kidney biopsy tissues from diabetic patients, stratified according to histological classes of DN. Specific staining in glomerular podocytes and mesangial cells is indicated by black arrows and black arrowheads, respectively; specific staining in renal tubules is indicated by white arrowheads. Bar ¼ 50 mm. (b) Computerized morphometric analysis was performed on kidney sections stained for GSK3b and integrated pixel density is presented. *P < 0.05 versus glomerular staining in other DN classes; &P < 0.05 versus glomerular staining in other DN classes except class IV; $P < 0.05 versus glomerular staining in other DN classes except class III; #P < 0.05 versus tubulointerstitial staining in other DN classes. n ¼ 6–10. (c) Computerized morphometric analysis was performed on kidney sections stained for p-GSK3b and integrated pixel density presented. *P < 0.05 versus glomerular staining in other DN classes; &P < 0.05 versus glomerular staining in other DN classes except class IV; $P < 0.05 versus glomerular staining in other DN classes except class III; #P < 0.05 versus tubulointerstitial staining in other DN classes.")
![Deterioration of human diabetic nephropathy (DN) is associated with glycogen synthase kinase 3b (GSK3b) overexpression and hyperactivity in renal glomeruli and tubules. (a) Representative microscopic images of periodic acid–Schiff staining or peroxidase immunohistochemistry staining for GSK3b or the activated form of GSK3b (phosphorylated GSK3b at Y216 [p-GSK3b]) in normal control kidney specimens and in kidney biopsy tissues from diabetic patients, stratified according to histological classes of DN. Specific staining in glomerular podocytes and mesangial cells is indicated by black arrows and black arrowheads, respectively; specific staining in renal tubules is indicated by white arrowheads. Bar ¼ 50 mm. (b) Computerized morphometric analysis was performed on kidney sections stained for GSK3b and integrated pixel density is presented. *P < 0.05 versus glomerular staining in other DN classes; &P < 0.05 versus glomerular staining in other DN classes except class IV; $P < 0.05 versus glomerular staining in other DN classes except class III; #P < 0.05 versus tubulointerstitial staining in other DN classes. n ¼ 6–10. (c) Computerized morphometric analysis was performed on kidney sections stained for p-GSK3b and integrated pixel density presented. *P < 0.05 versus glomerular staining in other DN classes; &P < 0.05 versus glomerular staining in other DN classes except class IV; $P < 0.05 versus glomerular staining in other DN classes except class III; #P < 0.05 versus tubulointerstitial staining in other DN classes.](/Content/uploads/2021842169/2021121010573409d6aadc2e1d4dc78124d55406c4e0d6.png "Deterioration of human diabetic nephropathy (DN) is associated with glycogen synthase kinase 3b (GSK3b) overexpression and hyperactivity in renal glomeruli and tubules. (a) Representative microscopic images of periodic acid–Schiff staining or peroxidase immunohistochemistry staining for GSK3b or the activated form of GSK3b (phosphorylated GSK3b at Y216 [p-GSK3b]) in normal control kidney specimens and in kidney biopsy tissues from diabetic patients, stratified according to histological classes of DN. Specific staining in glomerular podocytes and mesangial cells is indicated by black arrows and black arrowheads, respectively; specific staining in renal tubules is indicated by white arrowheads. Bar ¼ 50 mm. (b) Computerized morphometric analysis was performed on kidney sections stained for GSK3b and integrated pixel density is presented. *P < 0.05 versus glomerular staining in other DN classes; &P < 0.05 versus glomerular staining in other DN classes except class IV; $P < 0.05 versus glomerular staining in other DN classes except class III; #P < 0.05 versus tubulointerstitial staining in other DN classes. n ¼ 6–10. (c) Computerized morphometric analysis was performed on kidney sections stained for p-GSK3b and integrated pixel density presented. *P < 0.05 versus glomerular staining in other DN classes; &P < 0.05 versus glomerular staining in other DN classes except class IV; $P < 0.05 versus glomerular staining in other DN classes except class III; #P < 0.05 versus tubulointerstitial staining in other DN classes.")
고도로 보존되고 산화환원에 민감한 세린/트레오닌-단백질 키나아제인 GSK3b는 인슐린 신호전달과 관련된 병태생리학적 과정에 중요한 여러 다른 세포 신호 경로에 중심적으로 관여합니다.신장부상, 수리 및 재생. 간 및 골격근과 같은 인슐린에 민감한 조직에서 GSK3b는 기저 조건에서 활성이며 글리코겐 합성효소의 활성을 억제합니다. GSK3b 조절장애가 2형 당뇨병과 관련이 있다는 증거가 점점 늘어나고 있습니다.19,29-31 실제로 당뇨병 환자31-33의 근육과 비만 당뇨병 마우스의 지방 조직에서 GSK3b 과발현 및 과잉 활동을 나타내는 데이터가 있습니다.34 게다가 , 쥐의 골격근에서 GSK3b의 유전자 변형 과발현은 내당능 장애, 인슐린 저항성 및 고인슐린혈증을 유발합니다.29,35 반대로 골격근에 GSK3b가 결핍된 쥐는 향상된 내당능을 나타냈습니다.36 일관되게, 리튬과 같은 GSK3 억제제는 세포주와 조직에서 인슐린 작용을 모방합니다.37 게다가, 비만 당뇨병 마우스에서 GSK3 억제제는 인슐린 감수성과 포도당 항상성을 개선했습니다.38신장전통적으로 인슐린 작용의 표적 기관으로 간주되지 않았습니다. 그러나 최근 강력한 증거는 인슐린 신호가신장특히 족세포에서 세포는 사구체와신장항상성.39-41 인슐린 결핍이나 저항성 때문에 족세포에서 결함이 있는 인슐린 신호는 DN에서 관찰되는 많은 병리학적 병변의 중추적 개시자일 가능성이 높습니다. 또한 임상 연구에 따르면 당뇨병이 없는 정상 혈압 환자에서도 인슐린 저항성이 알부민뇨의 발병 및 중증도와 상관관계가 있으며, 이는 인슐린 저항성 자체가 알부민뇨를 유발할 수 있음을 시사합니다.42 유사하게, 족세포 특이적 인슐린 저항성이 있는 마우스는 사구체 족세포에서 인슐린 수용체의 조건부 녹아웃은 고혈당증이나 당뇨병이 없음에도 불구하고 DN을 반복하는 알부민뇨 및 사구체 병변을 발생시켰다.41 반대로, 당뇨병 동물에서 인슐린 감작제는 혈당 조절과 무관하게 DN의 진행을 늦출 수 있다.43 이러한 발견은 인슐린 신호가 혈당 수준과 무관하게 족세포 기능을 조절함을 시사합니다. 그러나 인슐린 신호 전달 경로의 핵심 변환기로서 DN의 발병 및 진행에서 GSK3b의 역할은 많이 연구되지 않았습니다.
에서신장, GSK3b는 족세포에서 우세하게 발현되고, 사구체20,21의 간질 및 내피 세포에서는 덜하지만, 신세뇨관 세포에서 광범위하게 발현됩니다. GSK3b가 여러 족세포 변이성 신호 전달 경로를 통합하여 족세포 자율 손상을 매개한다는 것을 나타내는 당사 및 기타 그룹의 데이터가 있습니다.17,20,44,45 GSK3b의 불일치, 유전적 또는 약리학적 차단은 족세포 손상을 방지하고 다양한 비당뇨병성 사구체병증.21 또한 진행성만성병 환자신장질병, GSK3b는 신세뇨관 및 간질 손상의 조절인자로 밝혀졌습니다. 그러나 GSK3b가 DN에 관여하는지 여부와 방법은 불확실하고 격렬한 논쟁이 있었습니다.신장그리고 요로에서 박리된 세포는 DKD의 발달 또는 진행과 관련될 수 있습니다. 예를 들어, 스트렙토조토신 유발 당뇨병이 있는 쥐에서 Lin et al.46은 아데노신 삼인산-경쟁 억제제(20 Z,30 E){5}} Bromo indirubin{6}}oxime( BIO) 고혈당증의 교정 없이 단백뇨를 약화시키고 DN의 사구체 병변을 개선하여 GSK3b가 DN에서 해로운 역할을 함을 시사합니다. 또한, 스트렙토조토신에 의해 유도된 당뇨병이 있는 쥐에서 Paeng et al.22은 BIO를 사용하여 유사한 결과를 얻었고 당뇨병 상태에서 족세포 내에서 강화된 GSK3b 활성이 족세포 사멸 및 DN 손실과 관련이 있다고 결론지었습니다. 이는 GSK3b가 높은 포도당 배지에 노출된 후 족세포 역분화 및 손상을 매개하는 것으로 밝혀진 또 다른 시험관 내 연구와 일치합니다.47 이와 반대로 Mariappan et al.48은 GSK3b의 활성화가 당뇨병 유발성 대신에 개선된다고 주장했습니다.신장부상. 그들의 연구에서, 스트렙토조토신으로 유도된 당뇨병 마우스는 GSK3b를 활성화할 수 있는 산화질소 공여자인 니트로프루시드 나트륨으로 치료되었습니다. 그들은 알부민뇨, 신장 비대 및 사구체의 세포외 기질 축적이 고혈압이나 고혈당증의 개선 없이 모두 개선되었음을 발견했습니다. 그러나 이러한 발견은 자발적인 알부민뇨 및 족세포 손상을 발생시킨 구성적으로 활성인 GSK3를 갖는 유전자 표적 노크인 마우스의 데이터와 크게 모순됩니다.49 상충되는 발견을 조정하기 위해 화학적 억제제 또는 활성제를 사용하여 생성된 데이터를 해석하는 데 주의를 기울여야 합니다. GSK3b. BIO가 GSK3b의 고도로 선택적인 소분자 억제제로 반복적으로 확인되었지만, 니트로프루시드 나트륨은 GSK3b의 특이적 활성제는 아니지만 강력한 혈역학적 효과가 있는 것으로 알려져 있습니다. 당뇨병 쥐. 종합하면 일부 상충되는 데이터에도 불구하고 지배적인 증거는 GSK3b가신장부상및 DN의 단백뇨. 본 연구의 몇 가지 한계점을 언급할 필요가 있다. 첫째, 전임상 데이터는 DB/DB 쥐 모델에만 국한되었습니다. GSK3b 역할의 일반화 가능성을 결정하기 위해당뇨병성 신장 손상, 유형 1 DN 모델을 포함하여 다른 DN 모델의 결과를 검증할 필요가 있습니다. 둘째, 여기에서 임상 관찰은 제한된 샘플 크기와 비교적 짧은 추적 기간을 가진 당뇨병 환자의 후향적 코호트에서 파생되었습니다. 분명히, 우리의 관찰을 확인하고 DKD의 결과를 예측하는 데 있어 요 박리 세포에서 GSK3b의 힘을 확인하기 위해서는 대규모, 전향적, 무작위, 다기관 연구가 필요합니다.
![Receiver operating characteristic curve analysis of the power of baseline urinary albumin excretion (UAE) or relative glycogen synthase kinase 3b (GSK3b) activity (phosphorylated glycogen synthase kinase 3b at Y216 [p-GSK3b]/GSK3b) in urinary exfoliated cells for predicting the progression of renal impairment in diabetic patients.](/Content/uploads/2021842169/20211210111332cbda6209b31c4cb483b3aea3a6fafbed.png "Receiver operating characteristic curve analysis of the power of baseline urinary albumin excretion (UAE) or relative glycogen synthase kinase 3b (GSK3b) activity (phosphorylated glycogen synthase kinase 3b at Y216 [p-GSK3b]/GSK3b) in urinary exfoliated cells for predicting the progression of renal impairment in diabetic patients.")
고도로 보존되고 산화환원에 민감한 세린/트레오닌-단백질 키나아제인 GSK3b는 인슐린 신호전달과 관련된 병태생리학적 과정에 중요한 여러 다른 세포 신호 경로에 중심적으로 관여합니다.신장부상, 수리 및 재생. 간 및 골격근과 같은 인슐린에 민감한 조직에서 GSK3b는 기저 조건에서 활성이며 글리코겐 합성효소의 활성을 억제합니다. GSK3b 조절장애가 2형 당뇨병과 관련이 있다는 증거가 점점 늘어나고 있습니다.19,29-31 실제로 당뇨병 환자31-33의 근육과 비만 당뇨병 마우스의 지방 조직에서 GSK3b 과발현 및 과잉 활동을 나타내는 데이터가 있습니다.34 게다가 , 쥐의 골격근에서 GSK3b의 유전자 변형 과발현은 내당능 장애, 인슐린 저항성 및 고인슐린혈증을 유발합니다.29,35 반대로 골격근에 GSK3b가 결핍된 쥐는 향상된 내당능을 나타냈습니다.36 일관되게, 리튬과 같은 GSK3 억제제는 인슐린을 모방하다
세포주 및 조직에서의 작용.37 게다가, 비만 당뇨병 마우스에서 GSK3 억제제는 인슐린 감수성과 포도당 항상성을 개선했습니다.38 신장은 전통적으로 인슐린 작용의 표적 기관으로 간주되지 않았습니다. 그러나 최근 강력한 증거에 따르면 신장 세포, 특히 족세포에서 인슐린 신호가 사구체 및 신장 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 한다는 것이 제시되었습니다. DN에서 관찰된 많은 병리학적 병변에 대해. 또한 임상 연구에 따르면 당뇨병이 없는 정상 혈압 환자에서도 인슐린 저항성이 알부민뇨의 발병 및 중증도와 상관관계가 있으며, 이는 인슐린 저항성 자체가 알부민뇨를 유발할 수 있음을 시사합니다.42 유사하게, 족세포 특이적 인슐린 저항성이 있는 마우스는 사구체 족세포에서 인슐린 수용체의 조건부 녹아웃은 고혈당증이나 당뇨병이 없음에도 불구하고 DN을 반복하는 알부민뇨 및 사구체 병변을 발생시켰다.41 반대로, 당뇨병 동물에서 인슐린 감작제는 혈당 조절과 무관하게 DN의 진행을 늦출 수 있다.43 이러한 발견은 인슐린 신호가 혈당 수준과 무관하게 족세포 기능을 조절함을 시사합니다. 그러나 인슐린 신호 전달 경로의 핵심 변환기로서 DN의 발병 및 진행에서 GSK3b의 역할은 많이 연구되지 않았습니다.
신장에서 GSK3b는 족세포에서 우세하게 발현되고, 덜하지만 사구체20,21의 메산지움 및 내피 세포에서 발현되고 신세뇨관 세포에서 광범위하게 발현됩니다. GSK3b가 여러 족세포 병적 신호 전달 경로를 통합하여 족세포 자율 손상을 매개한다는 것을 나타내는 당사 및 기타 그룹의 데이터가 있습니다.17,20,44,45 GSK3b의 불일치, 유전적 또는 약리학적 차단은 족세포 손상을 방지하고 다양한 비당뇨병성 사구체병증.21 더욱이, 진행성 만성에서신장질병, GSK3b는 신세뇨관 및 간질 손상의 조절인자로 밝혀졌습니다. 그러나 GSK3b가 DN에 관여하는지 여부와 방법은 불확실하고 매우 논쟁의 여지가 있습니다. 비록 현재의 연구에서 신장과 요로 박리 세포에서 GSK3b 활성화가 향상되면 DKD의 발달 또는 진행과 관련될 수 있음이 밝혀졌음에도 불구하고 말입니다. 예를 들어, 스트렙토조토신 유발 당뇨병이 있는 쥐에서 Lin et al.46은 indirubin{9}}oxime에서 adenosine triphosphate-competitive inhibitor (20 Z,30 E){8}} Bromo에 의한 GSK3b 억제를 발견했습니다. BIO) 고혈당증의 교정 없이 단백뇨를 약화시키고 DN의 사구체 병변을 개선하여 GSK3b가 DN에서 해로운 역할을 함을 시사합니다. 또한, 스트렙토조토신에 의해 유도된 당뇨병이 있는 쥐에서 Paeng et al.22은 BIO를 사용하여 유사한 결과를 얻었고 당뇨병 상태에서 족세포 내에서 강화된 GSK3b 활성이 족세포 사멸 및 DN 손실과 관련이 있다고 결론지었습니다. 이는 GSK3b가 높은 포도당 배지에 노출된 후 족세포 역분화 및 손상을 매개하는 것으로 밝혀진 또 다른 시험관 내 연구와 일치합니다.47 이와 반대로 Mariappan et al.48은 GSK3b의 활성화가 당뇨병 유발성 대신에 개선된다고 주장했습니다.신장부상. 그들의 연구에서, 스트렙토조토신으로 유도된 당뇨병 마우스는 GSK3b를 활성화할 수 있는 산화질소 공여자인 니트로프루시드 나트륨으로 치료되었습니다. 그들은 알부민뇨, 신장 비대 및 사구체의 세포외 기질 축적이 고혈압이나 고혈당증의 개선 없이 모두 개선되었음을 발견했습니다. 그러나 이러한 발견은 자발적인 알부민뇨 및 족세포 손상을 발생시킨 구성적으로 활성인 GSK3를 갖는 유전자 표적 노크인 마우스의 데이터와 크게 모순됩니다.49 상충되는 발견을 조정하기 위해 화학적 억제제 또는 활성제를 사용하여 생성된 데이터를 해석하는 데 주의를 기울여야 합니다. GSK3b. BIO가 GSK3b의 고도로 선택적인 소분자 억제제로 반복적으로 확인되었지만, 니트로프루시드 나트륨은 GSK3b의 특이적 활성제는 아니지만 강력한 혈역학적 효과가 있는 것으로 알려져 있습니다. 당뇨병 쥐. 종합하면 일부 상충되는 데이터에도 불구하고 지배적인 증거는 GSK3b가신장부상및 DN의 단백뇨. 의 몇 가지 제한 사항
현재 연구를 언급할 필요가 있다. 첫째, 전임상 데이터는 dB/dB 쥐 모델로만 제한되었습니다. GSK3b 역할의 일반화 가능성을 결정하기 위해당뇨병성 신장 손상, 유형 1 DN 모델을 포함하여 다른 DN 모델의 결과를 검증할 필요가 있습니다. 둘째, 여기에서 임상 관찰은 제한된 샘플 크기와 비교적 짧은 추적 기간을 가진 당뇨병 환자의 후향적 코호트에서 파생되었습니다. 분명히, 우리의 관찰을 확인하고 DKD의 결과를 예측하는 데 있어 요 박리 세포에서 GSK3b의 힘을 확인하기 위해서는 대규모, 전향적, 무작위, 다기관 연구가 필요합니다.
요약하면, 우리 연구는 GSK3b의 신장 발현 및 활성이 실험 및 임상 DN에서 증폭된다는 것을 입증했습니다. 요로 박리 세포에서의 GSK3b 활성은 DN의 진행을 예측하기 위한 새로운 바이오마커 역할을 할 수 있습니다. 우리의 데이터는 요로 박리 세포의 GSK3b가 DN의 예후 바이오마커 역할을 할 수 있는 값에 대한 대규모 심층 조사의 길을 열 수 있습니다.
행동 양식
동물 연구
동물 연구는 기관 동물 관리 및 위원회(Institutional Animal Care and Committee)의 승인을 받았으며, 미국 농무부 규정과 국립 보건원(National Institutes of Health)의 인간 관리 및 실험 동물 사용 가이드를 준수합니다. 6주령 수컷 DB/DB 마우스와 대조군 db/m 한배 새끼는 NanjingUniversity Model Animal Research Center(Nanjing, China)에서 구입하여 Zhengzhou University의 중앙 동물 시설에 수용했습니다. 모든 생쥐에게 임의로 먹이를 주었고 8~10마리의 생쥐를 지정된 나이에 죽였습니다. 소변 및 혈액 표본은 표시된 시점에서 샘플링되었습니다. 살해 후, 추가 검사를 위해 신장을 수확했습니다. 소변 알부민 수준은 마우스 알부민 효소 결합 면역흡착 분석 정량 키트(Bethyl Laboratories, Montgomery, TX)를 사용하여 측정되었습니다. 소변 크레아티닌 수준은 크레아티닌 분석 키트(BioAssay Systems, Hayward, CA)를 사용하여 결정되었습니다.
세포 배양
계대 21과 25 사이의 조건부 불멸화 마우스 족세포를 앞서 설명한 대로 허용 조건에서 10% 소 태아 혈청이 보충된 Roswell Park Memorial Institute 1640 배지에서 배양했습니다. 그런 다음 5mM 포도당이 포함된 정상 환경/배양 배지, 포도당(25mM) 및 형질전환 성장 인자 b1(2ng/ml)으로 구성된 당뇨병 환경, 또는 20mM 만니톨을 포함하는 고삼투압 조절 배지에 48시간 동안 노출 시간. 뮤린 근위 세뇨관 상피 세포 및 마우스 사구체 간질 세포를 5% 소태아 혈청이 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지/F12에서 유지했습니다. 세포를 24시간 동안 5% 소태아 혈청을 함유하는 배지에서 70% 합류로 플레이팅한 다음, 또 다른 24시간 동안 혈청 기아를 겪은 후 5mM 포도당을 함유하는 정상 환경/배양 배지에 노출시켰다. 글루코스(25mM) 및 형질전환 성장 인자 b1(2ng/ml), 또는 5mM 글루코스 및 20mM 만니톨을 함유하는 고삼투압 조절 배지를 48시간 동안. 세포 생존력은 Trypan blue 배제에 의해 평가되었습니다. 표시된 시점에서 세포를 고정하거나 추가 조사를 위해 세포 용해물을 수집했습니다.
벡터의 일시적인 형질감염
빈 벡터 또는 GSK3b의 혈구응집소(HA)-태그된 구성적 활성(S9A) 돌연변이체(S9A-GSK3b-HA/pcDNA3)를 인코딩하는 벡터는 Gail VW Johnson(미국 앨라배마주 버밍엄) 박사가 제공했으며 배양된 족세포에 형질감염되었습니다. 이전에 설명한 대로 Lipofectamine 2000(Life Technologies, Carlsbad, CA)을 사용하여 mesangial 세포 및 tubular 상피 세포. 이후에 세포를 수집하고 웨스턴 블롯 분석 또는 기타 분석을 위해 준비했습니다.
RNAi
3마리의 마우스 GSK3b 특이적 간섭 RNA 이중체 풀(50-CUUGUCCUGUAGAACUUUCtt-30, 50-AUGAUCCAUUCCAAUACtt-30, 50-AUACCGCAGUCGGACUAUGtt-30) - 뮤린 GSK3b 유전자의 완전한 코딩 서열(GenBank 수탁 번호 BC060743.1)에 따라 설계 및 합성되었습니다. 또한 쥐, 쥐 또는 인간의 알려진 유전자 서열과 서열 유사성이 없는 스크램블된 작은 간섭 RNA 서열({12}}GCGAGUAGCGCUAGGAAGUtt-30)을 RNAi의 대조군으로 사용했습니다. 리포펙타민(Invitrogen, Carlsbad, CA) 매개 유전자 침묵의 효율성은 GSK3b에 대한 면역블롯 분석에 의해 평가되었습니다. GSK3b 단백질 발현의 만족스러운 억제는 RNAi 후 24시간 배양된 족세포, 간간세포 및 관상 상피 세포에서 관찰되었다. 그 다음, 세포를 추가 분석을 위해 처리하기 전에 위에서 언급한 바와 같이 정상 환경/배양 배지, 당뇨병 환경 또는 고삼투질 농도 조절 배지에 세포를 적용하였다.
임상 연구
이 연구의 임상 부분은 1975년 헬싱키 선언의 윤리 지침을 준수했으며 정저우대학교 제1부속병원 기관심사위원회의 승인을 받았습니다. 인간 연구 참가자는 이 연구를 위해 특별히 모집되지 않았습니다. 모든 임상 데이터는 후향적 차트 검토와 보관된 조직 섹션 또는 보관된 소변 표본의 검사에 의해 수집되었습니다. 과도하거나 폐기된 신장 생검 샘플과 분별된 소변 샘플은 정저우 대학 제1부속병원 신장연구소에 일상적으로 보관되어 있습니다. DN의 다양한 단계에 있는 환자의 보관된 미확인 포르말린 고정 파라핀 포매 신장 생검 조직이 검사를 위해 무작위로 선택되었습니다. 조직 형태학적 병변이 없는 추가 신장 표본은 혈관 이상 또는 착상 전 생검 조직으로 인해 이식을 위해 폐기된 신장에서 조달하고 정상 대조군으로 사용되었습니다. 후향적 코호트 연구를 위해 2010년부터 분류된 소변의 은행 샘플을 추적 관찰한 총 127명의 제2형 당뇨병 환자를 이 연구에 포함하기 위해 후향적으로 선별했습니다. 연구 대상 환자는 29세에서 80세 사이였으며 미국 당뇨병 협회 기준에 따라 제2형 당뇨병으로 진단되었습니다. 제외 기준에는 후속 조치에 대한 손실, 부적절한 정보,신장기능 장애, or overt proteinuria at baseline, or other superimposed kidney diseases such as acute kidney injury or glomerulopathies. Finally, 60 patients have enrolled in this study for further assessment. All patients had been followed up for >5 년. 일상적인 추적 조사 동안 성별, 연령, 동반 질환, 약물, 당뇨병 기간, 혈압, 혈당 수준, 혈청 크레아티닌 수준, 소변 검사 데이터, UAE 및 eGFR을 포함한 임상 매개변수와 인구 통계학적 데이터가 문서화되었습니다. 5년의 추적 조사 후 임상 결과는 신장 손상의 진행 유무로, eGFR이 $25% 감소하거나 다양한 임상 단계에 따라 알부민뇨의 중증도가 높아짐에 따라 알부민뇨가 진행되는 것으로 정의되었습니다. DN, 즉 정상단백뇨, 미세단백뇨, 거대단백뇨 또는 명백한 단백뇨입니다. 모든 환자는 서면 동의서를 제공했습니다.
신장 형태 평가 및 면역조직화학 분석
파라핀 포매 포르말린 고정 마우스 신장 조직 블록을 3-mm 섹션으로 절단했습니다. 일반 조직학의 경우 과요오드산-쉬프 염색을 위해 절편을 처리했습니다. GSK3b 및 p-GSK3b에 대한 면역조직화학적 염색은 이전에 설명한 대로 VECTASTAIN ABC 키트(Vector Laboratories, Burlingame, CA)를 사용하여 수행되었습니다. 음성 대조군으로서 1차 항체는 동일한 종의 비면역 혈청으로 대체되었습니다. 착색이 발생하지 않았습니다. 모든 섹션의 형태학적 특징은 신장 병리학자의 도움을 받아 맹검 방식으로 단일 관찰자가 평가했습니다.
면역형광 염색
배양된 세포 또는 동결된 cryostat 섹션을 고정하고 1차 항체로 염색한 다음 Alexa Fluor-conjugated 2차 항체(Invitrogen)를 적용했습니다. 음성 대조군으로서 1차 항체는 동일한 종의 면역 전 IgG로 대체되었습니다. 착색이 발생하지 않았습니다. 마지막으로 섹션을 406-디아미디노-2-페닐인돌 또는 요오드화프로피듐으로 대조염색하고 VECTASHIELD 장착 매체(Vector Laboratories)로 장착했습니다. FL 형광 현미경 검사법의 경우 모든 섹션을 동시에 분석하여 형광색소의 다양한 붕괴로 인한 아티팩트를 배제했습니다. Spot II 디지털 카메라(Olympus, Tokyo, Japan)가 장착된 Olympus FL 형광 현미경을 사용하여 섹션을 검사했습니다. 이중 색상 염색의 경우 염료 간섭을 피하기 위해 이미지를 순차적으로 획득했습니다. ImageJ 소프트웨어(National Institutes of Health, Bethesda, MD)는 이미지의 후처리(예: 스케일링, 병합 및 colocalization 분석)에 사용되었습니다.
컴퓨터 형태 측정
면역 조직 화학 염색의 이미지는 현미경(Olympus BX41, Olympus) 및 컴퓨터에 부착된 고해상도 전하 결합 장치 디지털 카메라로 구성된 컴퓨터 이미지 분석 시스템을 사용하여 캡처하고 디지털화했습니다. 이미지는 1{5}}24,768픽셀(공간 해상도, 0.24mm/픽셀)의 픽셀 해상도로 표시되었습니다. 인간 신장 조직의 면역조직화학 염색 이미지의 경우 ImageJ 소프트웨어를 이미지 분할, 임계값 설정 및 신호 강도 측정에 사용했습니다. 필요에 따라 수동 수정을 수행했습니다. 전체적으로 형태측정 분석을 위해 10개의 사구체 또는 10개의 무작위 세뇨관 간질 필드를 샘플링하고 최종 데이터는 대조군에 대한 통합 픽셀 밀도 값으로 표현했습니다.
웨스턴 면역블롯 분석
배양된 세포를 용해시켰다;신장조직또는 분리된 신장 사구체를 프로테아제 억제제가 보충된 방사성면역침전 분석 완충액에서 균질화하고, 샘플을 면역블롯 분석을 위해 처리하였다. 소변에서 박리된 세포의 제한된 수에 대한 면역블롯 분석을 위해, 웨스턴 블롯 프로토콜은 고성능 NuPAGE Bis-Tris Gel(Invitrogen)과 고품질 전달 막을 사용하여 이전에 설명한 대로 수정되었습니다.25 정제된 면역블롯팅은 1000개 정도의 세포에서 적당히 발현된 단백질을 검출합니다. GSK3b, 피브로넥틴, 콜라겐 IV, 액틴 및 글리세르알데히드{6}}인산 탈수소효소(GAPDH)에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)에서 구입했습니다. 시냅토포딘에 대한 것들은 PROGEN Biotechnik GmbH(Heidelberg, Germany)에서 구입했습니다. ZO{7}} 및 p-GSK3b에 대한 항체는 Cell Signaling Technology(Danvers, MA)에서 입수했습니다.
통계 분석
All in vitro studies were repeated 3 to 6 times. For immunoblot analysis, bands were scanned and the integrated pixel density was determined using a densitometer and the ImageJ analysis program, version 1.48 (National Institutes of Health). Data were expressed as mean -SD or median (interquartile range). All included patients had baseline data. Patients with missing data or lost to follow-up were excluded from this study. Continuous variables were analyzed as appropriate by using the t-test, Mann-Whitney U test, or 1-way analysis of variance (ANOVA) followed by the Student-NewmanKeuls test if there were 3 comparisons or by the Scheffé test if there were >3 비교. 범주형 데이터는 카이-제곱 검정을 사용하여 그룹 간에 비교되었습니다. 선형 회귀 분석을 적용하여 두 매개변수 간의 가능한 관계를 조사했습니다. 단변량 Cox 비례 위험 회귀 분석을 수행하여 관련 변수와 신장 손상 진행 위험 간의 연관성을 평가한 후 잠재적 교란 요인에 대한 다변량 분석을 수행했습니다. ROC 곡선 분석을 수행하고 ROC 곡선 아래의 면적을 측정하여 당뇨병 환자에서 신장 손상의 진행을 예측하는 특정 변수의 힘을 분석했습니다. UAE와 같은 비정규 분포 변수는 Cox 비율 위험 회귀 분석 ROC 곡선 분석에 대한 정규성을 달성하기 위해 로그로 변환되었습니다. 모든 통계 분석은 PSS 버전 22(IBM Corporation, Armonk, NY)를 사용하여 수행되었습니다. P 값<0.05 in2-tailed="" tests="" were="" considered="" statistically="" significant="" in="" all="">
폭로
모든 저자는 경쟁 이익을 선언하지 않았습니다.
감사의 말
이 연구의 일부는 2016년 11월 15-20일 일리노이주 시카고에서 열린 KidneyWeek 2016: American Society of Nephrology Annual Meeting에서 구두 발표로 발표되었습니다. RG는 부분적으로 건강 재단의 지원을 받았습니다. XL은 연구 펠로우십의 지원을 받아 교외 교육을 받았습니다. ZL은 중국 국립 자연과학 재단(National NaturalScience Foundation of China) 보조금 U1604284, 81770672 및 81873612의 지원을 받았습니다. 자금 제공자는 이 연구의 설계 및 수행, 데이터 수집 및 해석, 원고 준비 및 승인에 아무런 역할도 하지 않았습니다.
저자 기여
RG는 개념적 아이디어를 고안했습니다. XL, ZL 및 RG는 연구 설계에 기여했습니다. XL, PW, BC, YG, AYG, BF에서 세포배양 실험을 진행하였다. XL과 ZL은 동물 실험을 수행하고 당뇨병 환자로부터 데이터를 수집했습니다. XL, LJW, DKM, LDD, ZL, 그리고 결과의 토론과 해석에 기여했습니다. 원고 작성에 앞장섰다. XL, BC, BF는 원고 편집에 기여했습니다. 모든 저자는 이 작업의 전체 개념과 소유권이 RG에 속한다는 데 동의했습니다. 모든 저자가 최종 원고를 승인했습니다.
보충 자료
보충 방법.
표 S1. 당뇨병성 신병증의 조직학적 분류에 따라 계층화된 대조군 및 당뇨병성 신병증 환자의 특성. 표 S2. DKD 징후가 없는 초기 당뇨병 환자의 후향적 코호트에 대한 기본 인구 통계학적, 임상 및 실험실 데이터. 표 S3. 초기 2형 당뇨병 환자의 인구통계학적, 임상적, 실험실적 데이터는 5년간의 추적 관찰 후 신장 결과에 따라 계층화되었습니다. 그림 S1. GSK3b의 강화된 신장 활동은 다음의 발달과 중증도를 예측합니다.당뇨병 환자신장질병db/db 마우스에서. 수컷 db/db 및 db/m 마우스를 4주에서 13주령 사이에 추적 관찰했습니다. (A) 4주 및 7주령에 금식하지 않은 마우스에서 혈액을 샘플링하고 혈장 포도당 수준을 분석했습니다. *P < 0.{15}}01마리와="" 7주령의="" db/m="" 마우스="" 비교.="" n="15-18." (b)="" 4주,="" 7주,="" 10주="" 및="" 13주령에="" 부분="" 소변을="" 샘플링하고="" 소변="" 알부민="" 대="" 크레아티닌="" 비율(uacr)을="" 결정하기="" 위해="" 소변="" 알부민="" 및="" 소변="" 크레아티닌="" 분석을="" 실시했습니다.="" *p="">< 0.001="" 대="" db/m="" 생쥐="" 10주령(n="15-18);" #p="">< 0.001="" 대="" 13주령의="" db/m="" 마우스.="" n="15-18." (c)="" 모든="" 마우스는="" 7주령에="" 개방="" 신장="" 생검을="" 받았고="" p-gsk3b,="" gsk3b="" 및="" gapdh에="" 대한="" 면역블롯="" 분석을="" 위해="" 생검="" 표본을="" 처리했습니다.="" (d)="" 면역블롯은="" 농도계="" 분석을="" 받았다.="" gsk3b="" 및="" p-gsk3b의="" 상대적="" 존재비는="" 대조군="" db/m="" 마우스와="" 비교하여="" 배수="" 변화로서="" 각="" 분자/gapdh의="" 밀도계="" 비율로="" 결정되었습니다.="" gsk3b의="" 상대="" 활성은="" 대조군="" db/m="" 마우스의="" 배수로서="" gsk3b에="" 대한="" p="" gsk3b의="" 비율로="" 계산되었습니다.="" (e)="" 선형="" 회귀="" 분석은="" db/db="" 마우스에서="" 7주령의="" 신장="" gsk3b="">당뇨병 환자신장질병13주령에. R=0.699; P ¼ 0.{16}}{{20}}1. (F) 수용체 작동 특성 곡선 분석은 당뇨병의 초기 단계(7주령)에서의 신장 GSK3b 활성이 db/db 마우스에서 13주령의 알부민뇨 및 DKD의 발달을 예측하는 데 탁월한 정확도와 능력을 제공함을 입증했습니다. 그림 S2. 인슐린 저항성과 높은 주변 포도당은 신장 세포에서 GSK3b를 상승적으로 활성화합니다. (A) 배양된 쥐 족세포, (B) 소변 사구체 간질 세포(MMC), 및 (C) 신세뇨관 상피 세포(TEC)는 인슐린 수용체(IRB)를 사용하여 시험관 내 인슐린 저항성 상태를 모델링합니다. 그런 다음 세포를 정상 포도당 함유 정상 환경(NG) 또는 고 포도당 함유 당뇨병 환경(HG)에 48시간 동안 노출시켰다. 세포 용해물을 수집하고 IRB, p-GSK3b, GSK3b 및 GAPDH에 대한 면역블롯 분석을 수행한 후 블롯의 농도계 분석을 수행했습니다. *P < 0.01="" 대="" 동일한="" 환경에="" 노출된="" sicon="" 처리="" 세포의="" irb="" 발현(n="3)," #p="">< 0.05="" 대="" siirb="" -="" ng="" 또는="" sicon="" -="" hg="" 그룹(n="3)의" 동일한="" 단백질="" 발현,="" &p="">< 0.05="" 대="" 두="" 번째="" þ="" hg="" 또는="" siirb="" þ="" ng="" 그룹에서="" 동일한="" 단백질="" 발현(n="3)." 그림="" s3.="" 건강한="" 기증자와="" 당뇨병성="" 신병증="" 환자로부터="" 입수한="" 인간="" 신장="" 표본에서="" gsk3b="" mrna의="" 발현="" 수준.="" 데이터는="" ju="" ckd="" glom="" 데이터="" 세트51를="" 기반으로="" www.nephroseq.org에서="" 파생되었으며="" log2="" 중앙값="" 중심="" 강도로="" 표시되었습니다.="" 그림="" s4.="" 초기="" 당뇨병="" 환자로부터="" 수집된="" 요="" 박리="" 세포에서="" gsk3b의="" 향상된="" 활성은="" 당뇨병성="" 신장="" 질환의="" 발병을="" 예측합니다.="" (a,="" b)="" 초기="" 당뇨병="" 환자(pts)="" 및="" 건강한="" 대조군(ctrls)으로부터="" 수집된="" 요로="" 박리="" 세포에서="" gsk3b="" 및="" 활성화된="" gsk3b의="" 검출.="" 요로="" 박리된="" 세포를="" 수집하고="" 용해하였다.="" gsk3b,="" p-gsk3b="" 및="" gapdh에="" 대한="" 면역블롯="" 분석을="" 위해="" 세포="" 용해물을="" 처리했습니다.="" (c)="" 면역블롯은="" 농도계="" 분석을="" 받았다.="" gsk3b="" 및="" p-gsk3b의="" 상대적="" 존재비는="" 대조군(ctrls)과="" 비교하여="" 배수="" 변화로서="" 각="" 분자/gapdh의="" 밀도계="" 비율로="" 결정되었습니다.="" gsk3b의="" 상대적="" 활성은="" 정상="" 대조군(ctrls)의="" 배수로서="" gsk3b에="" 대한="" p-gsk3b의="" 비율로="" 계산되었습니다.="" (d)="" 수용체="" 작동="" 특성="" 곡선="" 분석은="" 초기="" 당뇨병="" 환자로부터="" 수집된="" 요="" 박리="" 세포에서="" 상대적="" gsk3b="" 활성(p-gsk3b/gsk3b="" 비율)이="" 당뇨병="" 발병을="" 예측하는="" 데="" 탁월한="" 정확도를="" 제공함을="">당뇨병성 신장 질환5년 후 곡선 아래 면적(AUC)은 0.886입니다.
참조
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